ỨNG DỤNG CỦA SỰ TẠO DÒNG VECTOR TRONG y HỌC

ỨNG DỤNG CỦA SỰ TẠO DÒNG VECTOR TRONG Y HỌC A Insulin Sơ lược bệnh tiểu đường - Tiểu đường dạng bệnh rối loạn chuyển hóa CacbonHydrat hormone insulin tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động thể, biểu mức đường máu ln cao • Bệnh tiểu đường loại (do tụy khơng tiết insulin) - Có thể bệnh chính: • Bệnh tiểu đường loại (do tiết giảm insulin đề kháng insulin) - Biểu hiện: giai đoạn phát sinh, người bệnh tiểu nhiều, tiểu vào ban đêm kèm theo chứng khô miệng, khát nước - Nguyên nhân phát sinh bệnh: insulin tiết bị thiếu không đủ, tế bào có tính mẫn cảm với insulin giảm thấp  sư rối loạn trình trao đổi đường, nước, chất béo chất điện giảm thể Sơ lược Insulin - Insulin hormone quan trọng, giúp thể hấp thu glucose – thành phần cung cấp lượng cho người * Cấu tạo Insulin người polypeptide • * Bao gồm: - Chuỗi A gồm 21 acid amin - Chuỗi B gồm 30 acid amin - Có cầu nối S-S (disulfur) chuỗi A cầu nối chuỗi A B • CTHH: C257H383N65O77S6 * Trọng lượng phân tử: 5800 – 6000 Dalton 3, CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN • Năm 1922, Fred Banting Charles Best thuộc ĐH tổng hợp Toronto (Canada) thông báo, họ tìm Insulin ứng dụng chất điều trị bệnh tiểu đường người  Quy trình sản xuất Insulin cơng nghệ DNA tái tổ hợp • Phương pháp 1: Tạo chuỗi riêng biệt, kết hợp hóa học tạo tiền chất chuỗi đơn proinsulin người, sau phân cắt để tạo thành insulin hoàn chỉnh o Bước 1: Chuẩn bị gen cần tách dòng Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng sinh học phân tử, tách gen mã hóa proinsulin người NST số 11 • Tách mRNA gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền người Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen, loại bỏ protein Do hầu hết mRNA người có polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với polyA • Sử dụng sắc kí lực với polyT giữ lại mRNA cần thiết cho q trình dịch mã, cịn lại loại bỏ DNA RNA khác • Cắt bỏ cầu nối A – T thu mRNA Tách mRNA gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tụy người o Bước 2: Tách thiết kế plasmit tái tổ hợp • Cắt gen mã hóa proinsulin plasmit loại enzyme giới hạn Nối DNA ligase phageT4 Trong thành phần vector biểu phải có promoter mạnh giúp gen biểu Vi khuẩn • Thiết kế trình tự mã hóa cho protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin ngồi tế bào chất  Nếu sử dụng mRNA tách từ bước tiến hành sau: • Sao mRNA tinh khiết thành DNA (cDNA) nhờ enzyme phiên mã ngược nhờ dNTP (trong phản ứng RT – PCR) • Cài đoạn mRNA mã hóa insulin hồn chỉnh vào plasmit đứng sau promoter mạnh Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli o Bước 7: Hoạt hóa • Hệ thống E.coli có khả biểu gen insulin khơng có khả hoạt hóa insulin • Hoạt hóa proinsulin invitro cách xử lí dung dịch đệm, giúp đạt cấu trúc bậc 4, sau dùng enzyme đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin Khi đó, sản phẩm thu có hoạt tính cần thiết  Phản ứng xoắn cuộn + 50mM glycine buffer tinh (50µM, 0.375 mg/l) + – mercaptoethanol (bằng lượng mini proinsulin) + H3PO4 đến pH 2.5 So sánh peak với mini proinsulin xoắn cuộn với insulin   Mini proinsulin Phản ứng cuộn xoắn (18h, 4)  Dừng phản ứng Tinh (Reverse-phase HPLC) o Bước 8: Hỗn hợp tinh cịn có insulin • Bằng phương pháp sắc ký, tách phương pháp miễn dịch gắn enzyme • Độ tinh insulin đánh giá qua giai đoạn trung gian q trình sản xuất nhờ phịng thí nghiệm chun hóa Cuối cùng, insulin tinh thể hóa Các tinh thể insulin • Phương pháp 2: Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A B • Phương pháp tránh việc sản xuất enzyme đặc hiệu cần thiết để biến proinsulin thành insulin • Nhà sản xuất cần hai gen nhỏ để sản xuất hai chuỗi A B Xác định trình tự DNA để qua tổng hợp tách hai dịng gen • Mỗi DNA chèn vào plasmid Sau sản xuất tương tự sản xuất proinsulin • Cuối hai chuỗi A B trộn với hình thành cầu nối disulfua qua phản ứng tái oxi hóa khử nhờ chất oxi hóa định Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A chuỗi B riêng biệt Tổng hợp riêng lẽ hai chuỗi A B Sản xuất vaccine kỹ thuật ADN tái tổ hợp Vaccine gì? • Vacinne chế phẩm có tính kháng nguyên, có nguồn gốc từ vi sinh vật gây bệnh vi sinh vật có cấu trúc kháng nguyến giống vi sinh vật gây bệnh, bào chế đảm bảo độ an toàn cần thiết, làm cho thể tự tạo tình trạng miễn dịch chống lại tác nhân gây bệnh • Vaccine chứa phiên suy yếu virus (kháng nguyên) Điều chứng tỏ kháng nguyên tạo dấu hiệu triệu chứng bejenhq, chúng kích thích hệ thống miễn dịch tạo kháng thể Những kháng thể bảo vệ thể tiếp xúc với virus tương lai DNA Vaccine - Là plasmid kỹ thuật chưa gen mã hóa cho protein kháng nguyên đặc trưng vi sinh vật Cấu trúc bao gồm: • Một promotor • Một trình tự cloning site cho gene quan tâm • Một Poly A có vai trị trình tự kết thúc • Một điểm Ori cho khởi đầu chép • Một gene thị gene kháng sinh Quy trình sản xuất vaccine tái tổ hợp ( ví dụ: vaccine cúm) • B1: Thu nhận mẫu bệnh thơng tin tình hình dịch tễ bệnh cúm • B2: Chẩn đốn, phân lập virus phân tích sơ • B3: Sản xuẩ kháng huyết chồn sương • B4: Phân tích đặc điểm di truyền kháng nguyên • B5: Đánh giá chọn lựa virus ứng cử làm vaccine • B6: Sự tái tổ hợp virus cúm kỹ thuật di truyền ngược • Kỹ thuật cho phép gene (mã hóa cho protein NP, PA, PB1, PB2, M, NS) virus cúm A/Puerto Rico/8/34 (thường gọi PR8) kết hợp với gene mã hóa cho protein HA NA (của chủng khuyến cáo làm vaccine) làm giảm độc lực tạo chủng virus mang đặc điểm kháng nguyên HA NA giống với chủng khuyến cáo làm vaccine phát triển trứng nhanh kịp thời cung cấp vaccine có dịch xảy • B7: Xác định đặc điểm kháng nguyên di truyền chủng tái hợp • B8: Đánh giá đặc tính phát triển virus tái tổ hợp • B8: Chuẩn bị hóa chất cho vaccine bất hoạt Ý nghĩa việc sản xuất cơng nghệ tái tổ hợp gene • Nâng cao xuất sản xuất vaccine • Tạo sản phẩm vaccine với nhiều ưu điểm:  Vaccine tái tổ hợp gene an tồn vaccine khơng có tồn mầm bệnh  Khơng cần bảo quản lạnh nên giảm chi phí  phù hợp với điều kiện sử dụng nước phát triển THANK YOU • Thành viên nhóm: 1, Nguyễn Thị Thùy Lương 2, Nguyễn Đức Bảo Trân 3, Nguyễn Vũ Thục Nguyên 4, Nguyễn Thị Mỹ Hạnh ... với điều kiện sử dụng nước phát triển THANK YOU • Thành viên nhóm: 1, Nguyễn Thị Th? ?y Lương 2, Nguyễn Đức Bảo Trân 3, Nguyễn Vũ Thục Nguyên 4, Nguyễn Thị Mỹ Hạnh ... đường dạng bệnh rối loạn chuyển hóa CacbonHydrat hormone insulin tuyến t? ?y bị thiếu hay giảm tác động thể, biểu mức đường máu ln cao • Bệnh tiểu đường loại (do t? ?y khơng tiết insulin) - Có thể... proinsulin từ mẫu nghiền t? ?y người o Bước 2: Tách thiết kế plasmit tái tổ hợp • Cắt gen mã hóa proinsulin plasmit loại enzyme giới hạn Nối DNA ligase phageT4 Trong thành phần vector biểu phải có promoter