Đề tài: Nghiên cứu thử nghiệm quy trình nhân giống in vitro hoa đồng tiền kép

PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với sự phát triển không ngừng của xã hội, nhu cầu của con người cũng ngày một tăng lên, trong đó có cả nhu cầu thưởng thức cái đẹp và những giá trị tinh thần, thẩm mỹ. Hoa một sản phẩm của tạo hoá dành cho con người đã đáp ứng được yêu cầu đặc biệt ấy. Hoa không chỉ biểu thị cho nét đẹp tinh thần của mỗi con người mà còn là thước đo sự phát triển xã hội. Chính vì vậy, hiện nay ngành sản xuất hoa tươi đang trở thành một ngành mang lại lợi nhuận đáng kể cho người trồng hoa, song để đáp ứng được nhu cầu và thị hiếu ngày càng cao của người tiêu dùng thì hoa không chỉ đẹp mà còn cần phải phong phú và đa dạng về chủng loại, màu sắc. Việt Nam là một nước có nghề trồng hoa từ lâu đời và có điều kiện thiên nhiên ưu đãi cho ngành trồng hoa. Trong những loại hoa có mặt ở nước ta, đồng tiền là một loài hoa đẹp, thích nghi tốt với khí hậu nhiệt đới, đồng thời đây cũng là loại hoa lưu niên, có giá trị kinh tế cao do ra hoa quanh năm, độ bền hoa cắt cao và rất được ưa chuộng tại thị trường trong nước và trên thế giới. Song ngành trồng hoa đồng tiền cũng như ngành sản xuất hoa nói chung của Việt Nam còn gặp nhiều khó khăn, chủ yếu do giống bản địa thường cho hoa nhỏ, màu sắc kém đa dạng, dễ bị nhiễm bệnh khi trồng trong điều kiện khí hậu nóng ẩm, nhanh thoái hoá giống và phải nhập giống từ Hà Lan, Trung Quốc với giá thành cao. Vì vậy, vấn đề lớn đặt ra hiện nay là nhân nhanh được những giống hoa ưu việt, đáp ứng nhu cầu, thị hiếu của người tiêu dùng và phục vụ xuất khẩu. Để giải quyết vấn đề trên, một hướng mới cho ngành sản xuất hoa là áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong việc nhân giống hoa đồng tiền, qua đó cung cấp hàng triệu cây giống chất lượng tốt cho thị trường, đưa ngành sản xuất hoa Việt Nam trở thành một ngành sản xuất hàng hoá đem lại giá trị kinh tế cao. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài Nghiên cứu thử nghiệm quy trình nhân giống in vitro hoa đồng tiền kép MỤC ĐÍCH : Thử nghiệm quy trình nhân nhanh hoa đồng tiền nhập nội, đáp ứng nhu cầu cây giống cho sản xuất đại trà và phục vụ công tác bảo tồn giống. YÊU CẦU: Thử nghiệm ảnh hưởng của hoá chất vô trùng đến khả năng nuôi cấy Thử nghiệm ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh mẫu Thử nghiệm ảnh hưởng của các giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây con PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1. Khái niệm và vai trò của nuôi cấy mô tế bào thực vật Nhân giống vô tính là hình thức nhân giống thông qua các cơ quan dinh dưỡng (thân, lá, vỏ, củ...) bao gồm các phương pháp giâm cành, chiết cành, mắt ghép và nuôi cấy in vitro. Trong đó nuôi cấy in vitro được coi là phương pháp hữu hiệu nhất. Nhân giống vô tính in vitro được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chồi ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện vô trùng của ống nghiệm 4 Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kĩ thuật nhân giống vô tính cổ điển như giâm, chiết, ghép tách dòng một kĩ thuật tiến bộ với những ưu điểm như: Tốc độ nhân giống cao từ 33 đến 1012 một năm 4, ví dụ trong 1 ml dung dịch môt trường có từ 100.000 1000.000 tế bào nuôi nêú ở điều kiện thích hợp mỗi tế bào có thể chuyển hóa tạo phôi và mọc cây, từ 1ml dung dịch môi trường có thể taọ ra cả rừng cây 1; Chủ động sản xuất, không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa vụ; Có khả năng công nghiệp hóa cao do nuôi cấy trong điều kiện ổn định về môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng, do đó có thể công nghiệp hóa hoàn toàn từ khâu nhân cây giống với số lượng lớn đến khi ươm trồng trong nhà lưới. 2.1.2. Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua một lịch sử phát triển lâu dài và được đánh dấu bằng những sự kiện chính sau: Năm 1902, Harberlandt lần đầu tiên đưa ra các lý thuyết và Schneider và Butschli (người mô tả chính xác quá trình phân chia tế bào) vào thực nghiệm nuôi cấy mô cây 1 lá mầm nhưng không thành công.1 Năm 1929 1933 lần lượt Bchumuker, Scheitter, Pfcifer và Lance thành công trong việc nuôi cấy một đoạn đầu mút rễ hoàn chỉnh. 4 Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một hooc môn thực vật đầu tiên thuộc nhóm Auxin có khả năng kích thích sự phát

PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với phát triển không ngừng xã hội, nhu cầu người ngày tăng lên, có nhu cầu thưởng thức đẹp giá trị tinh thần, thẩm mỹ Hoa- sản phẩm tạo hoá dành cho người đáp ứng yêu cầu đặc biệt Hoa không biểu thị cho nét đẹp tinh thần người mà thước đo phát triển xã hội Chính vậy, ngành sản xuất hoa tươi trở thành ngành mang lại lợi nhuận đáng kể cho người trồng hoa, song để đáp ứng nhu cầu thị hiếu ngày cao người tiêu dùng hoa khơng đẹp mà cịn cần phải phong phú đa dạng chủng loại, màu sắc Việt Nam nước có nghề trồng hoa từ lâu đời có điều kiện thiên nhiên ưu đãi cho ngành trồng hoa Trong loại hoa có mặt nước ta, đồng tiền lồi hoa đẹp, thích nghi tốt với khí hậu nhiệt đới, đồng thời loại hoa lưu niên, có giá trị kinh tế cao hoa quanh năm, độ bền hoa cắt cao ưa chuộng thị trường nước giới Song ngành trồng hoa đồng tiền ngành sản xuất hoa nói chung Việt Nam cịn gặp nhiều khó khăn, chủ yếu giống địa thường cho hoa nhỏ, màu sắc đa dạng, dễ bị nhiễm bệnh trồng điều kiện khí hậu nóng ẩm, nhanh thối hố giống phải nhập giống từ Hà Lan, Trung Quốc với giá thành cao Vì vậy, vấn đề lớn đặt nhân nhanh giống hoa ưu việt, đáp ứng nhu cầu, thị hiếu người tiêu dùng phục vụ xuất Để giải vấn đề trên, hướng cho ngành sản xuất hoa áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào việc nhân giống hoa đồng tiền, qua cung cấp hàng triệu giống chất lượng tốt cho thị trường, đưa ngành sản xuất hoa Việt Nam trở thành ngành sản xuất hàng hoá đem lại giá trị kinh tế cao Xuất phát từ thực tế đó, tiến hành nghiên cứu đề tài " Nghiên cứu thử nghiệm quy trình nhân giống in vitro hoa đồng tiền kép " MỤC ĐÍCH : -Thử nghiệm quy trình nhân nhanh hoa đồng tiền nhập nội, đáp ứng nhu cầu giống cho sản xuất đại trà phục vụ công tác bảo tồn giống YÊU CẦU: - Thử nghiệm ảnh hưởng hố chất vơ trùng đến khả nuôi cấy - Thử nghiệm ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả tái sinh mẫu - Thử nghiệm ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1 Khái niệm vai trò nuôi cấy mô tế bào thực vật Nhân giống vơ tính hình thức nhân giống thơng qua quan dinh dưỡng (thân, lá, vỏ, củ ) bao gồm phương pháp giâm cành, chiết cành, mắt ghép ni cấy in vitro Trong ni cấy in vitro coi phương pháp hữu hiệu Nhân giống vơ tính in vitro tiến hành ngun tắc cắt ni đoạn thân có mang chồi nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện vô trùng ống nghiệm [4] Phương pháp nhân giống in vitro bổ sung cho kĩ thuật nhân giống vơ tính cổ điển giâm, chiết, ghép tách dòng kĩ thuật tiến với ưu điểm như: Tốc độ nhân giống cao từ 33 đến 1012 năm [4], ví dụ ml dung dịch mơt trường có từ 100.000 - 1000.000 tế bào nuôi nêú điều kiện thích hợp tế bào chuyển hóa tạo phôi mọc cây, từ 1ml dung dịch môi trường taọ rừng [1]; Chủ động sản xuất, không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa vụ; Có khả cơng nghiệp hóa cao nuôi cấy điều kiện ổn định môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng, cơng nghiệp hóa hồn tồn từ khâu nhân giống với số lượng lớn đến ươm trồng nhà lưới 2.1.2 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật trải qua lịch sử phát triển lâu dài đánh dấu kiện sau: - Năm 1902, Harberlandt lần đưa lý thuyết Schneider Butschli (người mô tả xác q trình phân chia tế bào) vào thực nghiệm nuôi cấy mô mầm không thành công.[1] Năm 1929- 1933 Bchumuker, Scheitter, Pfcifer Lance thành công việc nuôi cấy đoạn đầu mút rễ hoàn chỉnh [4] - Năm 1934, Kogl lần xác định vai trò IAA, hooc mơn thực vật thuộc nhóm Auxin có khả kích thích phát triển tăng trưởng phân chia tế bào thực vật [1] - Năm 1939, Gautheret, Nobecourt White đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công thời gian dài từ mô tượng tầng, Nobetcourt nuôi cấy củ Cà rốt nhận phân bào tạo khối tế bào phân chia - Năm 1941, Overbeek cộng sử dụng nước dừa nuôi cấy phôi non cà rốt Patura - Năm 1955, Miller cộng phát minh cấu trúc sinh tổng hợp Kinetin cytokinin đóng vai trị quan trọng phân bào phân hóa chồi mơ ni cấy - Năm 1957, Skoog Miller tạo chồi từ mảnh mô thân thuốc đồng thời khám phá vai trò tỷ lệ nồng độ chất Auxin/ Cytokinin, nồng độ auxin/ nồng độ cytokinin < có xu hướng tạo chồi Ngược lại nồng độ auxin/ nồng độ cytokinin >1 mơ có xu hướng tạo rễ Tỷ lệ nồng độ auxin cytokinin thích hợp kích thích phân hóa chồi rễ, tạo hoàn chỉnh [1] - Năm 1958, Keinert Sterward tạo phơi hồn chỉnh từ tế bào tượng tầng tách từ cà rốt nuôi cấy dạng huyền phù [4] - Năm 1960, Morel thực bước ngoặt cách mạng sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhân nhanh loại địa lan cymbidim - Năm 1960, Cooking lần sử dụng enzim phân giải thành tế bào tạo số lượng lớn tế bào trần trồng khác [1] - Năm 1966, Guha cộng thành công nuôi cấy thể đơn bội cà độc dược từ bao phấn - Năm 1967- 1968, Nichkoi Nakato cộng tạo đơn bội từ bao phấn thuốc [3] - Năm 1971, Takeb tái sinh thành công thuốc từ tế bào trần - Năm 1972, Carlson cộng lần thực lai tế bào soma loài, tạo từ dung hợp tế bào trần loài thuốc Nicotiana glauca N langsdorfi [1] - Năm 1977, Chers lai thành công tế bào soma cà chua khoai tây [3] Từ năm 1977 đến nay, công nghệ tế bào thực vật có bước tiến vượt bậc với việc áp dụng công nghệ cao chọn tạo giống trồng như: đột biến tế bào soma, cứu phôi lai xa, dung hợp tế bào trần, tạo dịng kháng thể, ni cấy bao phấn, hạt phấn nhiều đối tượng trồng Chúng ta bước vào giai đoạn thứ tư nuôi cấy mô tế bào, giai đoạn nuôi cấy mô tế bào ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, sản xuất chất thứ cấp có hoạt tính sinh học nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao [4] 2.1.3 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật khái niệm chung cho tất kĩ thuật nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn vi sinh vật môi trường dinh dưỡng nhân tạo điều kiện vô trùng Cơ sở khoa học nuôi cấy mơ tế bào thực vật dựa tính tồn phân hoá, phản phân hoá tế bào Tính tồn tế bào thể “bất kỳ tế bào thể đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành hoàn chỉnh” [4] Sự phân hóa tế bào chuyển tế bào phơi sinh trở thành tế bào mơ chun hóa để đảm nhận chức sinh lý khác Ngược lại, phản phân hóa tế bào chuyển tế bào chuyên hóa trở lại phát triển thành phơi sinh có khả phân chia mạnh mẽ cho tế bào mà chất q trình hoạt hóa ức chế gen [4] Theo Ngơ Xn Bình (2000) [4] q trình nhân giống in vitro thường trải qua giai đoạn: Giai đoạn giai đoạn chuẩn bị tạo mẹ bệnh nuôi cấy khởi động Giai đoạn 2: Chọn mẫu cấy phù hợp cho việc tái sinh nhân nhanh chồi Khử mô nuôi cấy sau xác định mẫu cấy (HgCl 2, NaOCl, H2O2) Lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp để mẫu phát sinh chồi bất định phơi vơ tính Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi tái sinh để sản xuất với số lượng lớn thời gian ngắn Giai đoạn 4: Tạo hoàn chỉnh, chồi cảm ứng rễ, tạo hoàn chỉnh để đưa trồng vườn ươm Giai đoạn 5: Đưa vườn ươm, làm cho in vitro thích nghi với điều kiện thực nghiệm đồng ruộng 2.1.4 Các kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro Vấn đề chọn nguyên liệu ban đầu cho nhân giống quan trọng, khơng định thành cơng ban đầu mà q trình nhân giống Trên lấy nhiều phận khác để ni cấy, kĩ thuật nuôi cấy đa dạng Tùy theo mục đích khả ứng dụng mà người ta chọn phương pháp ni cấy thích hợp * Ni cấy phôi: Năm 1921, Dieterich đưa kết luận phơi ni cấy in vitro hồn tồn nảy mầm không qua giai đoạn ngủ nghỉ dựa sở nghiên cứu Tuy nhiên, mơi trường dinh dưỡng cho tạo phôi trưởng thành phơi non khác nhau, phơi non cần môi trường giàu dinh dưỡng [8] * Nuôi cấy mô quan tách rời Năm 1946, Wetmare chứng minh phận ni cấy gặp điều kiện thuận lợi [8] Với phận khác nhu cầu dinh dưỡng ni cấy khác Muốn trì sinh trưởng phát triển mơ quan ni cấy sau khoảng thời gian định mô phải cấy chuyển sang mơi trường thích hợp Ni cấy mơ quan tách rời thường ứng dụng để nghiên cứu môi trường dinh dưỡng phù hợp với phận khác cây, tạo mô sẹo nhân in vitro * Nuôi cấy mô phân sinh: Trong nuôi cấy mô phân sinh, người ta thường sử dụng mơ đỉnh chồi đỉnh cành có kích thước từ 0,1 mm đến mm Các mơ phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ mầm non, chồi hình thành cành non Nuôi cấy mô phân sinh thường sử dụng cho mục đích tạo vi rút, nhân giống in vitro tạo đa bội thông qua xử lý colchicin [7] * Nuôi cấy bao phấn: Nhiều kết nghiên cứu cho thấy hạt phấn nuôi cấy phát triển thành đơn bội hồn chỉnh điều kiện in vitro đường tạo phôi trực tiếp gián tiếp qua mô sẹo đường quan hố Ni cấy bao phấn ứng dụng để tạo dòng thuần, biểu gen lặn, đặc biệt đơn bội thu từ nuôi cấy bao phấn hạt phấn nguồn nguyên liệu quan trọng cho chọn dòng đột biến [1] * Ni cấy mơ sẹo Các mơ biệt hóa tách điều kiện thích hợp phản biệt hóa tạo thành mơ sẹo Người ta sử dụng phận dinh dưỡng mảnh lá, thân, rễ làm vật liệu nuôi cấy tạo mơ sẹo sử dụng hạt gieo mơi trường thích hợp đến phát triển thân mầm, tiếp tục cắt thân thành đoạn nhỏ đưa vào môi trường tạo mô sẹo Trong nuôi cấy mô sẹo, người ta thường sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái sinh thu đồng tế bào mơ sau cấy chuyển nhiều lần dễ phát sinh biến dị di truyền [2] * Nuôi cấy tế bào đơn tế bào trần: Năm 1960, Cooking sử dụng enzim phân giải tế bào tạo số lượng lớn tế bào trần Tế bào đơn tế bào trần tách từ mô sẹo, đối tượng lý tưởng nghiên cứu biến đổi di truyền thực vật thơng qua dung hợp tế bào trần có nguồn gốc khác để tạo lai soma.[3] * Nuôi cấy tế bào dung dịch lỏng (suspension culture) Từ năm 1959, Tulecke Nickell thử nghiệm sản xuất sinh khối mô thực vật qui mô lớn (134l) ằng ni cấy chìm Sau đó, nhà khoa học nuôi tế bào qui mô công nghiệp phục vụ sản xuất sikonin, chọn tạo dòng tế bào cho sản lượng sản phẩm thứ cấp cao Ngày kỹ thuật nuôi cấy tế bào dịch lỏng ứng dụng rộng rãi để sản xuất sinh khối thực vật quy mô lớn hệ thống nuôi cấy tự động bioreactor dung tích lớn, đáp ứng nhân nhanh giống thương mại sản xuất chất có dược tính y học [1] [2] Như vậy, với phát triển công nghệ sinh học, nuôi cấy mô tế bào thực vật có bước tiến mạnh mẽ Trong cơng nghệ tế bào kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử hướng nghiên cứu quan trọng công tác lai tạo giống mang nhiều đặc tính ưu việt nâng cao chất lượng giống trồng Hướng nghiên cứu tập trung vào vấn đề sau: - Đưa gen cần chuyển vào thực vật tạo mang đặc tính mong muốn chưa xuất lồi đó, chí tồn dịng họ Những gen chuyển vào trồng phụ thuộc nhiều vào hệ thống nuôi cấy tái sinh tế bào thành in vitro sau chuyển gen - Tạo biến đổi sâu sắc có định hướng tính trạng thông qua biến đổi protein chủ chốt tế bào, điều khó đạt phương pháp cổ điển [1] 2.1.5 Môi trường yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy in vitro Thành phần hóa học mơi trường đóng vai trị định đến thành cơng hay thất bại nuôi cấy tế bào mô thực vật Mỗi loại vật liệu khác có địi hỏi khác thành phần môi trường, bắt đầu nghiên cứu số loài giống cần phải chọn lựa cho đối tượng nghiên cứu loại môi trường phù hợp Từ năm 1933, Tukey nghiên cứu tạo môi trường nuôi cấy thực vật, có nhiều loại môi trường khác sử dụng cho mục đích này, có số mơi trường sử dụng phổ biến MS, LS, WP Ví dụ, mơi trường MS (Murashige&Skoog, 1962) mơi trường sử dụng rộng rãi nuôi cấy mơ tế bào thực vật, mơi trường MS thích hợp cho thực vật mầm, mầm Hay mơi trường Gramborg (1965) cịn gọi B5 dùng thử nghiệm đậu tương, sử dụng tách ni tế bào trần [4] Tuy có nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm số thành phần sau: + Các muối khoáng đa lượng vi lượng + Nguồn cacbon + Các vitamin aminoaxit + Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường + Các chất điều hòa sinh trưởng * Các muối khoáng đa lượng vi lượng Đối với trồng, chất khống đa vi lượng đóng vai trị quan trọng Ví dụ magiê phần phân tử diệp lục, canxi cấu tạo màng tế bào, nitơ thành phần quan trọng vitamin, amino axit protein Ngoài ra, nguyên tố vi lượng Fe, Zn, Mo, Mn thành phần số enzim cần thiết cho hoạt động sống tế bào [1] Muối khống thành phần khơng thể thiếu môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, làm vật liệu cho tổng hợp chất hữu cơ, enzym Các ion muối hòa tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu môi trường tế bào, trì điện hóa thực vật Ví dụ: K, C quan trọng điều hịa tính thấm lọc tế bào [2] * Nguồn cacbon Khi nuôi cấy in vitro, tế bào thực vật thường khơng có khả quang hợp, địi hỏi phải cung cấp nguồn cácbon cho hoạt động dinh dưỡng tế bào Nguồn cacbon ưa chuộng nuôi cấy đường sucrose, số trường hợp sử dụng glucose fructose thay cho sucrose chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu thực vật [1] Ngoài ra, khử trùng môi trường, cần ý không nên kéo dài thời gian để tránh xảy tượng caramen hóa, làm cho môi trường chuyển sang màu vàng dẫn đến ức chế sinh trưởng phát triển tế bào * Các vitamin axit amin Ảnh hưởng vitamin lên phát triển tế bào nuôi cấy in vitro loài khác khác Hầu hết tế bào ni cấy có khả tổng hợp tất loại vitamin với số lượng mức yêu cầu Để mô sinh trưởng, tốt phải bổ sung thêm vào môi trường hay nhiều loại vitamin amino axít Trong loại vitamin, B xem vitamin quan trọng cho phát triển thực vật Axit nicotinic (B 3) pyridoxune (B6) 10 Hình 4.7 : rễ Đồ thị 4.7 Thử nghiệm ảnh hưởng nồng độ NAA tỉ lệ hình thành rễ Kết cho thấy tăng dần nồng độ NAA, tỷ lệ hình thành rễ số rễ tăng dần, ngược lại chiều dài rễ biến thiên lớn không theo quy luật định Các cơng thức khác có tỉ lệ hình thành rễ khác cách chắn mức độ tin cậy 99% Trên mơi trường khơng có NAA, tỉ lệ rễ thấp nhất, đạt 47,3% Nhưng bổ sung NAA, khả hình thành rễ tăng dần tỷ lệ thuận với nồng độ NAA đạt cao (92,7%) mơi trường có nồng độ NAA 0,5 mg/l Đồng thời, môi trường có rễ khoẻ, cứng cáp gồm nhiều rễ với chiều dài lớn hơn, rễ làm giá đỡ vững cho chuyển trồng đất, giúp dễ dàng thu nhận chất dinh dưỡng từ môi trường tăng khả sống sót 46 Từ kết thu được, nhận thấy môi trường bổ sung NAA nồng độ 0,5 mg/l thích hợp cho giai đoạn tạo rễ chồi in vitro tái sinh từ mô sẹo hoa đồng tiền Công thức: MS + 3g/l Agar + 30g/l đường + 0,5 mg/l NAA cho tỉ lệ sống đạt 92,7 % 4.8 Thử nghiệm ảnh hưởng giá thể nuôi cấy đến tỷ lệ sống vườn ươm Trước đưa trồng tự nhiên, người ta thường tiến hành huấn luyện để quen dần với điều kiện môi trường bên ngồi Thời gian kéo dài khoảng ngày tăng dần cường độ vào ngày cuối để tăng nhanh khả thích nghi Do vậy, trước đưa trồng, rễ rửa phần thạch đường bám vào chúng thường mơi trường thích hợp cho nấm bệnh phát triển trùng cơng; tiếp ngâm vào nước để tránh tượng nước Sau trồng, tưới nhẹ cho cây, ngày tưới lần, ngồi đất trồng phải sạch, thống khí, dễ thoát nước để tạo điều kiện cho sinh trưởng, phát triển tốt Tuy nhiên, để phát triển tốt nhất, ngồi điều kiện chăm sóc, việc lựa chọn giá thể thích hợp yếu tố định đến thành công giai đoạn chuyển vườn ươm Vì vậy, chúng tơi tiến hành thí nghiệm loại giá thể: GT1: cát GT2: cát + đất GT3: đất + cát + trấu GT4: đất + cát + trấu + 1/4 phân vi sinh GT5: đất + cát + trấu +1 mùn Kết trình bày bảng 4.8 47 Bảng 4.8 Thử nghiệm ảnh hưởng giá thể nuôi cấy đến tỷ lệ sống vườn ươm Giá thể CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 cv LSD 1% Tỉ lệ sống (%) 28.6 31.0 68.7 88,7 66.7 10.1 0.108 LSD 1% 0.158 Tỷ lệ sống (%) 58.0 69.0 73.3 97,7 80.0 7.9 0.112 0.16 Sau 10 ngày Chiều Sau 20 ngày cao Số Tỷ lệ /cây sống (cm) 4.9 4.7 3.9 4.4 4.8 4.8 3.9 3.5 3.7 4.1 53 58.6 71.0 88.7 70.7 7.6 0.099 0.14 Chiều cao (cm) 5.8 5.0 4.6 5.0 5.3 Số /cây 5.1 4.2 3.8 4.2 4.1 Sau 30 ngày Chiều Tỷ lệ cao Số sống /cây (%) (cm) 28.6 5.8 5.0 31.0 5.6 4.4 68.7 5.5 4.7 88.7 5.7 4.3 66.7 5.9 4.4 10.1 0.108 0.15 Đồ thị 4.8 Thử nghiệm ảnh hưởng giá thể nuôi cấy đến tỷ lệ sống vườn ươm Kết cho thấy giá thể khác cho tỉ lệ sống khác cách chắn mức độ tin cậy 99%, giá thể (1 đất + cát + trấu + 1/4 phân vi sinh) tỏ thích hợp cho sinh trưởng, phát triển 48 con, tỉ lệ sống đạt cao (88,7%) sau 30 ngày Giá thể cho tỉ lệ sống thấp (28,6%) cát ngày phát triển tương đối tốt cát có khả nước tốt song giữ nước dễ bị rửa trôi chất dinh dưỡng nên chết nhiều sau 30 ngày, đồng thời mảnh yếu Ngược lại, trồng giá thể cho phát triển khỏe mạnh, cứng cáp, mở rộng, màu xanh thẫm giá thể cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cho cây, có khả giữ nước tốt Một điểm đáng lưu ý trồng giá thể phải cho phân vi sinh xuống phía giai đoạn đầu non, nhu cầu dinh dưỡng chưa cao, bón phân lúc dễ làm chết nhiễm nấm bệnh Như vậy, lựa chọn giá thể thích hợp cho đồng tiền giai đoạn vườn ươm giá thể gồm đất, cát, trấu phân vi sinh trộn theo tỷ lệ 1:1:1:1/4 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Bước đầu, xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giống hoa đồng tiền kép từ lát cắt mỏng nụ hoa non thông qua giai đoạn tạo mô sẹo tái sinh chồi từ mô sẹo Từ kết rút số kết luận sau: 1.Thời gian khử trùng tốt cho hoa đồng tiền HgCl2 0,1% 10 phút thích hợp với tỷ lệ mẫu sống đạt 72% Môi trường tạo mô sẹo: MS + 2,4D (1mg/l) + 30mg/l đường +15% nước dừa + 6,5 g/l Agar tốt để tạo mẫu chồi in vitro đạt 61,33% sau tuần nuôi cấy Môi trường tái sinh đạt tỉ lệ cao với hoa đồng tiền là: MS +1mg/l BAP +30g/l đường + 6,5 g/l Agar đạt 40% sau tuần nuôi cấy 49 Mơi trường thích hợp cho tăng trưởng mô sẹo môi trường lỏng lắc: MS+30g/l đường cho hệ số nhân mô sẹo đạt 4,1 lần sau 60 ngày ni cấy Mơi trường tạo phơi hóa tăng trưởng cho mô sẹo nhanh môi trường có bổ sung 1mg/l 2,4D +1000mg/l casein đạt 1,72 lần Nhân nhanh chồi đạt hiệu môi trường: MS + 0,5 mg/l BAP + 30g đường + 6,5 g/l Agar Hệ số nhân đạt: 1.59lần Môi trường bổ sung BAP (0,2 mg/l) GA3 (0,5 mg/l) thích hợp cho việc kéo dài chồi hoa đồng tiền Mơi trường tạo rễ thích hợp là: MS + NAA (0,5mg/l) + đường (30g/l) +Agar (3g/l) Tỷ lệ rễ đạt 92,7%, môi trường để tạo hồn chỉnh, khoẻ, có sức sống tốt vườn Giá thể thích hợp cho giai đoạn vườn ươm: Đất +1 Cát +1 Trấu hun +1/4 phân vi sinh cho tỷ lệ sống đạt 88,7% 5.2 Đề nghị Đồng tiền đối tượng nhân giống hứa hẹn nuôi cấy mô tế bào thực vật loài dễ bị nhiễm bệnh nhanh thoái hoá giống Do thời gian thực tập có hạn nên chúng tơi bước đầu xây dựng quy trình nhân nhanh giống hoa đồng tiền kép từ lát cắt mỏng nụ hoa non Tuy nhiên, có số vấn đề cịn tồn tại, cần phải giải để hồn thiện quy trình cải tiến môi trường nhân nhanh mô sẹo, môi trường nhân chồi để tăng hệ số nhân giống, hoàn thiện bước chăm sóc vườn ươm đồng ruộng, đáp ứng mục đích tạo số lượng lớn giống đồng tiền khoẻ mạnh, có sức sống tốt 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: Đỗ Năng Vịnh, 2005 Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng NXB Nông Nghiệp Đỗ Năng Vịnh, Hà Thị Thuý, Dương Minh Nga, Đỗ Minh Phú 2005 "Nghiên cứu hồn thiện quy trình nhân nhanh giống hoa đồng tiền nhập nội công nghệ in vitro" Tạp chí Nơng Nghiệp phát triển nơng thơn số 8/2003 Đỗ Năng Vịnh, 2002 CNSH trồng NXB Nông Nghiệp 4.Ngơ Xn Bình, Nguyễn Thị Th Hà, 2000 Giáo trình cơng nghệ sinh học Nguyễn Quang Thạch, 2004 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô công tác nhân giống đồng tiền Đặng Thị Thanh Hương, 2002 Nghiên cứu nhân giống hoa đồng tiền phương pháp nuôi cấy in vitro, Báo cáo thực tập tốt nghiệp, Trường đại hoc Nông Nghiệp Hà Nội 51 Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Phương Hoa, 2004 Quy trình Kĩ Thuật nhân giống hoa đồng tiền nuôi cấy mô tế bào thực vật, Báo cáo khoa học, trường Đại hoc Nông Nghệp Hà Nội Đỗ Minh Phú, 2003 Nghiên cứu kĩ thuật nhân giống hoa đồng tiền nuôI cấy invitro Báo cáo thực tập tốt nghiệp, Viện đại học mở Hà Nội Tài liệu nước ngoài: 9.Ben - Jaacov.Jotal Vegetative propagation of alberta marfona by tissue culture and grafting hortscience 1991.7.p 289 - 290 10.Himphies.EC.Kintine.inhibinited root formation onleaf of detached leaves of rulgaris (dwarp bean) physial plant 1960 13, P654 - 663 11 Nhut DT., Teixeirada silva JA and Aswth C.R., 2003, The importanceof the explant on regeneration inthin cell layertechnology, in vitro cell Dev Biol Plant, 39, pp 266 - 276 12 AswathC and M.L Choudhury, 2002, Mass propagation of Gerbera (gerbera Jamesonii) through school culture IndianJ.Hortic., 2002 259, 95-99 13 Ha Tieu De, Trieu Thong Nhat, Lo Kim Vu, 2000, gerbera flower NXB KHKT Giang To, Trung Quoc 14 LaneriU., R Franconi, P.Altavista, somatic mutagenesis of Gerbera.jamesonii hybro irradiation anh in vitro culture, ISHS Acta HortiCulture 250 15 Hazarika B.N, 2003, Acclimatization of tissue culture plants, Devision of Horticulture, ICAR Research complex, uniam 793 103, India 16 HorstR.K (1990) Handbook of plant cell culture, Vol5, New York, pp.215 - 217 17 Tang, P.C., DeVit, M, John ston,SA., 1992 Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune resonse, nature356,152 - 159 18 DAsP and singh SamanthaPK, 1989.gerbera.In Bose TK and YAda LP eds 52 http://www.greatflower.com http://www.embassyflorist.com http://www.shop.store.yahoo.com/flowerclub-hk/flowers-gerbera.html http://www.veys.com http://www.enormaflor.com http://www plantfact.com Một số kí hiệu viết tắt: Hgcl2: thuỷ ngân clorua H202: oxi già MS: Môi trường Skoog miller IAA : NAA : irdoleaxeticacid 2,4D IBA: BAP : 6- benzyl aminopurine O FILENAME : B12 TITLE : A N A L Y S I S O F V A R I A N C E COMPLETELY RANDOMIZED DESIGN REPLICATION (R) = TREATMENT : CONGTHUC (T) = T1 = CT1 T2 = CT2 T3 = CT3 MAUSONGHGCL2 (%) NL1 NL2 53 NL3 T1 32.0 30.0 33.0 T2 71.0 71.0 73.0 T3 53.0 51.0 56.0 156.0 152.0 162.0 52.0 50.7 54.0 REP TOTALS REP MEANS ANALYSIS OF VARIANCE FOR MAUSONGHGCL2 =============================================================================== SV DF SS MS F =============================================================================== CONGTHUC (T) 2405.555556 1202.777778 ERROR 20.000000 3.333333 360.83 ** TOTAL 2425.555556 =============================================================================== cv = 3.5% ** = significant at 1% level *** END OF ANALYSIS OF VARIANCE RUN *** O FILENAME : B15 TITLE : A N A L Y S I S O F V A R I A N C E COMPLETELY RANDOMIZED DESIGN REPLICATION (R) = TREATMENT : CONGTHUC (T) = T1 = CT1 T2 = CT2 T3 = CT3 MAUCHETHGCL2 (%) NL1 NL2 NL3 T1 7.0 6.0 7.0 T2 19.0 20.0 18.0 T3 34.0 34.0 37.0 REP TOTALS 60.0 60.0 62.0 REP MEANS 20.0 20.0 20.7 ANALYSIS OF VARIANCE FOR MAUCHETHGCL2 =============================================================================== 54 SV DF SS MS F =============================================================================== CONGTHUC (T) 1210.888889 605.444444 ERROR 8.666667 1.444444 419.15 ** TOTAL 1219.555556 =============================================================================== cv = 5.9% ** = significant at 1% level *** END OF ANALYSIS OF VARIANCE RUN O FILENAME : bang1 TITLE : ss A N A L Y S I S O F V A R I A N C E RANDOMIZED COMPLETE BLOCK DESIGN REPLICATION (R) = TREATMENT : CONGTHUC (T) = T1 = ct1 T2 = ct2 T3 = ct3 T4 = ct4 T5 = ct5 T6 = ct6 mauchet (%) nhaclai1 nhaclai2 nhaclai3 T1 11.0 10.0 10.0 T2 14.0 14.0 13.0 T3 12.0 12.0 13.0 T4 7.0 6.0 7.0 T5 19.0 20.0 18.0 T6 34.0 34.0 37.0 REP TOTALS 97.0 96.0 98.0 REP MEANS 16.2 16.0 16.3 ANALYSIS OF VARIANCE FOR mauchet =============================================================================== SV DF SS MS F =============================================================================== NHACLAI (R) CONGTHUC (T) ERROR 0.333333 0.166667 1523.833333 304.766667 10 10.333333 1.033333