DỰ THẢO PHÁT HIỆN CANDIDA ALBICANS TRONG MỸ PHẨM

TCVN T I ÊU C H U ẨN Q U Ố C G I A TC VN DỰ THẢO PHÁT HIỆN CANDIDA ALBICANS TRONG MỸ PHẨM D Ự TH ẢO Cosmetics – Microbiology – Detection of Candida albicans THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – TCVN ….:05… Lời nói đầu TCVN 05 xây dựng sở ISO 18416:2015 – Cosmetics – Microbiology – Detection of Candida albicans TCVN 05 Viện Kiểm nghiệm Thuốc Tp Hồ Chí Minh biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công D Ự TH ẢO TC VN nghệ công bố TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN Phát Candida albicans mỹ phẩm Cosmetic – Microbiology – Detection of Candida albicans Phạm vi áp dụng TC VN Tiêu chuẩn quốc tế đưa hướng dẫn chung để phát định danh Candida albicans sản phẩm mỹ phẩm Các vi sinh vật coi gây bệnh theo tiêu chuẩn khác với quy định riêng quốc gia Để đảm bảo chất lượng độ an toàn cho người tiêu dùng, thực phương pháp phân tích rủi ro vi sinh vật phù hợp để xác định loại sản phẩm mỹ phẩm áp dụng phương pháp theo TCVN TH ẢO Các sản phẩm coi có nguy nhiễm vi sinh vật (xem ISO 29621) bao gồm sản phẩm có hoạt độ nước thấp, sản phẩm chứa cồn, sản phẩm có giá trị pH cực đoan, … Phương pháp mô tả tiêu chuẩn dựa việc phát Candida albicans môi trường lỏng không chọn lọc (môi trường tăng sinh), tiếp phân lập mơi trường thạch chọn lọc Các phương pháp khác thích hợp phụ thuộc vào giới hạn phát Ự Chú thích: Đối với việc phát Candida albicans, cấy truyền môi trường nuôi cấy không D chọn lọc, sau thực bước định danh thích hợp (ví dụ sử dụng Kit định danh) Do đa dạng sản phẩm mỹ phẩm nên phạm vi áp phẩm không thấm nước) Các tiêu chuẩn khác (ISO 18415) phù hợp Các phương pháp khác dụng này, phương pháp khơng phù hợp cho số sản phẩm đặc biệt (ví dụ phương pháp định danh tự động) chứng minh tương đương tính phù hợp thay cho thử nghiệm trình bày tiêu chuẩn Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) ISO 21148:2017 – Cosmetics – Microbiology – General instructions for microbiological examination TCVN 05 EN 12353, Chất khử trùng hoá học chất tiệt khuẩn– Bảo quản sinh vật thử nghiệm sử dụng để xác định hoạt tính diệt khuẩn (kể Legionella), vi khuẩn nội bào, bào tử, nấm virút (kể bacteriophages) Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau: 3.1 Sản phẩm Một phần sản phẩm mỹ phẩm xác định mà phịng thí nghiệm nhận để sử dụng cho mục đích thử nghiệm 3.2 Mẫu 3.3 Hỗn dịch mẫu ban đầu TC VN Là phần sản phẩm (ít g mL) dùng để chuẩn bị hỗn dịch ban đầu Hỗn dịch hay dung dịch mẫu thử thể tích định mơi trường tăng sinh lỏng phù hợp 3.4 Mẫu pha loãng 3.5 Vi sinh vật gây bệnh TH ẢO Mẫu pha loãng từ hỗn dịch mẫu ban đầu Vi khuẩn ưa nhiệt hiếu khí nấm men khơng có sản phẩm mỹ phẩm công nhận lồi gây bệnh da gây hại cho sức khoẻ người loài vi sinh điểm cho việc không đảm bảo vệ sinh trình sản xuất Candida albicans Ự 3.6 D Nấm men tạo thành khuẩn lạc lồi, mịn, màu trắng đến màu be bề mặt môi trường chọn lọc Chú thích 1: Đặc điểm để định danh việc tạo mầm giá đậu / pseudomycellum (giả sợi nấm) chlamydospore (bào tử vách dày) thử nghiệm thực theo phương pháp đề cập tiêu chuẩn 3.7 Môi trường tăng sinh lỏng Môi trường lỏng không chọn lọc chứa chất trung hịa / chất phân tán thích hợp chứng minh phù hợp cho thử nghiệm Nguyên tắc Bước quy trình làm tăng số lượng vi sinh vật môi trường lỏng không chọn lọc đảm bảo vi sinh vật không bị ức chế tác nhân chọn lọc có mơi trường chọn lọc / phân biệt TCVN 05 Bước thứ hai thử nghiệm (phân lập) thực môi trường chọn lọc sau thử nghiệm định danh Phải trung hịa khả ức chế phát triển vi sinh vật mẫu thử phép phát vi sinh vật sống Trong trường hợp phương pháp nào, phải kiểm tra chứng minh trung hịa đặc tính kháng khuẩn sản phẩm (xem mục 11) Dung dịch pha loãng môi trường nuôi cấy 5.1 Quy định chung Quy định chung đề cập ISO 21148 (TCVN…) Nước đề cập tiêu chuẩn nước cất nước tinh khiết đề cập ISO 21148 (TCVN…) Môi trường tăng sinh lỏng sử dụng để phân tán mẫu thử tăng số lượng vi sinh vật ban đầu TC VN Mơi trường có chứa chất trung hịa mẫu kiểm tra có chứa chất kháng khuẩn Hiệu lực chất trung hòa cần chứng minh (xem bảng 11) Thơng tin chất trung hịa phù hợp đưa Phụ lục B Theo tiêu chuẩn này, môi trường tăng sinh lỏng (xem mục 5.3.3.1) hay mơi trường liệt kê phụ lục A phù hợp để kiểm tra có mặt C albicans Những mơi trường TH ẢO chứng minh phù hợp theo mục 11 Những dung dịch pha lỗng mơi trường ni cấy khác sử dụng chứng minh phù hợp 5.2 Dung dịch pha loãng cho hỗn dịch nấm men (dung dịch trypton natri clorid) Quy định chung Ự 5.2.1 Dung dịch pha loãng sử dụng để chuẩn bị hỗn dịch nấm men dùng cho kiểm tra D tính phù hợp quy trình thử nghiệm (xem mục 11) 5.2.2 Thành phần Tryptone, casein thủy phân pancreatin 1,0 g Natri clorid 8,5 g Nước 5.2.3 1000 mL Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 oC 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 7,0 ± 0,2 đo nhiệt độ phòng TCVN 05 5.3 Môi trường nuôi cấy 5.3.1 Quy định chung Môi trường nuôi cấy chuẩn bị theo mô tả từ môi trường khô theo hướng dẫn nhà sản xuất Cần tuân thủ hướng dẫn từ nhà sản xuất mơi trường Chú thích: Mơi trường pha sẵn sử dụng thành phần / khả dinh dưỡng chúng tương đương với công thức đưa tài liệu 5.3.2 Môi trường thạch để kiểm tra tính phù hợp (xem Mục 11) 5.3.2.1 Thạch Sabouraud dextrose (SDA) 5.3.2.1.1 Thành phần 40,0 g Pepton từ mô động vật TC VN Dextrose 5,0 g Casein thủy phân pancreatin Thạch 5,0 g 15,0 g Nước TH ẢO 1000 mL 5.3.2.1.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần riêng rẽ mơi trường mơi trường khơ hồn chỉnh nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 đo nhiệt Các môi trường ni cấy khác để kiểm tra tính phù hợp D 5.3.3 Ự độ phịng Có thể sử dụng mơi trường ni cấy khác để kiểm tra tính phù hợp (xem Phụ lục A) 5.3.4 Môi trường tăng sinh lỏng 5.3.4.1 Eugon LT 100 Mơi trường có chứa thành phần trung hịa chất ức chế có mẫu: lecithin, polysorbate 80 tác nhân phân tán octoxynol 5.3.4.1.1 Thành phần Casein thủy phân pancreatin 15,0 g Bột đậu nành thủy phân papain 5,0 g L-cystein 0,7 g TCVN 05 Natri clorid 4,0 g Natri sulfit 0,2 g Glucose 5,5 g Lecithin 1,0 g Polysorbate 80 5,0 g Octoxynol 1,0 g Nước 1000 mL 5.3.4.1.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần polysorbate 80, octoxynol lecithin nước nóng để hịa tan hồn TC VN tồn Hịa tan thành phần khác nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 7,0 ± 0,2 nhiệt độ phịng 5.3.4.2 Các mơi trường tăng sinh lỏng khác 5.3.5 TH ẢO Có thể sử dụng môi trường tăng sinh lỏng khác phù hợp (xem Phụ lục A) Môi trường chọn lọc để phân lập Candida albicans 5.3.5.1 Môi trường thạch Sabouraud dextrose chloramphenicol 5.3.5.1.1 Thành phần 40,0 g Ự Dextrose 5,0 g Casein thủy phân pancreatin 5,0 g D Pepton từ mô động vật Chloramphenicol 0,050 g Thạch 15,0 g Nước 1000 mL 5.3.5.1.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần (bao gồm chloramphenicol) mơi trường hồn chỉnh khơ nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp, hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 nhiệt độ phòng TCVN 05 5.3.5.2 Các mơi trường chọn lọc khác Có thể sử dụng môi trường tăng sinh lỏng khác phù hợp (xem Phụ lục A) 5.3.6 Môi trường thạch bột bắp bổ sung 1% polysorbat 80 5.3.6.1 Thành phần Dịch chiết từ bột bắp 50,0 g Thạch 15 g Polysorbate 80 10,0 g Nước 1000 mL 5.3.6.2 Chuẩn bị TC VN Hòa tan thành phần mơi trường khơ hồn chỉnh nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 6,0 ± 0,2 nhiệt độ phòng Dụng cụ Chủng vi sinh vật TH ẢO Sử dụng thiết bị phịng thí nghiệm dụng cụ theo mơ tả TCVN… (ISO 21148) Để xác nhận tính phù hợp điều kiện thử nghiệm, chủng nấm men sau sử dụng:Candida albicans ATCC(1) 10231 (tương đương với chủng IP(2) 48.72, NCPF(3) 3179 NBRC(4) 1594, Ự KCTC(5) 17205 chủng tương đương sưu tập chủng giống quốc gia khác) D Các chủng cần hoàn nguyên theo hướng dẫn nhà cung cấp Các chủng lưu giữ phịng thí nghiệm theo (EN 12353) ATCC = American Type Culture Collection = Bộ sưu tập chủng chuẩn Mỹ IP = Bộ sưu tập Viện Pasteur, Pháp NCPF = National Collection of Pathogenic Fungi = Bộ sưu tập nấm gây bệnh quốc gia, Anh Quốc NBRC = National Biological Resource Center = Trung tâm tài nguyên sinh vật quốc gia, Nhật Bản KCTC = Korean Collection for Type Culture = Bộ sưu tập chủng chuẩn Hàn Quốc Xử lý sản phẩm mỹ phẩm mẫu thử Giữ sản phẩm thử nghiệm nhiệt độ phòng, cần Không ủ, làm lạnh cấp đông sản phẩm mẫu thử nghiệm trước sau phân tích TCVN 05 Q trình lấy mẫu thử nghiệm từ sản phẩm mỹ phẩm để phân tích cần tiến hành mô tả ISO 21148 Phân tích mẫu mơ tả ISO 21148 theo quy trình đưa mục D Ự TH ẢO TC VN TCVN 05 Cách tiến hành 9.1 Quy định chung Sử dụng vật liệu vô trùng, thiết bị kỹ thuật vô trùng để chuẩn bị mẫu thử nghiệm, pha hỗn dịch mẫu ban đầu mẫu pha loãng Khi chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu, sử dụng dung dịch pha loãng hợp lý, khoảng thời gian từ lúc hoàn tất việc chuẩn bị đến lúc hỗn dịch mẫu ban đầu / mẫu pha lỗng bắt đầu tiếp xúc với mơi trường tăng sinh khơng nên q 45 phút, trừ có u cầu đặc biệt khác quy trình tài liệu thiết lập 9.2 9.2.1 Chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu môi trường tăng sinh lỏng Quy định chung Mẫu thử tăng sinh từ g mL sản phẩm (đã trộn đều) phân tán TC VN mL mơi trường tăng sinh lỏng Chú thích, S, khối lượng hay thể tích xác mẫu thử nghiệm Phương pháp thử nghiệm nên kiểm tra để thành phần (chất trung hòa thêm vào) thể tích mơi trường lỏng phù hợp cho thử nghiệm (xem mục 11.3) Chú thích, Trong số trường hợp, có thể, lọc sản phẩm mỹ phẩm qua màng lọc sau TH ẢO đó, màng lọc cấy vào môi trường tăng sinh lỏng nhằm tạo điều kiện thuận lợi việc trung hòa chất kháng khuẩn sản phẩm (xem mục 11.3) 9.2.2 Các sản phẩm phân tán nước Chuyển lượng mẫu, S, sản phẩm vào bình chứa lượng thích hợp mơi trường tăng Các sản phẩm không phân tán nước D 9.2.3 Ự sinh lỏng Chuyển lượng mẫu, S, sản phẩm vào bình chứa lượng thích hợp tác nhân phân tán (ví dụ polysorbate 80) Phân tán mẫu thử tác nhân phân tán thêm lượng thích hợp mơi trường tăng sinh lỏng 9.2.4 Các sản phẩm lọc Sử dụng màng lọc có kích thước lỗ lọc khơng q 0,45 µm Chuyển lượng mẫu, S, lên màng lọc lọc (ISO 21148) Lọc nhanh rửa màng lọc lượng nước / dung dịch pha loãng xác định Chuyển màng lọc nhúng ngập màng lọc vào ống bình có chứa lượng thích hợp mơi trường tăng sinh lỏng TCVN 05 9.3 Ủ dịch hỗn dịch ban đầu môi trường tăng sinh lỏng Ủ hỗn dịch mẫu ban đầu chuẩn bị môi trường lỏng (xem mục 9.2) 32,5 oC ± 2,5 oC 20 (tối đa 72 giờ) 9.4 9.4.1 Phát định danh Candida albicans Phân lập Sử dụng que cấy vơ trùng, lấy vịng que cấy dịch môi trường tăng sinh lỏng cấy lên bề mặt môi trường thạch Sabouraud dextrose chloramphenicol để thu khuẩn lạc riêng rẽ Lật ngược đĩa petri ủ 32,5 oC ± 2,5 oC 24 đến 48 Kiểm tra đặc điểm khuẩn lạc (xem Bảng 1) Môi trường chọn lọc Môi trường thạch Sabouraud dextrose cloramphenicol Định danh Candida albicans 9.4.2.1 Quy định chung Đặc điểm khuẩn lạc Candida albican Lồi, mịn, màu trắng tới trắng ngà TH ẢO 9.4.2 TC VN Bảng – Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Candida albicans mơi trường thạch chọn lọc Candida albicans xuất dạng dị hình lưỡng tính sản sinh dạng sợi giả, vài loại sản sinh dạng sợi thật Candida albicans nảy chồi tạo cụm bào tử tròn mà tạo bào tử vách dày Khi nhiệt độ mơi trường thấp, hình thành hệ sợi giả, nhiên Ự chuyển thành dạng đơn bào nhiệt độ cao Tiến hành thử ngiệm sau khuẩn lạc nghi ngờ phân lập môi trường D thạch Sabouraud dextrose cloramphenicol Sự diện Candida albicans khẳng định mơi trường phản ứng sinh hóa thích hợp khác 9.4.2.2 Nhuộm Gram Phép thử mô tả (xem ISO 21148) Quan sát kính hiển vi tế bào nấm có màu tím, hình trứng ngắn, có số tế bào nảy chồi 9.4.2.3 Sự hinh thành mầm giá đậu (germ tube) Hút 0,5 mL đến mL huyết phôi bê huyết ngựa cho vào ống nghiệm nhỏ Tán lượng nhỏ tế bào nấm men nghi ngờ vào huyết Ủ bể ổn nhiệt 37 oC ± oC 1,5 đến ủ tủ ấm 37 oC ± oC TCVN 05 Nhỏ giọt huyết tương sau ủ lên lam kính kiểm tra hình thành mầm giá đậu Mầm giá đậu xuất dạng sợi nhỏ hình thành từ bào tử nảy chồi, khơng có điểm thắt eo điểm bắt đầu không thấy vị trí phồng lên dọc theo sợi mầm Sự hình thành mầm giá đậu đặc điểm chứng tỏ có mặt Candida albicans Nếu khơng hình thành mầm giá đậu, khuẩn lạc nghi ngờ cần kiểm tra hình thành sợi nấm, sợi nấm giả bào tử vách dày theo mục 9.4.2.4 9.4.2.4 Nuôi cấy môi trường thạch bột bắp bổ sung 1% polysorbate 80 Lấy phần nhỏ khuẩn lạc nấm men que cấy vịng ria lên bề mặt mơi trường thạch Đặt kính mỏng (la men) vơ trùng lên bề mặt vết cấy Ủ 32,5 oC ± 2,5 oC tới ngày TC VN Sau 24 giờ, kiểm tra phát triển tế bào nấm cách đặt la men kính hiển vi Áp thị kính vào la men quan sát độ phóng đại 100 đến 400 lần Candida albicans có bào tử vách dày điểm cuối gần cuối nhánh 10 Báo cáo kết (phát Candida albicans) - TH ẢO Nếu kết định danh xác định có mặt lồi nấm men kết ghi sau: Phát Candida albicans mẫu thử Nếu khơng thấy có phát triển mơi trường tăng sinh / kết định danh khuẩn lạc khơng xác định có mặt lồi nấm men kết ghi sau: Không phát Candida albicans mẫu thử Ự - D 11 Trung hịa chất kháng khuẩn có sản phẩm 11.1 Quy định chung Các phép thử khác mô tả dùng để chứng minh chủng vi sinh vật phát triển điều kiện thử nghiệm 11.2 Chuẩn bị chủng cấy Trước tiến hành thử nghiệm, cấy chủng Candida albicans lên bề mặt thạch casein đậu tương (SCDA) mơi trường thích hợp khác (mơi trường khơng chọn lọc, khơng chứa chất trung hịa) Ủ 32,5 oC ± 2,5 oC 18 đến 24 Để thu hoạch vi sinh vật nuôi cấy, sử dụng que cấy vịng vơ trùng, lấy vệt khuẩn lạc bề mặt môi trường trộn lại dung dịch pha loãng để hỗn dịch chủng điều chỉnh hỗn dịch TCVN 05 để thu hỗn dịch chứa khoảng x 108 CFU/mL (có thể sử dụng máy đo quang phổ để xác định nồng độ tương đối (ISO 21148:2017), Phụ lục C) Sử dụng hỗn dịch chủng hỗn dịch chủng pha lỗng từ vịng 11.3 Tính phù hợp phương pháp phát 11.3.1 Cách tiến hành 11.3.1.1 Pha loãng hỗn dịch chủng ban đầu ống nghiệm chứa mL dung dịch pha loãng để nồng độ chủng cuối chứa khoảng 100 - 500 CFU/mL Để đếm nồng độ cuối vi sinh vật sống lại dung dịch pha loãng, chuyển mL hỗn dịch chủng vào đĩa Petri đổ 15 - 20 mL môi trường thạch tan chảy giữ ấm bể điều nhiệt nhiệt độ không 48 oC Ủ đĩa 32,5 oC ± 2,5 oC 20 đến 24 TC VN 11.3.1.2 Chuẩn bị hai ống hai bình hỗn dịch mẫu ban đầu theo điều kiện lựa chọn cho thử nghiệm (chứa g mL sản phẩm thể tích xác định mơi trường tăng sinh lỏng) Khi sử dụng phương pháp màng lọc, lọc mL sản phẩm từ ống/ bình chuyển màng lọc vào ống nghiệm bình chứa môi trường tăng sinh lỏng điều kiện lựa chọn cho thử nghiệm TH ẢO 11.3.1.3 Chuyển 0,1 mL hỗn dịch chủng pha loãng từ hỗn dịch chủng ban đầu biết số lượng vi sinh vật (xem mục 11.3.1.1) vào ống nghiệm bình (thử nghiệm tính phù hợp) Trộn đều, sau ủ ống nghiệm / bình (thử nghiệm tính phù hợp mẫu đối chứng không chứa vi sinh vật) 32,5 oC ± 2,5 oC 20 đến 24 11.3.1.4 Phân lập vi sinh vật từ ống nghiệm / bình (trong thử nghiệm tính phù hợp mẫu đối Ự chứng không chứa vi sinh vật) Sử dụng que cấy vịng vơ khuẩn lấy vịng hỗn dịch ủ cấy lên bề mặt đĩa Petri (đường kính 85 - 100 mm) chứa khoảng 15 mL - 20 mL môi trường thạch D Sabouraud dextrose cloramphenicol Ủ đĩa 32,5 oC ± 2,5 oC 24 đến 48 11.3.2 Giải thích kết thử nghiệm tính phù hợp Kiểm tra số lượng vi sinh vật hỗn dịch chủng sau pha loãng (xem mục 11.3.1.1) phải chứa từ 100 500 CFU/mL Nếu Candida albicans phát triển đặc trưng đĩa kiểm tra khơng có phát triển đĩa đối chứng phương pháp trung hịa có hiệu và phương pháp phát phù hợp Khi đĩa đối chứng có vi sinh vật phát triển (sản phẩm tạp nhiễm), phương pháp trung hịa có hiệu và phương pháp phát phù hợp Candida albicans phục hồi đĩa kiểm tra tính phù hợp Khi không thấy phát triển vi sinh vật đĩa kiểm tra tính phù hợp chứng tỏ hoạt tính kháng khuẩn cịn cần phải điều chỉnh điều kiện phương pháp việc tăng thể tích TCVN 05 mơi trường dinh dưỡng lỏng mà giữ nguyên lượng mẫu, cách kết hợp lượng đủ tác nhân khử hoạt tính môi trường tăng sinh lỏng kết hợp biện pháp điều chỉnh để Candida albicans phát triển Mặc dù có kết hợp tác nhân khử hoạt tính thích hợp gia tăng đáng kể thể tích mơi trưởng lỏng vi sinh vật không sống lại mô tả kết luận mẫu thử khơng nhiễm Candida albicans 12 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm ghi rõ thông tin sau: a) Tham chiếu Tiêu chuẩn Quốc tế này, tức ISO 18416:2015 (TCVN…); c) Phương pháp sử dụng; d) Các kết thu được; TC VN b) Tất thông tin cần thiết sản phẩm; e) Chi tiết bước tiến hành chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu; f) Mơ tả phương pháp với chất trung hịa môi trường sử dụng; Bất kỳ điểm không nêu tài liệu này, coi tùy chọn (không bắt buộc), Ự với chi tiết cố ảnh hưởng đến kết D h) TH ẢO g) Chứng minh tính phù hợp phương pháp, thử nghiệm thực riêng rẽ; TCVN 05 Phụ lục A (Cung cấp thông tin) Các môi trường nuôi cấy khác A.1 Các môi trường tăng sinh lỏng khác A.1.1 Môi trường lỏng casein thủy phân từ đậu nành A.1.1.1 Thành phần Casein thủy phân pancreatin 17,0 g 3,0 g Natri clorid 5,0 g Kali hydrogen phosphate 2, g TC VN Bột đậu nành thủy phân papain Dextrose 2,5 g Nước A.1.1.2 1000 mL Chuẩn bị TH ẢO Hoà tan thành phần từ mơi trường khơ hồn chỉnh nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích chứa phù hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 7,3 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng A.1.2 Mơi trường letheen lỏng cải tiến Thành phần Pepton từ thịt Ự A.1.2.1 20,0 g 5,0 g Cao thịt bò 5,0 g D Casein thủy phân pancreatin Cao nấm men 2,0 g Lecithin 0,7 g Polysorbate 80 5,0 g Natri clorid 5,0 g Natri bisulfit 0,1 g Nước 1000 mL TCVN 05 A.1.2.2 Chuẩn bị Hịa tan hồn tồn polysorbate 80 lecithin nước sơi Hịa tan thành phần lại nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Trộn nhẹ nhàng tránh tạo bọt Phân phối vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn nhiệt độ 121 oC 15 phút Sau hấp làm nguội, pH phải đạt khoảng 7,2 ± 0,2 đo nhiệt độ phòng A.1.3 Môi trường lecithin - polysorbate 80 bổ sung Glucose peptone (GPLP 80 broth) A.1.3.1 Thành phần Glucose 20,0 g Cao nấm men 2,0 g Magnesium sulfate 0,5 g g 5,0 g Potassium hydrogen phosphate Lecithin 1,0 g 7,0 g Nước 1000 mL Chuẩn bị TH ẢO A.1.3.2 TC VN Peptone Hồ tan hồn tồn thành phần mơi trường khơ hồn chỉnh nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích phù hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 5,7 ± 0,2 đo nhiệt độ phòng A.1.4 Dung dịch trung hòa D / E (Dung dịch trung hòa Dey / Engley) lS.J Thành phần Ự A1.4.1 D Glucose 10,0 g Lecithin đậu nành 7,0 g Natri thiosulfate pentahydrate 6,0 g Polysorbate 80 5,0 g Casein thủy phân pancreatin 5,0 g Natri bisulfite 2,5 g Cao nấm men 2,5 g Natri thioglycolate 1,0 g Tím Bromocresol 0,02 g Nước 1000 mL TCVN 05 A.1.4.2 Chuẩn bị Hoà tan hoàn toàn thành phần mơi trường khơ hồn chỉnh nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích phù hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 7,6 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng A.1.5 Mơi trường đậu tương - casein thủy phân - lecithin-polysorbate 80 (Môi trường SCDLP 80 lỏng) A.1.5.1 Thành phần Pepton từ casein 17,0 g 3,0 g Natri chlorid 5,0 g Kali hydrogen phosphat 2,5 g TC VN Pepton từ đậu nành Glucose 2,5 g Lecithin 1,0 g Polysorbate 80 7,0 g 1000 mL TH ẢO Nước A.1.5.2 Chuẩn bị Hoà tan hoàn tồn tất thành phần mơi trường hồn chỉnh khơ nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích phù hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 7,2 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng Mơi trường thạch khác để thử nghiệm tính phù hợp Ự A.2 A.2.1.1 D A.2.1 Môi trường Thạch khoa tây dextrose (PDA) Thành phần Dịch chiết khoai tây 4,0 g Dextrose 20,0 g Thạch 15,0 g Nước 1000 mL A.2.1.2.Chuẩn bị Hoà tan hoàn toàn tất thành phần mơi trường hồn chỉnh khơ nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích phù hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp để nguôi, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 đo nhiệt độ phòng TCVN 05 A.2.2 Soybean-casein digest agar medium (SCDA) or tryptic soy agar (TSA) Thành phần A.2.2.1 Casein thủy phân pancreatin 15,0 g Bột đậu nành thủy phân papaic 5,0 g Natri chlorid 5,0 g Thạch 15,0 g Nước 1000 mL A.2.2.2 Chuẩn bị Hoà tan hoàn toàn tất thành phần môi trường chỉnh khô nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích phù hợp Hấp tiệt khuẩn 121 A.3 sinh TC VN °C 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 7,3 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng Mơi trường thạch chọn lọc khác - Mơi trường thạch khoai tây dextrose bổ sung kháng A.3.1 Thành phần Chiết xuất khoai tây TH ẢO Dextrose 4,0 g 20,0 g Agar 15,0 g Chloramphenicol Nước 0,05 g A.3.2 Chuẩn bị Ự 1000 mL D Hoà tan hoàn toàn tất thành phần nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích phù hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp làm nguội, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng Có thể thay Cloramphenicol 0,10 g kali benzylpenicillin 0,10 g tetracycline cho1 lít môi trường, thêm vào môi trường dạng dung dịch vô khuẩn trước sử dụng TCVN 05 Phụ lục C (Cung cấp thông tin) Các chất trung hịa hoạt tính kháng khuẩn chất bảo quản dung dịch rửa / lọc Ví dụ thành phần chất trung hịa thích hợp dung dịch rửa Hợp chất hóa học trung hịa hoạt tính kháng khuẩn chất bảo quản Chất bảo quản (dùng cho phương pháp màng lọc) Các hợp chất phenol: Lecithin, Polysorbate 80, 30 g/L + lecithin, g/L - Các paraben, Polysorbate 80, Ethylene oxide ngưng tụ cồn béo, g/L + lecithin, 20 g/L + polysorbate 80, g/L phenoxyethanol, - Phenylethanol, v.v… Ethylene oxide ngưng tụ cồn béo (fatty alcohol) Mơi trường lỏng trung hịa D/E a Dung dịch rửa: nước cất vô trùng; tryptone, g/L + NaCl, g/L; polysorbate 80, g/L Chất hoạt động bề mặt không ion Các hợp chất amoni bậc bốn Lecithin, saponin, polysorbate 80, natri dodecyl sulphat Polysorbate 80, 30 g/L + natri dodecyl sulphat, g/L + lecithin, g/L Các chất hoạt động bề mặt cation Ethylene oxide ngưng tụ cồn béo (fatty alcohol) Polysorbate 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + lecithin, g/L TC VN Các aniline Môi trường lỏng trung hòa D/E a Các aldehyd TH ẢO Dung dịch rửa: nước cất vô trùng; tryptone, g/L + NaCl, g/L; polysorbate 80, g/L Glycin, histidin Các chất giải phóng formaldehyd Lecithin, g/L + polysorbate 80, 30 g/L + Lhistidin, g/L Polysorbate 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + Lhistidin, g/L + L-cystein, g/L Mơi trường lỏng trung hịa D/E a Natri thiosulfat D Các hợp chất oxy hóa Ự Dung dịch rửa: polysorbate 80, g/L + L-histidin, 0,5 g/L Các isothiazolinon, imidazol Các biguanid Lecithin, saponin Các amin, sulfat, mercaptan, natri bisulfit, natri thioglycolat Lecithin, saponin, polysorbate 80 Natri thiosulfat, g/L Dung dịch rửa: Natri thiosulfat, g/L Polysorbate 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + lecithin, g/L Dung dịch rửa: tryptone, g/L + NaCl, g/L; polysorbate 80, g/L Polysorbate 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + lecithin, g/L Dung dịch rửa: tryptone, g/L + NaCl, g/L; polysorbate 80, g/L Các muối kim loại (Cu, Zn, Hg) Các muối thủy ngân hữu a Natri bisulfat, L-cystein Natri thioglycolat, 0,5 g/L hay g/L L-cystein, 0,8 g/L hay 1,5 g/L Các hợp chất sulfhydryl, acid hioglycolic Mơi trường lỏng trung hịa D/E a Dung dịch rửa: Natri thioglycolat, 0,5 g/L Môi trường lỏng trung hịa D/E (Mơi trường lỏng trung hịa Dey/Engley) – xem Phụ lục B TCVN 05 Tài liệu tham khảo [1] COLIPA Guidelines on Microbial Quality M anagement, published by the European Cosmetic, Toiletry and Perfumery Association [2] CTFA Microbiology Guidelines, published by the Cosmetic, Toiletry and Fragrance Associa tion ISBN 1-882621-32-8, 2007 [3] E P Microbiological Examination_,.of non-sterile products, 4th edition, published by the European Pharmacopoeia, 2002 [4] FDA Bacteriological Analytical Manual, 8th edition, published by the U.S Food and Drug Administration, 1995, http:/Jwww.cfsan.fda.gov/-ella m/bam-23.htmL J P 14, General Tests -Microbial Limit test, published by the Japanese Pharmacopoeia, TC VN [5] 2001 USP 28, Microbial Limit test (61), published by the U.S Pharmacopoeia, 2005 [7] ATLAS R.M Handbook of Microbiological Media CRC Press, 1993 [8] SINGER S The Use of Preservative Neutralizers in Diluents and Plating Media TH ẢO [6] Cosmetics and Toiletries 1987 December, 102, pp 55 [9] ISO 21149, Cosmetics -Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria [10] ISO 18415, Cosmetics -Microbiology -Detection of specified and non-specified Ự microorganisms D [11] EN 1040, Chemical disinfectants and antiseptics -Basic bactericidal activity -Test method and requirements (phase 1) [12] KELLY J P., & FUNIGI ELLO F Candida albicans: A study of media designed to promote chlamydospore production J Lab Clin Med 1959, 53, pp 807-809 GORDON M.A , & LITTLE G.N Effective dehydrated media with surfactants for identification of Candida albicans, J of Int Soc for Human and Animal Mycol 1963, pp 171-175 [13] ISO 16212, Cosmetics -Microbiolo9y - Enumeration ofyeast and mould [14] EVA NS E.G.V., & RICHARD M.D Medical mycology: a practical approach Oxford University Press, 1989 [15] ISO 29621, Cosmetics -Microbiology - Guidelines for the risk assessment and identification of microbiologically low-risk products  ... TCVN Phát Candida albicans mỹ phẩm Cosmetic – Microbiology – Detection of Candida albicans Phạm vi áp dụng TC VN Tiêu chuẩn quốc tế đưa hướng dẫn chung để phát định danh Candida albicans sản phẩm. .. sản phẩm mỹ phẩm mẫu thử Giữ sản phẩm thử nghiệm nhiệt độ phịng, cần Khơng ủ, làm lạnh cấp đông sản phẩm mẫu thử nghiệm trước sau phân tích TCVN 05 Quá trình lấy mẫu thử nghiệm từ sản phẩm mỹ phẩm. .. với việc phát Candida albicans, cấy truyền mơi trường ni cấy khơng D chọn lọc, sau thực bước định danh thích hợp (ví dụ sử dụng Kit định danh) Do đa dạng sản phẩm mỹ phẩm nên phạm vi áp phẩm không