luan van Huu co

- Mục đích nghiên cứu: Xác định TPHH tinh dầu và các dịch chiết từ thân rễ, phân lập và xác định cấu trúc của một đến hai cấu tử trong dịch chiết từ thân rễ cây nghệ trắng Curcuma sp.. ở[r]

MỤC LỤC Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .3 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài .4 Đối tượng và mục đích nghiên cứu Nội dung và phương pháp nghiên cứu .5 Bố cục luận văn .6 Kết và giá trị thực tiễn luận văn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .7 1.1 Phân loại thực vật chi Curcuma, họ Zingiberaceae 1.2 Sơ lược tình hình nghiên cứu mặt hóa học số loài nghệ có đặc điểm thực vật gần giống với đối tượng nghiên cứu và công dụng loài .7 1.2.1 Curcuma aromatica Salisb .8 1.2.3 Curcuma angustifolia Roxb 13 1.2.4 Curcuma zedoaria (Berg.) Rosc 14 1.3 Công dụng số chất chiết tách từ nghệ 17 1.4 Tình hình nghiên cứu hóa học loài Curcuma sp Quảng Ngãi 19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 20 2.1 Phương pháp xử lý mẫu thực vật 20 2.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật cây 20 2.1.2 Thu và xử lý mẫu thực vật 20 2.2 Thu, định lượng, xác định TPHH tinh dầu 20 2.3 Phương pháp chiết, tách và xác định TPHH các dịch chiết từ thân rễ 21 2.4 Phân lập và xác định cấu trúc các cấu tử tách .23 2.4.1 Phân lập các cấu tử 23 2.4.2 Xác định cấu trúc các cấu tử tách 24 2.5 Thử hoạt tính sinh học 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Xác định tên khoa học 26 3.2 Tinh dầu thân rễ Nghệ trắng Quảng Ngãi 27 3.2.1 Xác định hàm lượng tinh dầu 27 3.2.2 TPHH tinh dầu vỏ thân rễ nghệ trắng thu phương pháp chưng cất 27 3.2 TPHH dịch chiết n-hexan thân rễ nghệ trắng 29 3.3 TPHH dịch chiết etylaxetat từ bã thân rễ nghệ trắng 32 3.4 Xác định cấu trúc các cấu tử tách 33 3.6 Kết thử hoạt tính sinh học 37 KẾT LUẬN 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu C 13 C- NMR H- NMR CTCT CTPT Dm GC GC/MS HPLC MS SKBM SKC TD TPHH TV Tên gọi Curcuma Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Công thức cấu tạo Công thức phân tử Dung môi Sắc ký khí Sắc ký khí ghép khối phổ Sắc khí lỏng hiệu cao Phổ khối lượng Sắc ký mỏng Sắc ký cột Tinh dầu Thành phần hóa học Thực vật MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Hóa học các hợp chất thiên nhiên nói chung và hóa học các hợp chất tách từ thực vật nói riêng là lĩnh vực thu hút quan tâm không các nhà Hóa học hữu mà còn hấp dẫn các nhà Dược học, Nông học, Sinh thái học, Môi trường học Trong thảm thực vật đa dạng và phong phú bốn mùa xanh tốt thuộc khu vực nhiệt đới gió mùa nước ta các cây dược liệu và cây có tinh dầu dồi dào và có giá trị cao Nguồn tài nguyên quý giá này cần điều tra, nghiên cứu để tạo sở khoa học cho việc sử dụng nó cách hợp lý và có hiệu Họ Zingiberaceae là thảo dược không có độc tính, sử dụng làm gia vị cho nhiều món ăn và làm dược liệu điều trị khá nhiều bệnh Phần lớn chúng có thể cho tinh dầu có mùi thơm, đó số có thể dùng làm chất thơm hương liệu, mỹ phẩm Ở nước ta Gừng, Riềng và Nghệ là loài cây cỏ quen thuộc gắn bó với đời sống hàng ngày Chi Nghệ (Curcuma) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) là chi có nhiều cây thuốc có giá trị, là cây phổ biến nước ta, chúng mọc hoang nhiều nơi, số loài trồng khá phổ biến để dùng làm gia vị, làm thuốc nhuộm màu và chất chống oxi hóa cho thực phẩm và là các vị thuốc dân tộc chữa các bệnh gan, mật và đường tiêu hóa Các công trình nghiên cứu gần đây cho thấy nghệ tác dụng tốt tới nhiều hệ thống quan thể chống oxy hóa, điều trị khối u, ung thư, HIV, chống dị ứng, chống thụ thai, có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, trị vết thương chống viêm nhiễm, chữa viêm loét dày, hành tá tràng, ăn không tiêu, nôn mửa, ho Ở địa phương, loài nghệ trắng chủ yếu dùng để chữa vết thương ( giúp mau lành da, liền sẹo), chữa đau bụng, đau dày mà chưa tận dụng, phát huy hết công dụng, ích lợi từ cây nghệ Theo chúng tôi biết, trên giới Việt Nam đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu thành phần hóa học (TPHH) và công dụng nhiều loài nghệ nhằm lựa chọn nâng cao giá trị sử dụng loài Các nghiên cứu cho thấy loại cây, vùng đất thì thành phần, hàm lượng cây là khác và đó ứng dụng khác Tuy nhiên nghiên cứu các loài nghệ TPHH, công dụng số lượng các loài nghệ còn chưa đầy đủ và không đồng số tài liệu Để góp phần vào việc nghiên cứu cách sâu và rộng các loài nghệ có nước, chúng tôi chọn đề tài: "Nghiên cứu thành phần hoá học thân rễ loài nghệ trắng (Curcuma sp.) Quảng Ngãi - Việt Nam"nhằm góp phần vào việc phân loại thực vật dựa trên TPHH, bổ sung thêm nghiên cứu chi Curcuma nói riêng và họ Zingiberaceae nói chung Qua đó góp phần giải thích tác dụng chữa bệnh loại nghệ này mà người dân đã sử dụng Đối tượng và mục đích nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Tinh dầu và dịch chiết từ thân rễ nghệ trắng (Curcuma sp.) Quảng Ngãi - Mục đích nghiên cứu: Xác định TPHH tinh dầu và các dịch chiết từ thân rễ, phân lập và xác định cấu trúc đến hai cấu tử dịch chiết từ thân rễ cây nghệ trắng (Curcuma sp.) Quảng Ngãi, thử hoạt tính sinh học các dịch chiết và các cấu tử tách Nội dung và phương pháp nghiên cứu * Nội dung nghiên cứu: - Xác định tên khoa học loài nghệ trắng Quảng Ngãi - Xác định TPHH tinh dầu bay thân rễ cây nghệ trắng - Xác định TPHH dịch chiết n-hexan từ thân rễ cây nghệ trắng - Xác định TPHH dịch chiết etylaxetat từ thân rễ cây nghệ trắng - Thử hoạt tính sinh học số dịch chiết và các cấu tử tách trên số chủng vi khuẩn - Phân lập và xác định cấu trúc cấu tử từ dịch chiết thân rễ cây nghệ trắng số dung môi hữu * Phương pháp nghiên cứu: - Nghiên cứu lý thuyết: Phương pháp tách biệt các hợp chất tự nhiên, tổng quan các tài liệu đặc điểm thực vật, xác định TPHH, công dụng số cây thuộc chi Nghệ (Curcuma) họ Gừng (Zingiberaceae) - Tách tinh dầu phương pháp chưng cất lôi nước - Xác định TPHH tinh dầu sắc ký khí - khối phổ liên hợp (GC/MS) - Thu dịch chiết sau: + Xử lí mẫu: từ thân rễ tươi gọt vỏ, rửa đem xay, lọc, ép + Sử dụng các dung môi hữu có độ phân cực khác để chiết - Xác định TPHH dịch chiết n-hexan GC/MS - Phân lập cấu tử từ dịch chiết các phương pháp sắc ký mỏng (SKBM), sắc ký cột (SKC), sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), phương pháp kết tinh lại - Xác định cấu trúc các cấu tử tách các phương pháp phổ: MS, IR, UV, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HMBC, HSQC, NEOSY Bố cục luận văn - Luận văn gồm 42 trang, đó có bảng và 11 hình - Ngoài phần mục lục (2 trang), kí hiệu chữ viết tắt (1 trang), bảng biểu hình ảnh (13 trang), phần mở đầu (3 trang), kết luận (2 trang) và tài liệu tham khảo (3 trang, gồm 26 tài liệu), nội dung luận văn chia làm chương: + Chương 1: Tổng quan tài liệu (13 trang) + Chương 2: Thực nghiệm (6 trang) + Chương 3: Kết nghiên cứu và thảo luận (12 trang) Kết và giá trị thực tiễn luận văn Từ các kết nghiên cứu, luận văn đã thu số kết với đóng góp thiết thực sau: - Xác định tên khoa học loài nghệ trắng Quảng Ngãi là Curcuma aromatica Salisb - Xác định hàm lượng tinh dầu và TPHH tinh dầu - Xác định TPHH dịch chiết từ thân rễ dung môi n-hexan, etylaxetat - Tách và xác định cấu trúc hợp chất từ dịch chiết thân rễ nghệ trắng dm: n-hexan - Nghiên cứu hoạt tính sinh học cao n-hexan, cao butanol từ đó thấy công dụng chúng CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phân loại thực vật chi Curcuma, họ Zingiberaceae Theo tài liệu [7], chi Curcuma gồm tới 40 loài các vùng nhiệt đới châu Á, nước ta có 16 loài Theo tài liệu [6], [9] thì Việt Nam và các nước Đông Dương chi Curcuma gồm 19 loài Theo tài liệu [24] thì chi Curcuma có đến 97 loài Theo tài liệu [22] chi Curcuma Bangladesh có từ 16-20 loài; Trung Quốc, Ấn Độ và Đông Dương có từ 20-25 loài, Malaysia có từ 20-30 loài, Nepal có từ 10-15 loài, Philipin có từ 12-15 loài, Thái Lan có từ 30-40 loài và giới có từ 7080 loài Do đó nhìn chung chưa có thống các tài liệu số lượng các loài chi Curcuma Curcuma - tiếng Ả Rập là kurkum: cây nghệ tây, màu vàng nghệ Đặc điểm thực vật chung chi Curcuma, chúng là loài cây thảo có thân rễ dạng củ, nạc, phân nhánh, có thịt thường có màu, mang củ cuối các rễ, có là thân rễ yếu, không có rễ phình cuối Lá xếp hai dãy, có cuống có bẹ, phiến hình dải, hình giáo hay trái xoan, hình tim gốc nhiều hay ít, màu lục nhạt, toàn cây có dạng cây chuối hoa Cán hoa có lá gốc, tách biệt với thân có lá Cụm hoa là bông mọc đứng, hình trụ, tạo thành các lá bắc lõm xếp sít nhau, thường màu lục, nách lá bắc có hoa mau tàn, màu vàng hay hồng, có nằm thụt lá bắc Đài hình ống có răng, tràng hình ống, loe đỉnh, với thùy với môi to trải ra, nhị với nhị dạng cánh, với bao phấn có sừng mảnh và dài Ở bông, các lá bắc bất thụ lại có màu, thường là vàng, hồng đỏ tùy loài Cánh môi thường rộng và ngắn Bầu ô, noãn nhiều, nhụy lép 2, với nhụy dạng sợi, đầu nhụy dạng chén Quả nang có vỏ mỏng, hạt nhiều, có áo hạt 1.2 Sơ lược tình hình nghiên cứu mặt hóa học số loài nghệ có đặc điểm thực vật gần giống với đối tượng nghiên cứu và công dụng loài Theo chúng tôi biết đã có nhiều công trình nghiên cứu nhiều tác giả nước và trên giới TPHH và công dụng các loài nghệ Các công trình nghiên cứu cho thấy TPHH tinh dầu các loại nghệ chủ yếu là sesquiterpen và dẫn xuất chúng, monoterpen chiếm phần nhỏ nhiều [12] Dưới đây, chúng tôi tổng hợp đặc điểm thực vật, số kết nghiên cứu TPHH và phương pháp nghiên cứu công dụng số loài nghệ có đặc điểm thực vật gần giống đối tượng nghiên cứu 1.2.1 Curcuma aromatica Salisb [Nghệ trắng, Uất kim (Trung Quốc), Ngải trắng, Nghệ sùi, Bạch tỵ uất kim] [2], [5],[7], [15], [16] * Đặc điểm thực vật Cây thảo cao đến 1m, có thân rễ to và các củ hình trụ, toả hình bàn tay, màu vàng và thơm Lá thuôn hình mũi mác rộng, có lông nhung mặt dưới, dài 30-60cm, rộng 10-20cm; cuống ngắn, bẹ ôm lấy và tạo thành thân Cán hoa mọc từ rễ, bên cạnh lá và thường xuất trước lá, dài tới 20cm Cụm hoa hình trụ, dày hoa, dài tới 20cm, rộng 7cm; lá bắc màu lục, lợp lên nhau, kèm theo 3-4 hoa liên tiếp, hình mũi mác - trái xoan; các lá bắc trên không sinh sản, màu hồng hồng Phân bố Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam, Campuchia Ở nước ta, cây mọc hoang và trồng các vườn gia đình vùng núi Cây mọc tán rừng, hoa vào tháng 4-6 [7] * Về mặt hóa học Theo tác giả Lương Sĩ Bỉnh, tinh dầu thân rễ Curcuma aromatica Salisb Việt Nam phân tích GC/MS kết thu được: 1,8–cineol (1,55%); terpinolen (2,12%), β–elemen (1,52%), humulen (2,56%), curzerenon (38,78%), germacron (11,22%)… [1], [15] TPHH chính các phần chiết ete dầu hỏa (petroleum ether) và etyl axetat thân rễ nghệ trắng thu hoạch tháng 11 năm 1996 Sóc Sơn, Hà Nội theo tài liệu [9] cho thấy chủ yếu là các sesquiterpenoic, đó thành phần có hàm lượng lớn là các sesquiterpenoic có khung germacran Ở phần chiết ete dầu hỏa định danh 20 cấu tử, đó các cấu tử chính furanodien (4,7%), furanodienon và curzerenon (30,7%), (E,E)-germacron (8,2%), neocurdion (5,0%), zederon (6,2%) Ở phần chiết etyl axetat định danh 15 cấu tử đó các cấu tử chính gồm furanodien (4,7%), furanodienon và curzerenon (20,7%), (E,E)-germacron (4,2%), neocurdion (3,0%), zederon (14,9%) Các cấu tử tinh dầu thân rễ loài Curcuma aromatica Salisb trồng Nhật Bản và Ấn Độ phân tích phương pháp GC và GC/MS Các loại tinh dầu này khác hẳn Các cấu tử chính tinh dầu Nhật Bản là curdion, germacron, 1,8-cineol, (45,5S)-germacron-4,5-epoxid, β-elemen và linalool Trong đó các cấu tử chính tinh dầu Ấn Độ là β-curcumen, ar-curcumen, xanthorhizol, germacron, campho và curzerenon [10] Thành phần chính tinh dầu thân rễ loài Curcuma aromatica Salisb mọc Thái Lan là camphor (26,94%), α-curcumen (23,18%) và xanthorhizol (18,70%) [17] Các hợp chất chính có tinh dầu thân rễ loài Curcuma aromatica Salisb Indonesia gồm  -curcumen (18,6%), β-curcumen (25,5%), xanthorhizol (25,7%) [7] * Công dụng Nghệ trắng có tác dụng làm liền sẹo, chữa trị vết thương, vết bỏng và các bệnh dày, hệ tiêu hóa tương tự nghệ vàng Trong dân gian, thân rễ Curcuma aromatica Salisb dùng phối hợp với các loài nghệ khác làm thuốc điều kinh, chữa tê thấp; thường ngâm rượu cùng với số loại nghệ khác để xoa bóp chữa thấp khớp Người ta ăn nghệ trắng trộn với mật ong đường để điều trị các bệnh tim mạch, điều hòa nhịp tim Ở Trung Quốc, thân rễ nghệ trắng dùng để trị bệnh tức ngực, trướng bụng, nôn máu, chảy máu cam, tiểu tiện máu, viêm gan mạn, xơ gan, hoàng đản, kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh và động kinh Ở Nhật Bản, thân rễ dùng làm thuốc để tăng tiết mật, kích thích tiêu hóa 1.2.2 Curcuma aeruginosa Roxb (Nghệ xanh, Nghệ ten đồng, Nga truật (Trung Quốc), zédoaire (Pháp), zedoray (Anh) ) [6], [8] * Đặc điểm thực vật Cây thảo cao đến 2m Thân rễ to, hình trái xoan, phân nhánh, màu lục xám Lá hình giáo rộng, không lông, dài 30-70cm hơn, rộng 9-13cm, dọc theo gân có dải màu đỏ nhạt; bẹ dài không lông; không có cuống hoa Cán hoa bên; bông hình trụ, chóp màu hồng đẹp Phân bố Ấn Độ, Nam Trung Quốc, Việt Nam, Campuchia, Malaysia, Indonesia Ở nước ta, cây mọc hoang và trồng các vườn gia đình từ Hà Giang, Tuyên Quang vào thành phố Hồ Chí Minh Ra hoa tháng 4-7 [2] * Về mặt hóa học Tinh dầu thân rễ Curcuma aeruginosa Roxb Việt Nam có 24 chất xác định gồm: β-pinen (1,23%); 1,8-cineol (2,98%); camphor (1,61%); β-elemen (2,82%); Phan Tống Sơn và cộng đã xác định 37 cấu tử tinh dầu thân rễ nghệ xanh trồng Phú Thụy (Hà Nội) thu hoạch vào tháng âm lịch hiệu suất tinh dầu 0,3% so với nguyên liệu tươi đó có curzerenon chiếm hàm lượng 20% 30 20 22 tinh dầu Tinh dầu này có n D :1,5132;d 20 :1,0040;  D : 9,1 (l=1dm) Theo S.Zhang và cộng sự, tinh dầu thân rễ Curcuma aeruginosa Roxb Trung Quốc chứa curcumenol, isocurcumenol, germacron và curzerenon Trước đó các tác giả này đã xác định tinh dầu này có chứa α-pinen, limonen, linalol, caryophyllen và curzerenon với hàm lượng cao Tinh dầu thân rễ Curcuma aeruginosa Roxb Indonesia có chứa các hợp chất sau: isocurcumenol (8,5%); β-eudesmol (6,5%); curdion (3,6%); curcumenol (9,9%); curcumanolid A và B (11,4%); dehidrocurdion (9,4%) và curcumol (1,9%) Tinh dầu thân rễ loài Curcuma aeruginosa Roxb Kerala, Ấn Độ phân tích GC và GC/MS 50 hợp chất phát đó các cấu tử chính là curzerenon (16,7%), dehidrocurdion (13,9%); 1,8-cineol (13,6%) và camphor (10,1%) Việc phát dehidrocurdion khẳng định phổ H- NMR Tinh dầu chưng cất từ thân rễ loài Curcuma aeruginosa Roxb Thái Lan chứa các cấu tử chính là β-pinen (7,71%); 1,8-cineol (9,64%) và curzerenon (41,63%) 10 Theo tài liệu [6], Phan Minh Giang, Văn Ngọc Hướng và Phan Tống Sơn nghiên cứu TPHH dịch chiết ete dầu hỏa (sau chiết etanol) từ thân rễ nghệ xanh “var B” (Curcuma aff aeruginosa Roxb.) thu thập vào tháng 11 dương lịch Phú Thụy, Gia Lâm ngoại thành Hà Nội năm 1998 thu các sesquiterpen và sesquiterpenoic sau: -elemen (1,3%); isocaryophyllen (0,3%); -elemen (1,3%); -curcumen (0,1%); -humulen (0,5%); -guaien + -muurolen (0,2%); (E)--farnensen (0,4%), furanodien (2,7%); virdifloren (0,6%); - chamigren (0,1%); -cadinen (0,1%); -sesquiphellandren (0,3%); humulen epoxit II (0,1%); furanodienon + curzerenon (23,1%); - eudesmol (0,6%); guaiazulen (1,3%); (E,E)gemacron (5,2%); curdion (15,3%); curcumol (3,2%); curcumenol (2,7%) Bảy cấu tử đã phân lập từ dịch chiết trên là furanodien, (E,E)-gemacron, furanodienon, curdion, curzerenon, curcumol và curcumenon 1 O 10 15 O 10 12 15 11 13 12 11 13 14 14 Furanodien (E,E)-Germacron Nhận dạng dầu Tinh thể màu trắng ( kết tinh PE) GC-MS: m/z 216 (M+, C15H20O) Đnc: 50-520C,GC-MS: m/z 218 (M+, C15H22O) O 10 15 15 11 13 14 14 Furanodienon 12 O 11 13 Curdion Nhận dạng dầu O 10 12 Tinh thể hình lá màu trắng, Đnc: 600C H O 10 15 14 H 12 O OH 11 13 O Curzerenon Curcumol Nhận dạng dầu Nhận dạng tinh thể Đnc:1410C GC-MS:m/z 230 (M+, C15H18O2) GC-MS:m/z 236 (M+, C15H24O2) 11 H O OH Curcumenol Nhận dạng tinh thể Đnc: 1160C GC-MS:m/z 234 (M+, C15H22O2) Cũng loài này, ngâm chiết thân rễ metanol thu được: Zedoalacton A, zedoalacton B, zedoarondiol [24] 15 H 14 OH 10 15 OH H H 15 H OH 14 11 12 OH Zedoalacton A H 10 OH H Zedoalacton B 14 OH 11 12 Zedoarondiol Theo tài liệu [6], [8] Phan Minh Giang và các cộng đã phân lập, nhận dạng và thử hoạt tính sinh học các sesquiterpenoic từ thân rễ nghệ xanh Curcuma aff aeruginosa Roxb Thân rễ nghệ xanh (Curcuma aff aeruginosa Roxb.) (30kg) thu thập Phú Thụy, ngoại thành Hà Nội vào tháng năm 2004 Sau rửa và thái lát mỏng, nguyên liệu này hong khô ngoài không khí, sấy khô nhiệt độ 40-500C và xay thành bột mịn Kết thu kg bột khô thân rễ nghệ xanh kg bột thân rễ nghệ xanh khô ngâm chiết với metanol nhiệt độ phòng (3 lần, lần ngày) Các dịch chiết metanol gộp chung và cô quay áp suất giảm còn 1/10 thể tích Pha loãng dịch metanol nước, chiết với n-hexan, etyl axetat và n-butanol Các dịch chiết làm khan Na2SO4, cất loại kiệt dung môi áp suất giảm để thu các phần chiết tương ứng: phần chiết n-hexan (H, 157g), etyl axetat (E, 30g) và n-butanol (B, 7g) Tiến hành SKC với 10 gam phần chiết n-hexan (H) trên 100 gam silicagel ( cỡ hạt 63-100  m) Giải hấp phụ hệ dung môi n-hexan: etyl axetat ( tỷ lệ 100:0, 98:2, 90:1, 80:2, 50:50, ), thu 189 phân đoạn ( phân đoạn 20ml), gom thành 17 phân đoạn (H1-H17) 12 Nhóm phân đoạn H3 ( pđ 28-33; 0,2g) tinh chế SKC nhanh (FC) với silicagel (15-40  m), rửa giải n-hexan: etyl axetat ( tỷ lệ 98:2, 90:10, ), kết tinh lại n-hexan, thu 70mg curdion Nhóm phân đoạn H7 (pđ 68-77; 0,4g) kết tinh lại axeton, thu 150 mg zederon Đây là lần đầu tiên zederon, hợp chất epoxyxeton kiểu furanogermacran phân lập từ cây nghệ xanh Năm 2007, Trần Thanh Lương và các cộng đã công bố phân lập số hợp chất hóa học từ thân rễ nghệ xanh Curcuma aeruginosa trồng Tam Đảo, Vĩnh Phú Thân rễ tươi (6,4kg) sau lấy tinh dầu sấy khô nhiệt độ 50 60oC còn lại 604g, xay nhỏ và ngâm với EtOH nhiều lần nhiệt độ phòng Cao EtOH chiết qua ete dầu, EtOAc thu 22,4g và 18,6g cao tương ứng [11] Lấy 10g cao ete dầu hỏa tiến hành SKC silicagel (100g) với dung môi rửa giải là ete dầu hỏa/CHCl từ 100:0 → 90:10 → 0:100 và CHCl - EtOAc từ 100:0 → 80:20 thu 10 phân đoạn Tiếp tục tinh chế các phân đoạn SKC với hệ dung môi ete dầu hỏa - CHCl3 với tỉ lệ 1:1 phân đoạn thu zederon; tỉ lệ 25:75 cho phân đoạn (682mg) thu hỗn hợp stigmasterol và β-sistosterol và tỉ lệ 20:80 cho phân đoạn (99,5mg) thu rutaecarpin [11] Đối với cao EtOAc (5g) tiến hành SKC silicagel (50g) với hệ dung môi ete dầu/EtOAc (100:0 → 90:10 → 0:100) thu 12 phân đoạn Tinh chế phân đoạn (225mg) SKC silicagel với dung môi CHCl3 thu evodiamin N O N N H N H N H O N H3C Rutaecarpin evodiamin Rutaecarpin và evodiamin là hai ankaloit indopyridoquinazolin, lớp chất thiên nhiên và lần đầu tiên phân lập từ chi nghệ [11] * Công dụng 13 Dùng làm thuốc trị bệnh đau bụng tả, đau dày, phụ nữ sau sinh nở [17] Ở Trung Quốc, người ta dùng thân rễ để trị ứ huyết đau bụng, gan lách sưng to, kinh bế và ăn uống không tiêu Ở Inđonesia, Malayxia dùng sắc nước cho phụ nữ uống sau sinh, trị ho, hen suyễn, trị vảy da và trị gàu 1.2.3 Curcuma angustifolia Roxb (Nghệ lá hẹp) * Đặc điểm thực vật Thân thảo cao 40-50cm; thân rễ nhỏ 2-3cm, màu trắng ngà, ngoài bìa vàng, vị đắng; lá hình xoan hẹp, phiến lá thẳng, dày và cứng, dài 45 cm, rộng 5-7 cm, các lá trên có cuống dài 15 cm; phát hoa đất, xuất trước lá, cụm hoa dài 10 cm, gắn trên trục dài 8-10 cm; thân mang hoa và thân mang lá khác nhau, các lá hoa trên chóp cụm hoa có màu tím hồng, lá hoa màu xanh có chót tía; hoa có màu hồng cam, cánh hoa môi màu vàng Phân bố Ấn Độ, Lào và Việt Nam Ở nước ta có gặp Tây Ninh * Về mặt hóa học: Tinh dầu thân rễ Curcuma angustifolia Roxb trồng trung tâm và miền nam Ấn Độ phân tích phương pháp GC/MS nhận 81 và 78 cấu tử, chiếm 95% và 99% hàm lượng tinh dầu tương ứng Những cấu tử chính tinh dầu thân dễ cây này trung tâm Ấn Độ gồm các đồng phân xanthorrhizol (12,7%), methyl eugenol (10,5%), axit palmitic (5,2%) và camphor (4,2%) Tinh dầu thân rễ cây này Travancore (miền nam Ấn Độ) chứa germacron (12,8%), camphor (12,3%), isoborneol (8,7%), curdion (8,4%) và 1,8-cineol (4,8%) Theo tài liệu [18], Nguyễn Thị Bích Tuyết đã so sánh TPHH tinh dầu thân rễ nghệ lá hẹp Curcuma angustifolia Roxb Việt Nam hai mẫu tươi và khô theo phân tích GC/MS, cho thấy thành phần chính là Camphor (12,6% thân rễ tươi; 12,11% thân rễ khô); đặc biệt hàm lượng curzerenon cao (57,3% thân rễ tươi và 38,01% thân rễ khô) Các cấu tử khác thường gặp tinh dầu germacren, ar-curcumen, curzerenen có mặt, đặc biệt tinh dầu thân rễ khô Một số chất thường gặp tinh dầu gừng tìm thấy chẳng hạn α-hulumen, borneol, camphen [18] 1.2.4 Curcuma zedoaria (Berg.) Rosc (Nghệ đen, Nga truật, Ngải tím, Tam nại, Nghệ tím) [10], [13], [14] 14 * Đặc điểm thực vật Cây thảo cao chừng 1-1.5m, có thân rễ hình nón, có khía dọc, củ toả theo hình chân vịt, dày, nạc, màu vàng nhạt trong; củ già có vòng màu đen Ngoài củ chính ra, còn có củ phụ có cuống trái xoan hay hình lê, màu trắng Lá có bẹ dài gốc, phiến hình mũi mác, dài tới 60cm, rộng 8cm, có đốm đỏ dọc theo gân chính; không có cuống hay có cuống ngắn Cánh hoa bên cạnh thân có lá, mọc từ rễ, dài tới 20cm, thường xuất trước lá Mọc hoang Himalaya, Xrilanca và Chittagong (Ấn Độ) Ở nước ta gặp cây mọc hoang và thường trồng khắp nơi từ Bắc vào Nam.[10] * Về mặt hóa học Ở Việt Nam, TPHH tinh dầu thân rễ Curcuma zedoaria Rosc có cấu tử chính là zerumbon với hàm lượng 79,8% Trong dịch chiết thân rễ Curcuma zedoaria Rosc ngoài zerumbon chiếm lượng lớn còn có zerumbon-2,3-epoxit, αhumulen, caryophyllen epoxit [10] Tinh dầu thân rễ loài Curcuma zedoaria Rosc huyện Đô Lương tỉnh Nghệ An (mẫu 1) và huyện Hương Sơn tỉnh Hà Tĩnh (mẫu 2) chưng cất phương pháp lôi nước với hàm lượng tinh dầu 0,22% Các mẫu phân tích phương pháp GC và GC/MS 50 cấu tử xác định Các cấu tử chính là epicurzerenon (15,0%; 38,8%), germacron (22,6%; 14,8%), β-pinen (2,9%; 2,5%); 1,8-cineol (4,8%; 0,2%), camphor (2,0%; lượng vết), isoborneol (1,0%; lượng vết), β-elemen (1,2%; 0,3%), zingiberen (1,0%; 0,3%), benzofuran 6ethyxyl-4,5,6,7-tetrahydro-3,6-dimethyl-5-isopropenyl (2,09%; 2,8%), 2,4- diisopropenyl-1-methyl-1-vinyl-xyclohexan (1,3%; 1,3%), germacren (1,8%; 2,3%), α-cadinol (1,4%; 0,9%), T-muurolol (1,5%; 1,3%), dẫn xuất furanodien (1,6%; 3,8%) tương ứng với mẫu và mẫu [14] Theo tài liệu [25] tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước từ lá cây C zedoaria Rosc nghiên cứu phương pháp GC/MS xác định 23 cấu tử, chiếm 75% lượng tinh dầu Tinh dầu C zedoaria Rosc chủ yếu chứa mono- và sesquiterpenoic, các monoterpen hydrocarbon (2,3%), các monoterpen oxy (26%), cấu tử chính tinh dầu lá gồm α-terpinyl axetat (8,4%), isoborneol (7%), dehydrocurdion (9%) và selina-4(15),7(11)-dien-8-on (9,4%) 15 Những khảo sát hóa học trên tinh dầu thân rễ C zedoaria Rosc (ở Ấn Độ) các tác giả Gurdip Singh, Om Prakash Singh, Y R Prasad, M P Lampasona và C Catalan (09/2003) sử dụng kỹ thuật HPLC, GC và GC/MS cho thấy cấu tử chính gồm 1,8-cineol (18,5%), o- và p-cymen (18,42%) và α-phellandren (14,93%), terpinolen (4,11%), α-pinen (3,28%), β-turmeron (3,1%), β-pinen (2,93%), βphellandren (2,0%)… Tinh dầu này sử dụng để sản xuất thuốc diệt côn trùng Odontotermes obesus Rhamb, với liều tối thiểu µL dùng khoảng thời gian 24 giờ, côn trùng bị tiêu diệt 100% [23] Năm 1985, Yoshinori Shiobara và các cộng đã tiến hành nghiên cứu các phận Curcuma zedoaria Roscoe mua từ đảo Yahushima, Nhật Bản Đối với phận thân rễ khô (16kg), các tác giả đem chiết với CH 2Cl2 ngày, cô đuổi dung môi thu 500g cao Lấy 5g thực SKC silicagel (100g) với hệ dung môi n-hexan - EtOAc có nồng độ tăng tuyến tính từ 99:1 (n-hexan, 400ml) → 98:2 (200ml) → 97:3 (750ml) → 95:5 (1500ml) thu phân đoạn 50ml Phân đoạn 14 cô đuổi dung môi và tiến hành SKC Sephadex LH-20 (CHCl - MeOH, 1:1) thu germacron (22mg, mp50 - 51o) Cao phân đoạn 15-17 thực SKC silicagel với n-hexan - EtOAc (2:1) thu curzeremon Phân đoạn 19-22 xử lý tương tự thu furanodienon (127mg, mp89 - 91 o) Phân đoạn 23-25 chứa hai spirolacton (124mg) tinh chế HPLC điều chế cho curcumanol A (23mg) và curcumanol B (14mg) Các phân đoạn 28-32 và 34-40 tiến hành SKC silicagel (n-hexan - CH2Cl2, 1:2) thu dehydrocurdion (502mg)và isocurcumenol (61mg) tương ứng Tương tự, phân đoạn 44-46 rửa giải CH 2Cl2 thu zederon (180mg); phân đoạn 54-57 thu curcumenol (104mg) và phân đoạn 6169 với hệ dung môi CH2Cl2 - CHCl3 (1:1) thu curcumenon (136mg) Đối với chồi non (58g) tác giả cắt nhỏ và chiết với CH2Cl2 ngày Cao thu (130mg) tiến hành SKC trên silicagel (5g) với CH 2Cl2 thu phân đoạn 20ml Phân đoạn 8-10, cô đuổi dung môi, sau đó tiến hành SKC Sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải là CHCl - MeOH (1:1) thu (+)-germacron-4,5-epoxit (4,4mg) 16 Cũng với Curcuma zedoaria Roscoe lấy đảo Yakushima, Nhật Bản, Isao Louo và Nobusuke chiết thân rễ tươi với MeOH Cao MeOH (214g) hòa tan 1lít H2O và chiết với đietyl ete (300ml) và n-BuOH (300ml) Dịch n-BuOH cô đuổi dung môi và chạy Amberlite XAD-2CC, rửa giải với H 2O → H2O - MeOH (1:1) → MeOH Hai phân đoạn sau gộp lại và cô kiệt dung môi thu 11g cao, tiến hành SKC silicagel (CHCl - MeOH, 4:1) thu phân đoạn 50ml Gộp phân đoạn 10-15 và tiếp tục SKC với EtOAc (9:1) thu phân đoạn 30ml Phân đoạn 10-13 kết tinh lại CHCl3 thu zedoarondiol (324mg) H Makabe và cộng chiết thân rễ tươi Curcuma zedoaria Roscoe (3,6kg, cây trồng Okinawa, Nhật Bản) với MeOH Cao thô thêm nước và chiết với benzen, EtOAc thu hai cao tương ứng với khối lượng 7,8g và 0,6g Phần cao benzen có hoạt tính chống viêm chạy SKC silicagel (400g) với hệ dung môi EtOAc - n-hexan nồng độ tăng theo kiểu bậc thang (10%) Phân đoạn 20% EtOAc - n-hexan (1,6g) tiếp tục tinh chế TLC thu furanodien (8mg), furanodienon (384mg), urfurenon (4mg), curzedon (7mg), germacron (10mg) và hợp chất dạng dẻo, không màu (8mg), có công thức sau 10 O 15 14 O 12 11 13 Xử lý tương tự phân đoạn 30% EtOAc - n-hexan (3,4g) thu dehydrocurion (33mg); phân đoạn 40% (0,88g) thu zederon (70mg) và curcumenon (22mg) Phân đoạn EtOAc (0,6g) tiến hành SKC silicagel (30g) với hệ dung môi có nồng độ tăng tiến theo kiểu bậc thang 10% EtOAc - n-hexan Phân đoạn 70% (25mg) tinh chế TLC thu zedoarinediol (20mg).[24] Năm 2003, Hideo Etoh và cộng chiết rễ (800g) Curcuma zedoaria Roscoe trồng Okinawa, Nhật Bản Cao n-hexan (3,47g) SKC silicagel với hệ dung môi n-hexan - EtOAc (9:1) thu isoprocurmenol (29mg, 0,0033%) Isoprocurcumenol có khả ức chế the Blue Musel (0,7mg/ đường kính 4cm) Mạnh gấp lần so với chuẩn CuSO4[20] * Công dụng 17 Thân rễ dùng làm thuốc chữa đau ngực, đau bụng, ăn uống không tiêu, giúp tiêu hoá, chữa ho, làm thuốc điều kinh và còn dùng làm thuốc kích thích và bổ [16] Ở Ấn Độ, thân rễ dùng làm thuốc giúp kích thích tiêu hóa, làm mát, làm thơm, dùng đắp lên vết thâm tím và các chỗ đau, dùng phối hợp với hồ tiêu, quế và mật ong sắc uống trị bệnh cảm lạnh Ở Vân Nam ( Trung Quốc), thân rễ dùng chữa bế kinh đau bụng, ăn uống không tiêu, biếng ăn, đòn ngã tổn thương 1.3 Công dụng số chất chiết tách từ nghệ Thành phần chính tinh nghệ là hoạt chất curcumin Hoạt chất curcumin nghệ vàng có hoạt tính sinh học khá độc đáo giải độc gan, ngăn cản phát triển vi trùng lao, hàn gắn vết thương và ngoài thể, chống viêm loét dày, hành tá tràng, đường tiết niệu Curcumin còn là chất chống oxi hóa mạnh, có khả tiêu diệt các gốc tự và các loại men hại gây ung thư có thức ăn, nước uống ngày [17] Một nghiên cứu đây các nhà khoa học thuộc Đại học Haward (Mỹ) cho thấy curcumin có tác dụng kháng virus HIV hai thể cấp và mãn tính tế bào Hy vọng curcumin điều chế từ nghệ vàng là loại thuốc hiệu lực chống lại bệnh HIV-AIDS với mức phí tổn mà nhiều người có thể chấp nhận Theo các nghiên cứu đây, Curcumin có hoạt tính chống viêm và là chất có khả ức chế phản ứng oxi hóa các enzym sinh Curcumin có thể triệt tiêu phát triển khối u việc ngăn chặn đường truyền tính trạng tế bào Sự phân hủy curcumin phụ thuộc vào pH môi trường, Curcumin phân hủy nhanh chóng môi trường huyết tự Trên sở phân tích phổ khối lượng và đo quang (sự giảm cấp curcumin dung dịch đệm phốt phát 0.1 M pH 7.2), xác định trans-6-(4’-hydroxy-3’methoxy-phenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal là sản phẩm giảm cấp chính; vanillin, axit ferulic và feruloylmethane là sản phẩm giảm cấp phụ 18 Vanillin xuất làm tăng thêm ức chế phát sinh đột biến vi khuẩn và tế bào loài động vật có vú Nó có thể đóng vai chất kháng đột biến việc sửa đổi chép ADN và phục hồi hệ thống ADN sau thiệt hại tế bào ADN gây đột biến xuất Vanillin là chất thu dọn các gốc superoxide và hidroxyl [25] Chất (4S,5S)-(+)gemeron-4,6-epoxid trích ly từ cây nghệ trắng (Curcuma aromatica) đã đăng ký sáng chế Nhật Bản để trị bệnh tiểu đường Tinh dầu nghệ Curcuma aromatica đã dùng vào điều trị các khối u não phát sớm Thử nghiệm các dịch chiết từ thân rễ cây nghệ xanh (Curcuma aeruginosa) mọc Việt Nam cho thấy, chúng có tác dụng ức chế loại vi khuẩn gây bệnh Riêng curdion- loại sesquiterpendiceton thường gặp nhiều loại nghệ- kìm hãm phát triển Escherichia coli, Salmonellatyphi, Kieb pneumoniac và Staphylococus aureus là các loại vi khuẩn gây bệnh, đifurocumenon phân lập từ C.aeruginosa có thể dùng làm thuốc [17] Các nghiên cứu đây cho thấy curdion có khả kháng vi nấm Aspergillus niger (MIC 50=  g/ml) và vi khuẩn Staphyococcus aureus (MIC 50  g/ml) zederon lại thể hoạt tính kháng Candida albicans (MIC 50  g/ml) Cả hai hợp chất này ức chế Fusarium oxysporum (MIC 25  g/ml) [8] 19 Curzerenon và các đồng phân epicurzerenon, furanodienon, isofuradienon là chất có tính kháng khuẩn đã nghiên cứu Nhật Bản qua các chiết xuất nghệ xanh (C aeruginosa Roxb.) Furanodien và furanodienon có hoạt tính chống viêm chứng phù tai trên Đây là phát đầu tiên sesquiterpenoic khung germacron có hoạt tính chống viêm [26] Nghệ còn giúp chống lão hóa da, ngăn ngừa hình thành các nếp nhăn, vết nám, làm cho da mịn màng, tươi trẻ Nghệ còn hỗ trợ chống viêm, loét ức chế các chất trung gian gây viêm cyclooxygenaza (COX - 2), lipooxy-genaza (LOX)… Hỗ trợ chống xơ vữa động mạch cholesterol và tăng độ bền mao mạch ngoại vi.[25] 1.4 Tình hình nghiên cứu hóa học loài Curcuma sp Quảng Ngãi Hiện Quảng Ngãi có công bố kết nghiên cứu loài nghệ xanh (Curcuma aeruginosa Roxb.) tác giả Vũ Thị Liên Hương, chưa có tài liệu nào cho thấy nghiên cứu mặt hóa học loài Curcuma aromatica Salisb Quảng Ngãi 20 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp xử lý mẫu thực vật 2.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật cây - Địa thực vật, có thân khí sinh cao -1,5 m, thân ngầm (củ) màu vàng tái, thơm Lá có phiến dài 30-60 cm, rộng 15 cm, gân chính lõm sâu mặt trên, lồi mặt dưới; cuống ngắn Hoa tự (cụm hoa) mọc độc lập từ thân ngầm đất, không qua trục thân khí sinh, thường cao khoảng 20 cm, rộng khoảng 6-8 cm, lá hoa có đỉnh màu phớt hồng; cánh hoa màu hồng, dài 1-1,5 cm, cánh môi tròn; bầu noãn có lông Hình 2.1 Một số hình ảnh lá và thân rễ nghệ trắng 2.1.2 Thu và xử lý mẫu thực vật Mẫu cây nghệ trắng (Curcuma aromatica Salisb.) lấy huyện Tây Traø, tỉnh Quảng Ngãi Mẫu sau lấy rửa sạch, để ráo nước tự nhiên nhiệt độ phòng Thân rễ tươi đem xay, lọc, ép chưng cất để thu TD, chiết các dung môi hữu khác 2.2 Thu, định lượng, xác định TPHH tinh dầu Tiến hành thu tinh dầu phương pháp chưng cất lôi nước có gắn ống sinh hàn hồi lưu phòng thí nghiệm hợp chất thiên nhiên trường ĐHSP Huế Lấy 400g vỏ thân rễ cho vào bình cầu đáy tròn 1000ml, đổ nước cất đến 2/3 bình, lắp ống sinh hàn và bình hứng có thiết bị hồi lưu nước, đun trên bếp điện giờ, thu 1,2ml tinh dầu sánh, màu tím (1,07g) - Xác định hàm lượng tinh dầu theo phương pháp dược điển Việt Nam - Xác định TPHH tinh dầu phương pháp GC/MS 21 2.3 Phương pháp chiết, tách và xác định TPHH các dịch chiết từ thân rễ Mẫu thân rễ nghệ trắng lấy huyện Tây Traø, tỉnh Quảng Ngãi vào tháng 01 năm 2011 Thân rễ nghệ trắng sau gọt vỏ, rửa cân 400g voû và kg nạc Đem xay phần nạc, lọc, ép thu dịch ép và phần bã + Phần dịch ép đặc lọc hút chân không thu phần bột và lít dịch nước Phần dịch nước cô cạn đến 300 ml sau đó đem chiết kiệt với dung môi n-hexan (chiết nhiều lần), cô đuổi dung môi thu 7,61g cao n-hexan, màu vàng đậm + Phần bã sau lọc ép sấy khô tủ sấy nhiệt độ 60 0C 30h, thu 500g bã khô Cho 500g bã khô vào túi vải và cho vào bình chứa thủy tinh Rót dung môi metanol vào bình ngập bề mặt lớp bột Giữ yên nhiệt độ phòng khoảng 72 Sau đó, dung dịch chiết lọc ngang qua tờ giấy lọc Tiếp theo, rót dung môi vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm lần để chiết kiệt mẫu Các dịch chiết gom chung lại, thu hồi dung môi máy cất quay hút chân không, cô đuổi dm đến kiệt thu cao metanol Cao metanol hòa tan vào 400ml nước cất Chiết dung dịch thu với dm n-hexan kiệt (chiết nhiều lần) Phần dung dịch n-hexan đem lọc, cô đuổi dm thu dịch cô Phần dung dịch nước sau đã chiết kiệt với dm n-hexan, tiếp tục chiết kiệt với dm etylaxetat (chiết nhiều lần) Phần dung dịch etylaxetat đem lọc, cô đuổi dm thu dịch cô Phần dung dịch còn lại tiếp tục chiết với butanol (chiết nhiều lần) kiệt Cô đuổi dm thu dịch cô Các dịch chiết đem cô quay áp suất giảm trên bếp cách thủy nhiệt độ 600C thu các cao tương ứng (cao n-hexan, cao etylaxetat, cao butanol) + Cao metanol 65,57g, màu tím đen + Cao n-hexan 36,69g, màu vàng đậm + Cao etylaxetat 17,78g màu tím + Cao butanol 9,84g, màu đen Quy trình chiết, tách và xác định TPHH dịch chiết trình bày tóm tắt hình 2.2 22 kg thân rễ tươi 400g voû Chưng cất lôi nước GC/ MS Tinh dầu 6kg nạc xay nhuyễn, lọc, ép Xác định TPHH Dịch ép Bã Lọc hút Sấy chân 600C không Ngâm Dịch metanol Lọc, cô Cao metanol đuổi dm Thêm nước dmdung môi Chiết với nhexan (chiết nhiều lần) Dịch nước còn lại Chiếtvới etylaxetat nước Dịch n- Chiết với nhexan hexan (chiết nhiều SKC/S lần) Dịch n- KBMXác định hexan TPHH Dịch etyl GC/ axetat MS Xác định TPHH GC/ (chiết nhiều lần) MS Dịch nước Xác định còn lại TPHH Chiết với butanol (chiết nhiều Bột Dịch butanol Thử hoạt tính sinh học lần) Dịch nước còn lại boû Hình 2.2 Quy trình chiết, tách và xác định TPHH dịch chiết 23 2.4 Phân lập và xác định cấu trúc các cấu tử tách 2.4.1 Phân lập các cấu tử Cấu tử từ dịch chiết n- hexan Lấy 7g cao n-hexan tiến hành SKC silicagel F 540 (100g), cỡ hạt 40-60  m, sản xuất Merk, đường kính cột  =3cm, chiều cao cột d= 80 cm, chiều cao silicagel d'=35cm với dung môi rửa giải là n-hexan : etyl axetat với tỉ lệ tăng dần 98:2 (0,6 lit)→90:10 (0,8 lit)→85:15 (1,4 lit)→80:20 (1 lit)→75:15 (0,4 lit) Hứng dịch rửa giải vào các lọ với dung tích 15 ml Theo dõi quá trình sắc ký SKC sắc ký bảng mỏng (SKBM) và nhập lọ giống lại thu 12 phân đoạn (Theo hình 2.3) H1-H6, màu tím đen , sánh H7-H18, màu tím, sánh H19-H32, màu tím , sánh H33-H37, màu vàng nâu, sáng H38-H47, màu nâu, sáng Cao n-hexan (7 gam) H48-H69, màu tím, sánh H70-H79, màu vàng sáng, sánh H80-H92, màu vàng H93-H116, màu vàng sánh H117-H155, màu vàng sánh H156-H165, màu vàng H166-H179, màu vàng Hình 2.3 Kết sắc ký cột cao n-hexan 24 Từ phân đoạn H48-H69 sau cô đuổi dung môi xuất tinh thể trắng ngà, hút dịch chiết ra, phần tinh thể làm và kết tinh lại n- hexan thu tinh thể, kí hiệu THONG-NT 2.4.2 Xác định cấu trúc các cấu tử tách Xác định cấu trúc các cấu tử tách các phương pháp phổ: MS, IR, UV, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HMBC, HSQC 2.5 Thử hoạt tính sinh học Thử hoạt tính sinh học các dịch chiết và các cấu tử tách trên số chủng vi khuẩn phòng Thử hoạt tính sinh học, Viện Hóa học Việt Nam Hoạt tính kháng Vi sinh vật kiểm định tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh các mẫu chiết thực trên các phiến vi lượng 96 giếng (96well microtiter plate) theo phương pháp đại Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane, L., & Kandel (1996) Các chủng vi sinh vật kiểm định: - Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923) - Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212) Staphylococcus aureus (ATCC 12222) - Nấm sợi: Aspergillus niger (439) Fusarium oxysporum (M42) - Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754) Saccharomyces cerevisiae (SH 20) Chứng dương tính: + Ampicilin cho vi khuẩn Gr (+) + Tetracylin cho vi khuẩn Gr (-) Kháng sinh pha DMSO 100% với nồng độ thích hợp: Ampicilin: 50nM; Tetracylin: 10mM; Nystatin: 0.04mM Chứng âm tính: Vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử 25 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: - Môi trường trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth (SDB)Sigma cho nấm men và nấm mốc Vi khuẩn môi trường Tripcase Soya Broth (TSB) – Sigma - Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Myco phil (Difco, Mỹ) cho nấm (xem P1, P2 phụ lục) 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định tên khoa học Mẫu thực vật cây nghệ trắng thu hái xã Trà Phong, huyện Tây Traø, tỉnh Quảng Ngãi đã giám định nhà giáo ưu tú : Đỗ Xuân Cẩm, nguyên giảng viên trường Đại học Nông lâm Huế, giáo viên thỉnh giảng Đại học Huế, Qui Nhơn, Tây Nguyên, chuyên gia tư vấn bảo vệ môi trường và phát triển bền vững Kết giám định: Mẫu thực nghiệm có vị trí phân loại sau: a Ngành : Ngọc lan - Magnoliophyta (Hạt kín - Angiospermatophyta) b Lớp : Hành - Liliopsida (Một lá mầm - Monocotyledones) c Bộ : Gừng - Zingiberales d Họ : Gừng - Zingiberaceae e Chi : Nghệ – Curcuma f Loài : Nghệ trắng, Nghệ rừng, Mơ gan trắng Willd Turmeric, Yellow Zedoaria Curcuma aromatica Salisb Kết giám định đã xác định mẫu có tên khoa học là Curcuma aromatica Salisb (Xem P18, phụ lục) Hình 3.1 Một số ảnh thân rễ và hoa cây nghệ trắng 27 3.2 Tinh dầu thân rễ Nghệ trắng Quảng Ngãi 3.2.1 Xác định hàm lượng tinh dầu *Tinh dầu vỏ thân rễ Bảng 3.1 Hàm lượng tinh dầu vỏ thân rễ nghệ trắng Tháng 01/2011 Hàm lượng (ml/g) 4,0.10-3 28 Màu sắc Tím 3.2.2 TPHH tinh dầu vỏ thân rễ nghệ trắng thu phương pháp chưng cất Từ kết sắc ký đồ GC/MS tinh dầu vỏ thân rễ nghệ trắng thấy xuất 15 cấu tử, gồm Camphene (10.019%), Camphor (16.369%), Isoborneol(6.129%), Germacren D, Longiverbenone (31.908%), Borneol (4.790%)… Như cấu tử chiếm nhiều là Longiverbenone Bảng 3.2 Thành phần hóa học tinh dầu vỏ thân rễ nghệ trắng thu phương pháp chưng cất STT Thời gian lưu Tỷ lệ % Cấu tử 5.827 1.860 1R-.alpha.-Pinene 6.191 10.019 Camphene 6.878 2.855 Bicyclo[3.1.1]heptane, 6,6-dimethyl-2-methylene-, (1S)- or (-).beta.-Pinene 8.202 3.336 (+)-(R)-Limonene 11.262 16.369 Camphor, (1R,4R)-(+)6 11.536 6.129 Isoborneol 11.733 4.790 Borneol, (1S,2R,4S)-(-)8 15.007 1.625 delta.-Elemene 15.904 2.804 beta.-Elemene, (-)10 16.424 1.340 beta.-Caryophyllen 11 17.476 2.164 Germacrene D 12 17.699 7.084 5-Isopropenyl-3,6-dimethyl-6-vinyl-4,5,6,7tetrahydro-1-benzofuran 13 19.059 1.554 Germacrene B 14 22.557 6.164 Germacron 15 24.528 31.908 Longiverbenone 29 Hình 3.2 Sắc ký đồ GC/MS tinh dầu vỏ thân rễ nghệ trắng 30 3.2 TPHH dịch chiết n-hexan thân rễ nghệ trắng * Từ kết sắc ký đồ GC/MS dịch chiết n-hexan dịch nước thân rễ nghệ trắng thấy xuất 13 cấu tử, gồm Camphor (1.560%), delta.1-Testosterone (45.218%), β- Elemene (5.970%), Borneol (1.423%), Germacrene B (1.889%), Germacron (2.722%), Longiverbenone (12.988%); Benzofuran, 6-ethenyl-4,5,6,7tetrahydro-3,6-dimethyl-5-isopropenyl, trans-(20.028%) Như cấu tử chiếm nhiều là delta.1-Testosterone Bảng 3.3 TPHH dịch chiết n - hexan dịch nước thân rễ nghệ trắng STT Thời gian lưu Tỷ lệ % 11,282 1.560 11,552 1.423 15,020 1.056 15,918 5.970 16,450 1.673 16,574 1.889 17,614 1.414 17,718 20.028 10 11 12 20,081 22,578 24,548 25,627 45.218 2.722 12.988 1.793 Cấu tử (1R,4R)-(+)Camphor Borneol δ-Elemene β- Elemene α-Bisabolene Germacrene B (+)-β-Selinene Benzofuran, 6-ethenyl-4,5,6,7-tetrahydro-3,6dimethyl-5-isopropenyl, trans.delta.1-Testosterone Germacron Longiverbenone Acetic acid, 6-(1-hydroxymethyl-vinyl)-4,8adimethyl-3-oxo-1,2,3,5,6,7,8,8a- 13 25,691 2.266 octahydronaphthalen-2-yl-ester Pyrano[4,3-a]phenanthren-8-ol-3-one, 1,4,4a,4b,5,6,7,8,9,9a,9b,10,11,11a-tetradecahydro10a,12a-dimethyl-1-[3-furanyl] 31 Hình 3.3 sắc ký đồ GC/MS dịch chiết n - hexan dịch nước thân rễ nghệ trắng * Từ kết sắc ký đồ GC/MS dịch chiết n - hexan bã thân rễ nghệ trắng thấy xuất 14 cấu tử, gồm (-)-.beta.-Elemene (11.462%), Camphor (2.283%), delta.1-Testosterone (31.360%), Longiverbenone (17.978%), .delta.-Elemene (3.596%), Germacrene D (4.243%); Benzofuran, 6-ethenyl-4,5,6,7-tetrahydro-3,6dimethyl-5-isopropenyl-,trans (14.186%) Như cấu tử chiếm nhiều là delta.1Testosterone Bảng 3.4 TPHH dịch chiết n - hexan từ bã thân rễ nghệ trắng STT Thời gian lưu Tỷ lệ % 11.283 2.283 11.553 2.162 11.750 1.177 15.022 3.596 10 15.919 16.439 16.576 17.496 17.616 17.720 11.462 2.258 1.029 4.243 2.432 14.186 11 12 13 14 19.082 20.084 22.583 24.550 2.534 31.360 3.301 17.978 Cấu tử (+)-Camphor Isoborneol Borneol, (1S,2R,4S)-(-)Delta.-Elemene or 3-Isopropenyl-1-isopropyl-4methyl-4-vinyl-1-cyclohexan (-)-.beta.-Elemene Beta.-Caryophyllen Germacrene B Germacrene D Eudesma-4(14),11-diene Benzofuran, 6-ethenyl-4,5,6,7-tetrahydro-3,6dimethyl-5-isopropenyl-,trans gamma.-Elemene Delta.1-Testosterone Germacrone Longiverbenone 32 Hình 3.4 Sắc ký đồ GC/MS dịch chiết n-hexan từ bã thân rễ nghệ trắng *Nhận xét: Trong TPHH dịch chiết n- hexan từ bã thân rễ nghệ trắng thấy xuất cấu tử delta.1-Testosterone với hàm lượng lớn 33 Trong thể sống, lượng nhỏ delta.1-Testosterone có khả kích thích tăng trưởng tuyến tiền liệt, túi tinh .delta.1-Testosterone làm tăng trọng lượng gan [32] 3.3 TPHH dịch chiết etylaxetat từ bã thân rễ nghệ trắng Từ kết sắc ký đồ GC/MS dịch chiết n-hexan dịch nước thân rễ nghệ trắng thấy xuất cấu tử, gồm 3-cyclopentene-1-acetaldehyde-2,2,3-trimetyl (3.06%),.delta.1-testosterone(21.79%),1-heptatriacotanol(4.71%), isovelleral (41.11%), 2-pentanone, 3-benzyliden (3.42%), Germacrone (6.68%), Isolongifolen-5-one (19.23%); Như cấu tử chiếm nhiều là isovelleral Bảng 3.5 Thành phần hóa học dịch chiết etylaxetat từ bã thân rễ nghệ trắng STT Thời gian lưu 28,324 30,996 33,159 34,983 35,391 37,759 41,832 Tỷ lệ % 3,06 21,79 6,68 4,71 41,11 3,42 19,23 Cấu tử 3-cyclopentene-1-acetaldehyde-2,2,3-trimetyl delta.1-testosterone Germacrone 1-heptatriacotanol Isovelleral 2-pentanone, 3-benzyliden Isolongifolen-5-one 34 Hình 3.5 Sắc ký đồ GC/MS dịch chiết etylaxetat từ bã thân rễ nghệ trắng 3.4 Xác định cấu trúc các cấu tử tách Cấu tử tách từ dịch chiết n-hexan tưø bã thân rễ nghệ trắng THONG-NT là chất rắn vô định hình, màu trắng ngà, tan tương đối tốt etyl axetat, ít tan n-hexan nhiệt độ phòng, tan nhiều n-hexan đun nóng, không màu trên UV 254nm, SKBM cho R f=0,53 với hệ dm n-hexan: etyl axetat = : 2, với thuốc thử vanilin: MeOH: CH3COOH cho màu vàng nâu Phổ khối ESI-MS (+) cho mảnh ion giả phân tử m/z = 247,2 Các phổ 13C, DEPT 90, 135 cho phép khẳng định phân tử THONG-NT có nhóm metyl δ 10,2; 15,1; 15,7; nhóm metilen δ 24,6; 38,0; 41,9; nhóm metin δ 66,5; 131,2; 138,0 và cacbon bậc IV số đó có nhóm cacbonyl 192,2 Trong phổ 1H-NMR xuất tín hiệu proton metyl δ 1,34; 1,60; 2,11 và proton nhóm metilen khoảng 1,29-3,75 Ngoài ra, chúng ta quan sát tín hiệu singlet proton metin 3,81; doublet tù proton olefin 5,48 và singlet khác 7,09 ppm Từ các kiện phổ này, có thể khẳng định chất rắn THONG-NT có công thức phân tử C15H18O3 Cấu trúc hoàn chỉnh hợp chất xác định dựa trên việc phân tử các liệu phổ 2D-NMR mà chủ yếu là phổ HMBC, COSYGP, NOESY 35 Trong phổ COSY, proton olefin (H-1) có tương tác rõ ràng với proton nhóm metilen (H-2a, 2b) và với proton metyl 1,60 (H-15) Proton metilen 2,52 (H-2a) có tương tác COSY với proton nhóm metilen khác 1,29 (H-3b) Điều này chứng tỏ nhóm metilen liên kết trực tiếp với và liên kết với nguyên tử có chứa nối đôi khác theo kiểu –CH2-CH2-CH= Sự có mặt nhóm metin (δ H 3,81 (H-5); δC 66,5 (C-5)) và cacbon bậc IV δC 63,9 (C-4) xác nhận tồn nhóm epoxi phân tử H-5 có tương tác HMBC với C-4 và C-6 nhóm cacbonyl Proton metyl 1,34 (H-14) có tương tác HMBC với C-3, C4, C5 C-14 phải gắn trực tiếp vào C-4 Hai proton metilen 3,70; 3,75 (H-9) có tương tác với cacbon bậc IV 122,2 (C-7); 157,1 (C-8); 131,0 (C-10); cacbon metin 131,2 (C-1) và nhóm metyl 15,7 (C-15) Ngoài proton nhóm metyl H- 15 1,60 có tương tác HMBC với C-1, 8, 9, 10 C-15 phải đính vào C-10 Proton 7,09 (H-12) có tương tác HMBC với C-7, Căn độ dịch chuyển C-8, C-12 và H-12 có thể suy đoán C-8 và C-12 cùng liên kết trực tiếp với cùng nguyên tử O Mặt khác, proton nhóm metyl cuối cùng 2,11 (H-13) liên hệ với C-7, 8, 11, 12 chứng tỏ C-13 phải đính trực tiếp vào C-11 Tương tác COSY, NOESY H-12 và H-13 xác nhận điều này H-1 có tương tác NOESY với H-2, H-15 có tương tác với H-2a, 9b Nhưng H-1 với H-15 không có tương tác phổ NOESY chứng tỏ nối đôi C1=C10 có cấu hình (Z) H-5 tương tác NOESY với H-3b còn H-14 tương tác H-2a cho phép xác định cấu hình các nguyên tử cacbon bất đối xứng C4, là (4S, 5R) Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR THONG-NT N0 δaC (ppm) 131,2 (d) 24,6 (t) 38,0 (t) 63,9 (s) 66,5 (d) 192,2 (s) δbH (ppm) HMBC COSY NOESY (HC) (HH) H-2a, 2b, (HH) H-2a, 2b, 5,48 (1H; brd; 11,5 Hz) C-9, 15 2,52 (1H; dq; 3,5; 12 Hz) (H-2a) 2,23 (1H; brd; 12,5 Hz) (H-2b) 2,30 (1H; td; 3,5; 13 Hz) (H-3a) 1,29 (1H; dt; 4; 13,5 Hz) (H-3b) C-1, 3, 10 C-1, 10 C-1, 4, C-2, 14 3,81 (1H; s) C-3, 4, 36 9b, 15 9a, 9b H-1, 2b, 3b H-2b, 14, 15 H-1, 2a H-1, 2a H-3b H-3b H-2a, 3a H-1, 3a, H-3b 122,2 (s) 157,1 (s) 3,75 (1H; d; 16,5 Hz) (H-9a) 41,9 (t) 3,70 (1H; t; 16,5 Hz) (H-9b) 10 11 12 131,0 (s) 123,2 (s) 138,0 (d) 7,09 (1H; s) 13 10,2 (q) 2,11 (3H; s) 14 15 15,1 (q) 15,7 (q) 1,34 (3H; s) 1,60 (3H; s) C-1, 7, 8, 10, 15 C-1, 7, 8, 10, 15 C-7, 8, 11 C-7, 8, 11, 12 C-3, 4, C-1, 8, 9, 10 37 H-9b, 15 H-1, 9b H-1, 9a, 15 H-1, 9a, 15 H-13 H-13 H-12 H-12 H-1, 9a, 9b H-2a H-2a, 9b a đo CDCl3, 125 MHz; b đo CDCl3, 500 MHz; TMS là chất chuẩn nội H H H H O H H3C H H C H H O H3 C CH3 O Hình 3.6 Các tương tác HMBC chính THONG-NT (Zederone) H H H H O H H3C H H H H C O H3C O CH3 NOESY COSY Hình 3.7 Các tương tác COSY, NOESY chính THONG-NT (Zederone) Ngoài ra, liệu phổ chất rắn THONG-NT phù hợp với liệu phổ Zederone công bố [21] 38 Bảng 3.7 So sánh liệu phổ NMR THONG-NT với ZEDERONE [21] N0 δaC (ppm) 131,2 (d) 24,6 (t) 38,0 (t) 63,9 (s) 66,5 (d) 192,2 (s) 122,2 (s) 157,1 (s) 41,9 (t) 10 11 12 13 14 15 131,0 (s) 123,2 (s) 138,0 (d) 10,2 (q) 15,1 (q) 15,7 (q) NT4869 ZEDERONE δbH (ppm) δaC (ppm) δbH (ppm) 5,48 (1H; brd; 11,5 Hz) 131,4 (d) 5,49 (1H; dd; 12; Hz) 2,52 (1H; dq; 3,5; 12 Hz) (H-2a) 2,53 (1H; m) 24,9 (t) 2,23 (1H; brd; 12,5 Hz) (H-2b) 2,25 (1H; m) 2,30 (1H; td; 3,5; 13 Hz) (H-3a) 2,31 (1H; dt; 13; 3,5 Hz) 38,2 (t) 1,29 (1H; dt; 4; 13,5 Hz) (H-3b) 1,29 (1H; m) 64,2 (s) 3,81 (1H; s) 66,8 (d) 3,81 (1H; s) 192,4 (s) 122,5 (s) 157,3 (s) 3,75 (1H; d; 16,5 Hz) (H-9a) 3,77 (1H; d; 16,0 Hz) 42,1 (t) 3,70 (1H; t; 16,5 Hz) (H-9b) 3,69 (1H; d; 16,0 Hz) 131,3 (s) 123,5 (s) 7,09 (1H; s) 138,3 (d) 7,10 (1H; s) 2,11 (3H; s) 10,5 (q) 2,12 (3H; s) 1,34 (3H; s) 15,4 (q) 1,34 (3H; s) 1,60 (3H; s) 16,0 (q) 1,61 (3H; s) 39 a đo CDCl3, 125 MHz; b đo CDCl3, 500 MHz; TMS là chất chuẩn nội Kết hợp tất lập luận trên, chúng tôi khẳng định chất rắn phân lập chính là Zederone O 10 15 12 O 14 O 11 13 Hình 3.8 Cấu trúc chất THONG-NT (Zederone) Kết luận này phù hợp với tài liệu nghiên cứu tác giả Lương Sĩ Bỉnh [1] , [15] và tài liệu nghiên cứu nước ngoài [21] 3.6 Kết thử hoạt tính sinh học ( xem P2, P3 phụ lục) - Các chủng kiểm định hoạt hóa và pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland tiến hành thí nghiệm - Kết đọc sau ủ các phiến thí nghiệm tủ ấm 37 oC/24 cho vi khuẩn và 30oC/48 nấm sợi và nấm men Kết dương tính là nồng độ mà đó không có vi sinh vật phát triển Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra có giá trị CFU<5 - Kết hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hai mẫu thô là cao Butanol (NB) và cao n-hexan (NH) cho thấy : + Mẫu NB không biểu hoạt tính kháng VSVKĐ + Mẫu NH biểu hoạt tính kháng VSVKĐ vi khuẩn Gr(+): S.aureus và nấm mốc F oxysporum 40 KẾT LUẬN Qua các kết nghiên cứu TPHH thân rễ nghệ trắng (Curcuma aromatica Salisb.) huyện Tây Traø, tỉnh Quảng Ngãi, chúng tôi thu số kết sau: Vỏ thân rễ Hàm lượng tinh dầu vỏ thân rễ nghệ trắng là 0,2675% theo khối lượng Mẫu tinh dầu có đặc điểm là dịch sánh, nhẹ nước, có mùi thơm dễ chịu TPHH theo GC/MS chủ yếu gồm các cấu tử: Camphene (10.019%), Camphor (16.369%), Isoborneol (6.129%), Germacren D, Longiverbenone (31.908%), Borneol (4.790%)… Như cấu tử chiếm nhiều là Longiverbenone Phần chiết n-hexan từ dịch nước thân rễ TPHH theo GC/MS chủ yếu gồm các cấu tử: Camphor (1.560%), delta.1Testosterone (45.218%), β- Elemene (5.970%), Borneol (1.423%), Germacrene B (1.889%), Germacron (2.722%), Longiverbenone (12.988%); Benzofuran, 6ethenyl-4,5,6,7-tetrahydro-3,6-dimethyl-5-isopropenyl, trans-(20.028%) Như cấu tử chiếm nhiều là delta.1-Testosterone Phần chiết n-hexan từ bã thân rễ nghệ trắng - TPHH theo GC/MS chủ yếu gồm các cấu tử: (-)-.beta.-Elemene (11.462%), Camphor (2.283%), .delta.1-Testosterone (31.360%), Longiverbenone (17.978%), delta.-Elemene (3.596%), Germacrene D (4.243%); Benzofuran, 6ethenyl-4,5,6,7-tetrahydro-3,6-dimethyl-5-isopropenyl-,trans (14.186%) Như cấu tử chiếm nhiều là delta.1-Testosterone - Kết thử hoạt tính sinh học: Mẫu NH biểu hoạt tính kháng VSVKĐ vi khuẩn Gr(+): S.aureus và nấm mốc F oxysporum Phần chiết etylaxetat từ bã thân rễ nghệ trắng: TPHH theo GC/MS chủ yếu gồm các cấu tử: 3-cyclopentene-1-acetaldehyde2,2,3-trimetyl (3.06%),.delta.1-testosterone(21.79%),1-heptatriacotanol(4.71%), isovelleral (41.11%), 2-pentanone, 3-benzyliden (3.42%), Germacrone (6.68%), Isolongifolen-5c-one (19.23%); Như cấu tử chiếm nhiều là isovelleral Phần chiết butanol từ bã thân rễ nghệ trắng Kết thử hoạt tính sinh học: mẫu NB không biểu hoạt tính kháng VSVKĐ 41 Bằng phương pháp SKC trên silicagel kết hợp với SKBM và các phương pháp kết tinh lại đã tách hợp chất hữu từ các dịch chiết các dm hữu khác Bằng các phương pháp phổ IR, 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC… đã xác định cấu trúc hợp chất tách là: Zederone * Kiến nghị và đề xuất - Tiếp tục nghiên cứu TPHH dịch chiết n- hexan thân rễ nghệ trắng (Curcuma aromatica Salisb.) Quảng Ngãi, đặc biệt là tách và xác định cấu trúc các cấu tử có hàm lượng lớn delta.1-Testosterone, Isovelleral - Khảo sát điều kiện tối ưu kháng nấm, kháng khuẩn của nghệ trắng (Curcuma aromatica Salisb.) Quảng Ngãi nhằm giải thích tác dụng chữa bệnh đóng góp vào vườn thuốc y học cổ truyền 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIEÁNG VIEÄT Lương Sĩ Bỉnh (1987), Đóng góp vào việc nghiên cứu hóa học tinh dầu số loài nghệ Việt Nam, Luận án Phó Tiến sĩ Hóa học, Hà Nội Võ Văn Chi (2003), Từ điển Thực vật thông dụng, Nxb Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội Trịnh Đình Chính, Nguyễn Thị Bích Tuyết (2003), Giáo trình hợp chất tự nhiên, Giáo trình cho Học viên Cao học, trường ĐHSP ĐH Huế Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1995), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, trường Đại học Y-TP.HCM Phan Minh Giang, Văn Ngọc Hướng, Phan Tống Sơn (1998), "Sesquiterpenoid từ thân rễ nghệ xanh ("VAR B") (Curcuma Aff.Aeruginosa Roxb.) Việt Nam", Tạp chí Hóa học, 36(3), tr 67-72 Phan Minh Giang, Văn Ngọc Hướng, Phan Tống Sơn (1998), “Đóng góp vào việc nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học phần chiết thân rễ nghệ trắng ( Curcuma aromatica Salisb.) Việt Nam”, Hội nghị hóa học toàn quốc lần thứ III, 1, tr.106-108 Phan Minh Giang, Văn Ngọc Hướng, Phan Tống Sơn (1999), “Nghiên cứu các sesquiterpenoid từ các phần chiết thân rễ nghệ trắng (Curcuma aromatica Salisb.) Việt Nam”, Tạp chí Hóa học, 37(1), Tr.57-59 Phan Minh Giang, Nguyễn Thị Tuệ, Đào Quốc Hùng, Phan Tống Sơn (2007), “ Nghiên cứu phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học các sesquitecpenoit từ thân rễ nghệ xanh (Curcuma aff.aeruginosa Roxb.)”, Tạp chí Dược học, (369), tr 22-25 Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam (quyển 3), NXB Trẻ, Tp.HCM 10 Văn Ngọc Hướng, Phan Minh Giang, Phan Tống Sơn (1998), “Sesquiterpenoid từ thân rễ nghệ đen (Curcuma zedoaria (Berg.) Roscoe) Việt Nam”, Tạp chí Hóa học, 36(4), tr.70-73 11 Lê Quý Ngưu, Trần Thị Như Đức (1999), Dược tài Đông y, tr 294-295, 326-328, NXB Thuận Hóa, Huế 43 12 Nguyễn Thị Kim Phụng (2001), Phương pháp cô lập hợp chất hóa học, Đại học Quốc Gia TP.HCM 13 Hoàng Thị Sản (2003), Phân loại thực vật, NXB Giáo dục Hà Nội 14 Phan Tống Sơn, Phan Minh Giang (1997), “Sesquiterpenoid từ thân rễ nghệ đen (Curcuma zedoaria Rosc.) Việt Nam”, Tạp chí Hoá học và công nghệ hoá chất, (4), tr.9-11 15 Phan Tống Sơn, Văn Ngọc Hướng, Lương Sĩ Bỉnh (1989), “Về TPHH tinh dầu nghệ trắng (Curcuma aromatica Salisb., Zingiberaceae) Việt Nam”, Tạp chí Hóa học, 27(3), tr.18-19 16 Phạm Thiệp, Lê Văn Thuần, Bùi Xuân Chương (2000), Cây thuốc, bài thuốc và biệt dược, NXB Y học, Hà Nội 17 Trung tâm thông tin khoa học công an, Viện chiến lược và khoa học công an (2004), Thuốc hay quanh ta, Hà Nội 18 Nguyễn Thị Bích Tuyết (2001), Nghiên cứu TPHH tinh dầu số cây thuộc chi Curcuma và chi Kaempferia (họ Zingiberaceae) Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Hóa học, Hà Nội TIEÁNG ANH 19 Le Quy Bao,Truong Thi Thu, Tran Dinh Thang and Nguyen Xuan Dung (2004), “The easily volatile components from zhizome of curcuma zedoria Rosc cultivated in Nghe An and Ha Tinh provinces”, Journal of Pharmaceutical, (11) pp 9-11 20 Hideo Etoh, Takeyoshi Kondoh, Nohoko Toshika, Kimio Sugiyama, Hajime Ishikawa and Hitoshi Tanaka (2003), “9-oxo-neoprocurcumenol from curcuma aromatica (Zingiberaceae) asan attachment inhibitor against the Blue Musel Mytilus edulis galloprovincials”, Biosci Biotechol Biochem., 67(4), pp 911-913 21 M.Golam KADER, M.Rowshanul HABIB, Fajana NIKKON, Tanzima YEASMIN, Mohammad A RASHID (2010), Zerderone from the rhizomes of Zingiber zerumbet and its anti-staphylococcal Activity, (9), pp 63-68, Sociedad Latioamericana de Fitoquismica, Chile 22 Klaus Kloppstech (2004), Genetic diversity of the genus Curcuma in Bangladesh and further biotechnological approaches for in vitro regeneration and long- term conservation of C Longa germplasm 44 23 Singh Gurdip, Om Prakash Singh, Y R Prasad, M P Lampasona & C Catalan (September 2003), “Chemical and biocidal investigations on rhizome volatile oil of Curcuma zedoaria Rosc - Part 32”, Indian Journal of Chemical Technology (10), pp 462-465 24 Jen Kun Lin and Shiau Lin (2001), “Mechanisms of Cancer Chemoprevention by Curcumin”, Proc Natl Sci Counc ROC(B) 25(2), pp 59-66 25 Isao Louno and Nobusuke Kawano (1985), Structure of a guaiane from curcuma zedoaria, phytochemistry, 24(8), pp 1845-1847 26 H Makabe, N Maru , A Kuwbara , T Kamo and M Hirota , Antiinflammatory sesquiterpenes from Curcuma zedoaria, sciences of Function Food, Graduate School of Ariculture, Shinchu University, Japan 45