Nghiên cứu sử dụng chế phẩm probiotic (bacillus subtilis và lactobacillus plantarum) trong khẩu phần thức ăn nuôi lợn f1 (large white x móng cái) giai đoạn lợn con sau cai sữa và lợn thịt

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, thực hướng dẫn khoa học PGS TS Lê Văn An Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực, xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Tác giả luận văn Nguyễn Minh Hương ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn thạc sĩ tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới quý thầy cô giáo khoa Chăn nuôi - Thý Y trường Đại Học Nông Lâm Huế truyền đạt kiến thức cho tơi q trình học tập nghiên cứu trường Đặc biệt xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến quý thầy giáo PGS.TS Lê Văn An cô giáo PGS.TS Nguyễn Thị Lộc tận tình giúp đỡ, trực tiếp hướng dẫn tơi suốt thời gian thực tập có ý kiến đóng góp q báu để tơi hồn thành luận văn Chân thành cảm ơn Phịng thí nghiệm trung tâm Trại thí nghiệm Thủy An thuộc Viện nghiên cứu phát triển Trường Đại học Nông Lâm Huế tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian thực tập Cuối xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người thân động viên tơi suốt trình học tập nghiên cứu Do thời gian có hạn kinh nghiệm nghiên cứu khoa học chưa nhiều nên luận văn cịn nhiều thiếu sót, mong nhận ý kiến góp ý Thầy/Cơ anh chị học viên Huế, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Minh Hương iii TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu sử dụng chế phẩm probiotic (Bacillus subtilis Lactobacillus plantarum) phần thức ăn nuôi lợn F1 (L x MC) giai đoạn lợn sau cai sữa lợn thịt với mục tiêu thay kháng sinh tăng suất nâng cao hiệu chăn nuôi Đề tài thực hai thí nghiệm, thí nghiệm 1: Nghiên cứu thay đổi số tính chất hỗn hợp bã đậu nành sau nuôi cấy B.subtilis L.plantarum phối trộn theo tỷ lệ khác Từ đó, xác định tỷ lệ phối trộn thích hợp thời gian ủ thích hợp để bổ sung vào thức ăn cho lợn Thí nghiệm tiến hành với nghiệm thức lần lặp lại NT1 nuôi cấy hỗn hợp chủng vsv bã đậu nành theo tỷ 1:01 (1 B.sutilis DC5 L plantarum N5) NT2 tỷ lệ nuôi cấy 1:02 (1 B sutilis DC5 L plantarum N5) NT3 tỷ lệ nuôi cấy 2:01 (2 B sutilis DC5 L.plantarum N5) NT4 tỷ lệ nuôi cấy hỗn hợp chủng vi sinh vật bã đậu nành 0:01 (1 L.plantarum N5) Kết nghiên cứu thấy rằng, nghiệm thức theo thời gian bảo quản NT3 có tỷ lệ phối trộn 2:01 (2 B.sutilis DC5 L plantarum N5) có hoạt độ enzyme cao ngày sau ngày xử lí có giảm khơng đáng kể (73,744 U/g) Hoạt độ protease nghiệm thức tăng lên nhanh chóng sau giảm nhẹ theo thời gian bảo quản NT3 đạt giá trị cao ổn định có tương tác qua lại hai chủng B sutilis DC5 L.plantarum N5 Giá trị pH NT có phối trộn giảm theo thời gian bảo quản Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng bổ sung hỗn hợp chế phẩm probiotic (Bacillus subtilis Lactobacillus plantarum) phần thức ăn giai đoạn lợn sau cai sữa lợn thịt Thí nghiệm triển khai Trung tâm nghiên cứu Thủy An, thuộc Viện Nghiên cứu phát triển, Trường ĐH Nông Lâm Huế Tổng số 24 lợn lai F1 (L x MC), 35 ngày tuổi, khối lượng trung bình 7,5kg ± 0,12 phân bố ngẫu nhiên với nghiệm thức tương ứng với mức bổ sung chế phẩm khác nhau, nghiệm thức có lần lặp lai với ô chuồng (2 lợn/1 ô chuồng) Nghiệm thức CT0: không bổ sung chế phẩm; CTBL1 bổ sung mức 1x108 CFU/g thức ăn; CTBL2 bổ sung mức 2x108 CFU/g thức ăn CTBL3 bổ sung mức 3x108 CFU/g thức ăn Lợn nuôi ba giai đoạn, bổ sung chế phẩm giai đoạn I (7-20kg) giai đoạn II (20-50kg), giai đoạn III (50-80kg) không bổ sung Kết cho thấy, sau kết thúc thí nghiệm khối lượng thể cao nghiệm thức CTBL3, thấp CT0 (71,58; 61,33kg) Trong đó, cơng thức CTBL3 tăng 16,71% so với CT0 Mức bổ sung 3.108 CFU/g thức ăn có ảnh hưởng tích cực đến lượng ăn vào, tăng trọng bình quân đạt 638,8 g/ngày chi phí thức ăn giảm 16% so với lơ đối chứng iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG BIỂU viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI .1 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 2.1 Mục tiêu chung 2.2 Mục tiêu cụ thể Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT DỤC CỦA LỢN 1.2 ĐẶC ĐIỂM CẤU TẠO VÀ SINH LÝ TIÊU HÓA CỦA LỢN 1.2.1 Đặc điểm cấu tạo máy tiêu hóa lợn 1.2.2 Đặc điểm sinh lý tiêu hóa dày lợn 1.2.3 Đặc điểm cấu tạo sinh lý tiêu hóa ruột .6 1.2.4 Hệ vi sinh vật đường tiêu hóa lợn 1.2.5 Vai trò hệ vi sinh vật đường ruột 10 1.2.6 Cấu tạo nhung mao ruột non pH đường tiêu hóa .11 1.3 BÃ ĐẬU NÀNH (OKARA) 12 1.3.1 Giới thiệu .12 1.3.2 Thành phần bã đậu nành 13 v 1.4 TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC 13 1.4.1 Khái niệm Probiotic 14 1.4.2 Đặc điểm chung vi sinh vật probiotic 14 1.4.3 Cơ chế tác dụng Probiotic .16 1.4.4 Vai trò probiotic 19 1.4.5 Một số chế phẩm có chứa Lactobacillus plantarum Bacillus subtilis 21 1.4.6 Thành phần hỗn hợp chủng vi sinh vật Lactobacillus plantarum Bacillus subtilis 21 1.5 TÓM TẮT MỘT SỐ CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHẾ PHẨM PROBIOITC BACILLUS SUTILIS VÀ LACTOBACILLUS PLANTARUM TRÊN VẬT NUÔI .25 1.5.1 Một số nghiên cứu nước 25 1.5.2 Một số nghiên cứu nước 27 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .30 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .30 2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.2.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu thay đổi số tính chất hỗn hợp bã đậu nành sau nuôi cấy Bacillus subtilis Lactobacillus plantarum phối trộn theo tỷ lệ khác Từ đó, xác định tỷ lệ phối trộn thích hợp thời gian ủ thích hợp để bổ sung vào thức ăn cho lợn 30 2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng bổ sung hỗn hợp chế phẩm probiotic (Bacillus subtilis Lactobacillus plantarum) phần thức đến hiệu sinh trưởng lợn sau cai sữa lợn thịt 34 2.3 Xử lý số liệu 41 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 SỰ BIẾN ĐỔI MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA SẢN PHẨM TRONG Q TRÌNH BẢO QUẢN Ở NHIỆT ĐỘ THƯỜNG KHI PHỐI TRỘN BÃ ĐẬU NÀNH ĐÃ ĐƯỢC XỬ LÝ BỞI BACILLUS SUBTILIS DC5 VÀ LACTOBACILLUS PLANTARUM N5 VỚI TỶ LỆ KHÁC NHAU .42 3.1.1 Sự biến đổi hoạt độ amylase 42 3.1.2 Biến đổi hoạt độ protease 43 3.1.3 Biến đổi giá trị pH theo thời gian bảo quản 44 vi 3.2 KẾT QUẢ CỦA THÍ NGHIỆM 2: ẢNH HƯỞNG BỔ SUNG HỖN HỢP CHẾ PHẨM PROBIOTIC (BACILLUS SUBTILIS VÀ LACTOBACILLUS PLANTARUM) TRONG KHẨU PHẦN THỨC ĂN ĐẾN HIỆU QUẢ SINH TRƯỞNG CỦA LỢN CON SAU CAI SỮA VÀ LỢN THỊT 45 3.2.1 Ảnh hưởng bổ sung hỗn hợp chế phẩm probiotic phần thức ăn đến tốc độ sinh trưởng, hiệu chuyển hóa thức ăn giai đoạn I (7 - 20kg) giai đoạn II (20 - 50kg) .45 3.2.2 Ảnh hưởng bổ sung hỗn hợp chế phẩm probiotic (Bacillus subtilis Lactobacillus plantarum) phần thức ăn cho lợn giai đoạn - 50kg đến tốc độ sinh trưởng hiệu sử dụng thức ăn giai đoạn III từ 50 - 80kg 50 3.2.3 Ảnh hưởng bổ sung hỗn hợp chế phẩm probiotic Bacillus subtilis Lactobacillus plantarum đến cấu quần thể vi sinh vật hồi tràng manh tràng lợn 52 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .56 4.1 KẾT LUẬN 56 4.2 ĐỀ NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO .57 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH ĐỀ TÀI 64 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT FAO : Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hợp Quốc WHO : Tổ chức y tế giới CFU : Số đơn vị khuẩn lạc 1ml mẫu CTV : Công tác viên HCL : Acid hydrocloric VK : Vi khuẩn VSV,vsv : Vi sinh vật Ca : Canxi P : Photpho Mg : Mangan Zn : Kẽm Cu : Đồng VN : Việt Nam H2O2 : Hydrogen peroxide B subtillis : Bacillus subtillis L plantarum : Lactobacillus plantarum UI : Đơn vị đo lường cho giá trị chất DNA : Axit deoxyribonucleic RNA : Axit rebunucleic ĐC : Đối chứng TN : Thí nghiệm VCK, DM : Vật chất khô ME : Năng lượng trao đổi CP : Protein thô EE : Mỡ thô CF : Xơ thô SEM : Sai số trung bình TT : Tăng trọng TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam VKKK : Vi khuẩn kỵ khí VKHK : Vi khuẩn hiếu khí B.subtilis : Bacillus subtilis viii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 So sánh hệ vi sinh dày, ruột non ruột già (CFU log10/g) 10 Bảng 1.2 Giá trị pH đường tiêu hóa lợn qua giai đoạn sinh trưởng .12 Bảng 1.3 Một số Bacteriocin vi khuẩn Lactic sinh .18 Bảng 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm giai đoạn I (7 - 20kg) 35 Bảng 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm giai đoạn II giai đoạn III 35 Bảng 2.3 Thành phần hóa học ước tính loại thức ăn phần (% VCK) 36 Bảng 2.4 Tỷ lệ loại thức ăn, thành phần hóa học (kg / 100 kg DM hỗn hợp) lượng trao đổi (ME, Kcal/kg DM) phần lô đối chứng giai đoạn nuôi khác .38 Bảng 3.1 Ảnh hưởng bổ sung hỗn hợp chế phẩm probiotic Bacillus subtilis Lactobacillus plantarum vào phần thức ăn đến tốc độ sinh trưởng lợn qua giai đoạn I (7 - 20kg) giai đoạn II (20 - 50kg) 46 Bảng 3.2 Ảnh hưởng bổ sung hỗn hợp chế phẩm probiotic phần thức ăn đến hiệu sử dụng thức ăn lợn giai đoạn I (7 - 20kg) giai đoạn II (20 - 50kg) .49 Bảng 3.3 Ảnh hưởng bổ sung hỗn hợp chế phẩm probiotic phần thức ăn cho lợn giai đoạn - 50kg đến tốc độ sinh trưởng hiệu sử dụng thức ăn giai đoạn III từ 50 - 80kg 50 Bảng 3.4 Ảnh hưởng bổ sung hỗn hợp chế phẩm probiotic Bacillus subtilis Lactobacillus plantarum tồn giai đoạn thí nghiệm (7 - 80 kg) đến tăng trọng tiêu tốn thức ăn hiệu kinh tế .51 Bảng 3.5 Ảnh hưởng bổ sung hỗn hợp chế phẩm probiotic Bacillus subtilis Lactobacillus plantarum đến cấu quần thể vi sinh vật hồi tràng manh tràng lợn 53 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Sự biến đổi hoạt độ amylase theo thời gian bảo quản nhiệt độ thường phối trộn bã đậu nành xử lý B subtilis DC5 L plantarum N5 43 Hình 3.2 Sự biến đổi hoạt độ protease theo thời gian bảo quản nhiệt độ thường phối trộn bã đậu nành xử lý B subtilis DC5 L plantarum N5 44 Hình 3.3 Sự biến đổi giá trị pH theo thời gian bảo quản nhiệt độ thường phối trộn bã đậu nành xử lý B subtilis DC5 L plantarum N5 .44 Hình 3.4 Tốc độ sinh trưởng lợn bổ sung hỗn hợp chế phẩm probiotic (Bacillus subtilis Lactobacillus plantarum) phần thức ăn giai đoạn I (7 20kg) giai đoạn II (20 - 50kg) 48 MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ở Việt Nam chăn ni chiếm vị trí quan trọng sản xuất nông nghiệp kinh tế quốc dân Trong chăn ni lợn có vị trí hàng đầu ngành chăn ni Tuy nhiên người chăn ni gặp nhiều khó khăn, đặc biệt nuôi heo giai đoạn sau cai sữa Bởi giai đoạn này, lợn lúc chịu tác động nhiều stress: Stress dinh dưỡng, tress sinh lý (Fraser cs, 1998; Nabuurs, 1998) Hậu làm giảm sức tiêu thụ thức ăn, giảm chiều cao lông nhung, tăng độ sâu hốc niêm mạc ruột, giảm hàm lượng hoạt tính enzyme nội sinh, tăng nhiễm vi sinh vật có hại dẫn tới làm cân hệ vi sinh vật đường ruột Đồng thời, làm giảm tỷ lệ tiêu hóa, tăng tỷ lệ cịi cọc đặc biệt thường mắc hội chứng tiêu chảy gây thiệt hại đáng kể suất chăn nuôi hiệu kinh tế Để khắc phục tình trạng này, phương pháp thường sử dụng bổ sung kháng sinh liều thấp thức ăn (Pluske cs, 2002) Tuy nhiên, kháng sinh tồn dư sản phẩm chăn nuôi gây hại sức khỏe cho người tiêu dùng xảy sau: Gây dị ứng với kháng sinh tiêu thụ thịt có tồn dư kháng sinh, số kháng sinh tổng hợp có nguồn gốc từ Quinolon Carbadox, norfloxacine tồn dư thực phẩm gây ung thư cho người (Dương Thanh Liêm cs 2002) Mặt khác sức ép ngày tăng việc cấm sử dụng kháng sinh chất kích thích sinh trưởng, hoocmon thức ăn chăn nuôi nhiều nước giới, việc nghiên cứu sử dụng chất thay ngày đòi hỏi cấp bách Những chất bổ sung thay quan tâm nghiên cứu sử dụng nhiều chế phẩm sinh học probiotic, prebiotic, chế phẩm enzyme tiêu hóa, chất phytogenic Trong probiotic vi sinh vật sống mà tiêu thụ với lượng thích hợp mang lại tác động có ích cho vật chủ (FAO/WHO, 2001) Đặc biệt hỗn hợp chủng vi sinh vật Lactobacillus plantarum Bacillus subtilis mang lại nhiều lợi ích cho vật chủ chúng có khả năng: Bám vào tế bào biểu mô ruột, tồn tăng mật độ số lượng cho vật chủ Đồng thời ngăn chặn giảm bám dính vào tác nhân gây bệnh, bên cạnh chúng cịn cạnh tranh dinh dưỡng với vi khuẩn gây bệnh, kích thích miễn dịch cho vật chủ ức chế tăng trưởng tác nhân gây bệnh (Reid, 1999; Vazquez et al., 2005) Như kết nghiên cứu March (1979), thấy vi khuẩn có lợi làm tăng khả tiêu hóa chất dinh dưỡng đặc biệt ruột Những enzyme chúng tiết gồm: Amylase, protease lipas (Jin et al., 1996) Những enzyme có hoạt tính phân giải tinh bột, lipid protein (Kim et al., 1989) nhanh 61 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 Fuller, R., Barrow, PA, Brooker, BE, 1978, “Bacteria associated with the gastric epithelium of neonatal pigs” Appl Environ Microbiol 35, 582-591 Fuller, R (1989), “Probiotic in man and animal” Journal of Applied Bacteriology” 66, 365-378 Funderburke D W and Seerley R W., (1990), “The effect of postweaning stressors on pig weight change, blood, liver and digestive tract characteristics” Journal of Animal Science(68), pp 155-162 March and Hamad AM (1979), “Evaluation of the protein quality and available lysine of germinated and fermented cereal” Journal of Food Science, vol 44, no.: 456-459 Hong, H.A., Duc le, H., and Cutting, S.M., 2005, “The use of bacterial sporeformers as probiotics”, FEMS Microbiol Rev 29, pp 813-835 Ji., F Casper., D P Brown., P K Spangler., D A Haydon., K D and J E Pettigrew (2008), “Effects of dietary supplementation of an enzyme blend on the ileal and fecal digestibility of nutrients in growing pigs” J Anim Sci 2008 86: pp.1533-1543 Jin, L Z Ho N Abdullah, M A Ali and S.Jalalutin, (1989a) “Effects off Adherent Lactobacillus cultures on growth, weight of organs and intestinal microflora and volatile falty acids in broiler” Amin Feed Sci Technol 70: 197-209 Jockers, David "Learn about the Importance of Good Bacteria, Part II: Lactobacillus Plantarum." NaturalNews NaturalNews, Jan 2010 Web 19 Apr 2013 Joint FAO/WHO “Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria”, 1-4 October 2001 Kleerebezem M., Boekhorst J., van Kranenburg R., Molenaar D., Kuipers O.P., Leer R., Tarchini R., Peters S.A., Sandbrink H.M., Fiers M.W.E.J., Stiekema W., Lankhorst R.M.K., Bron P.A., Hoffer S.M., Groot M.N.N., Kerkhoven R., de Vries M., Ursing B., de Vos W.M., Siezen R.J., “Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1”, Proc Natl Acad Sci USA 100 (2003) 1990-1995 Ko, JS; Yang, HR; Chang, JY; Seo, JK,“Lactobacillus plantarum inhibits epithelial dysfunction and interleukin-8 secretion induced by tumor necrosis factor-α” World J Gastroenterol 2007, 13, 1962-1965 Kornegay E T., Tinsley S E., and Bryant K L (1979), “Evaluation of rearing systems and feed flavors for pigs weaned at two three weeks of age”, Journalof Animal Science (48), pp 999-1005 Field Code Changed 62 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 Lecce J G., Amstrong W D., Crawford P C., and Duncharme G A (1979), “Nutrition and management of early weaning piglets, Liquid versus dry feeding”,Journal of Animal Science (48), pp.1007 Liu H., Zhang J., Zhang S.H., Yang F.J., Thacker P.A., Zhang G.L., Qiao S.Y., Ma X,“Oral administration of Lactobacillus fermentum I5007 favors intestinal development and alters the intestinal microbiota in formula-fed piglets” J Agric Food Chem 2014; 62:860 - 866 Mathew AG, Chattin SE, Robbins CM, Golden DA (1998) “The influence of a direct yeast culture on microbial populations, acid fermentation, and weed Piglet wean operation”, Journal of Animal Science 76, 2138-2145 Nabuurs M.J.A (1998) “Weaning piglets as a model for studying pathophysiology of diarrhoea” Vet Quarterly 20 Supplement 3:42-45 SooBo Shim 2005 Effects of prebiotics probiotics and synbiotics in the diet of young pigs Ph.D Thesis Animal Nutrition Group Wageningen Institute of Animal Sciences Wageningen University and Research Centre Wageningen The Netherlands Nhóm nghiên cứu Alexopoulos, Y Wang, JH Cho, YJ Chen, JS Yoo, Y Huang, HJ Kim, IH Kim (2009), “The effect of probiotic BioPlus 2B on growth performance, dry matter and nitrogen digestibility and slurry noxious gas emission in growing pigs Department of Animal Resource and Science”, Dankook University, 29 Ansedong, Cheonan, Choognam, 330-714, Republic of Korea Noakes, DE, 1971, “Gastric function in the young pig” Ph.D Thesis, University of London (Cited from Cranwell and Moughan, 1989) Rattanachaikunsopon P., Phumkhachorn P., 2010, “Lactic acid bacteria: their antimicrobial compounds and their uses in food production” Annals of BiologicalResearch, 1(4): 218-228 Robinson, IM, Allison, MJ, Bucklin, JA, 1981, “Characterization of the cecal bacteria of normal pigs”.Appl Environ Microbiol 41, 950-955 Rojas M, Conway PL (1996) “Colonial regimes of lactobacillis of small intestinal lactobacilli” Applied Bacteriology Journal 81, 474-480 Roselli M, Finamore A, Britti MS, Bosi P, Oswald I Roth FX, Kirchgessner M, Eidelsburger U, Gedek B (1992b), “Nutritional efficiency of Bacillus cereus is a bioassay in fattening cattle”.1 Effects on fatdeposition performance, critey meat and bacteria active in the small intestine Agribiological Research- Zeitschrift feather Agrarbiologie Agrikulturchemie okol-Fire 45, 294-302 Salinatro, JP, Blake, IG, Muirhead, PA, 1977, “Isolation and identification of faecal bacteria from adult swine”.Appl Environ Microbiol 33, 79-84 63 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 Sander, M E., Morelli, L and Tompkins, T A (2003), “Sporeformers as humanprobiotic: Bacillus, sporolactobacillus, and Brevibacillus”, Comprehensive Review in food Science and food Safety 2, pp.101-110 Smith, HW, Jones, JET, 1963, “Observation on the alimentary tract and its bacterial flora in healthy and diseased pigs”.Pathol Bacteriol 86, 387-412 Smith, HW, 1965, “The development of the flora of the alimentary tract in young animals” J Pathol Bacteriol 90, 495-513 Stokes CR, Bailey M, Haverson K, Harris C, Jones P, Inman C, Pie S, Oswald IP, Williams BA, Akkermans ADL, Sowa E, Rothkoetter HJ, Miller BG (2004), “Development of intestinal immune system in piglets: impact on weaning process” Animal Research 53, 325-334 Strompfová, V., Laukova, A., Ouwehand, AC, 2004 “Selection of enterococci for potential canine probiotic additives” Vet Microbiol 100, 107-114 Suo C., Yin Y., Wang X., Lou X., Song D., Wang X., Gu Q “Effects of Lactobacillus plantarum ZJ316 on pig growth and pork quality” BMC Vet Res 2012;8-89 Thomas L V, Ingram R E, Bevis H E, Davies A., Milne C F., DelvesBroughtonJ., 2002, “Effective use of nisin to control Bacillus and Clostridium spoilage of apasteurized mashed potato product” J Food Protect, 65: 1580-1585 Whitemore C T (1993), “The science and practice of pig production”, Longman House Young Ju kim, Ji Hee Kang, Ji Sunlee & Myung Suklee (2001), “Study on the bacteriocin produced hy Lactobacillus sản phẩm GM 73 11”, Department of Microbiology college of nature Science Pukyong National University http://biospring.com.vn/kien-thuc-chuyen-nganh/nguyen-lieu-bao-tu-vi- khuanbacillus-subtilis-trong-chan-nuoi.html http://bioone.vn/Ung-dung/Probiotic-trong-chan-nuoi-heo-ad54.html 64 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH ĐỀ TÀI Hình 1: Hóa chất để pha mơi trường ni cấy vi sinh vật Hình 2: Bã đậu nành ủ túy nilơng theo cơng khác 65 Hình 3: Bã đậu nành ủ ngày thứ 15 Hình 4: Ni cấy vi sinh vật phịng thí nghiệm 66 Hình 5: Phối trộn phần thức ăn cho lợn tay Hình 6: Lợn lúc nhập Hình 7: Lợn ni lúc 20 ngày tuổi 67 Hình 8: Ni heo giai đoạn thứ hai Hình 9: Cân khối lượng heo lúc tháng tuổi lơ đối chứng 68 Hình 10: Chuẩn bị dụng cụ thu dịch hồi tràng manh tràng Hình 11: Nhuộm màu gram quan sát để định danh vi khuẩn 69 PHỤ LỤC TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5165 : 1990 SẢN PHẨM THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ Foods - Method for enumeration of total aerobic bacteria Cơ quan biên soạn: Viện Dinh dưỡng - Bộ Y tế Cơ quan đề nghị ban hành: Bộ Y tế Cơ quan trình duyệt: Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng Cơ quan xét duyệt ban hành: Ủy ban Khoa học Nhà nước Quyết định ban hành số 735/QĐ ngày 31 tháng 12 năm 1990 SẢN PHẨM THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ Foods - Method for enumeration of total aerobic bacteria Tiêu chuẩn quy định phương pháp đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí loại sản phẩm thực phẩm Nguyên tắc Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa, đếm khuẩn lạc môi trường thạch sau ủ hiếu khí nhiệt độ 30 ± 1oC thời gian từ 48 đến 72 Số lượng vi khuẩn hiếu khí g ml mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm tính từ số khuẩn lạc đếm từ đĩa nuôi cấy theo đậm độ pha loãng Lấy mẫu chuẩn bị mẫu Lấy mẫu chuẩn bị mẫu theo TCVN 4886-89 Lượng mẫu cân tối thiểu để pha loãng khơng 1ml sản phẩm lỏng 10 ± 0,1 g sản phẩm khác Thiết bị, dụng cụ - Đĩa Petri thủy tinh đường kính 90 – 100 mm; - pipet có chia độ loại 1, 5, 10 ml tiệt khuẩn; - nồi cách thủy điều chỉnh nhiệt độ 45 ± 1oC; - tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 30 ± 1oC; 70 - tủ sấy khô; - nồi hấp áp lực; - bình thủy tinh dung tích 250 – 500 ml; - ống nghiệm loại 16 – 160 mm lớn hơn; - pH mét giấy đo pH Hóa chất, mơi trường 4.1 Hóa chất - Thạch dùng cho vi sinh vật; - Pepton dùng cho vi sinh vật; - Natri clorua tinh khiết (NaCl); - Cao thịt; - Cao men; - trypton; - Glucoza tinh khiết; - Natri hydrophotphat tinh khiết (Na2HPO4); - Kali dihydrophotphat tinh khiết (KH2PO4); - Natri hydroxit tinh khiết (NaOH), dung dịch 0,1 N 4.2 Môi trường a) Nước đệm pepton Pepton 10g NaCl 5g Na2HPO4 9g KH2PO4 1,5g Nước cất 1000mm b) Nước pepton Pepton NaCl Nước cất 1g 8,5g 1000 ml 71 Cách pha chế: Đun sơi để hịa tan chất Để nguội đến 30 ± 5oC Điều chỉnh pH dung dịch NaOH 0,1 N cho sau tiệt khuẩn pH = 7,0 ± 0,2 Rót vào bình dung tích 250 ml bình 90 ml, vào ống nghiệm ống ml môi trường Tiệt khuẩn nồi hấp nhiệt độ 120oC – 15 phút Môi trường không dùng ngay, cần bảo quản nơi khơ ráo, bóng tối, nhiệt độ từ đến 5oC không 30 ngày c) Môi trường thạch thường glucoza Pepton 10g NaCl 5g Cao thịt 5g Glucoza 1g Thạch 15-20 g Nước cất 1000 ml d) Môi trường thạch trypton glucoza Trypton 5g Cao men 2,5 g Glucoza 1g Thạch 15-20 g Nước cất 1000 g Cách pha chế: Đun nhỏ lửa, quấy để hịa tan chất đến sơi Để nguội môi trường đến 55 ± 5oC, điều chỉnh pH cho sau tiệt khuẩn pH = 7,0 ± 0,2 Rót vào bình thủy tinh lượng mơi trường khơng q 1/2 dung tích bình Tiệt khuẩn nồi hấp nhiệt độ 120oC – 15 phút Nếu môi trường sử dụng ngay, để nguội đến 45 ± 1oC nồi cách thủy, chưa sử dụng cần bảo quản nơi khơ ráo, bóng tối với nhiệt độ từ đến 5oC không 30 ngày Trước nuôi cấy đun cách thủy cho môi trường nóng chảy để nguội đến 45 ± 1oC e) Thạch màng Thạch – 10g Nước cất 1000 ml Đun nhỏ lửa, quấy để hòa tan thạch đến sôi Để nguội môi trường đến 55 ± C, điều chỉnh pH cho sau tiệt khuẩn pH = 7,0 ± 0,2 Rót vào ống o 72 nghiệm ống ml bình thủy tinh không 100 ml môi trường Tiệt khuẩn nồi hấp nhiệt độ 120oC – 15 phút Sử dụng bảo quản mục (d) Các bước nuôi cấy 5.1 Pha loãng mẫu Pha loãng mẫu theo TCVN 4887-89 Pha lỗng mẫu có đậm độ pha loãng cần thiết đủ đếm số khuẩn lạc đĩa theo dự tính 5.2 Đổ đĩa Đối với mẫu kiểm nghiệm phải ni cấy đậm độ, đậm độ dùng đĩa petri pipet vô khuẩn riêng Lấy ml sản phẩm (lỏng) dung dịch pha loãng đậm độ khác cho vào đĩa petri Rót vào đĩa 12 – 15 ml môi trường thạch c d, trộn đảo dung dịch mẫu môi trường cách lắc sang phải sang trái chiều lần Để đĩa thạch đông tự nhiên mặt ngang Thời gian từ bắt đầu pha lỗng mẫu đến rót mơi trường khơng q 30 phút Nếu dự đốn sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan mặt thạch sau môi trường đông đổ tiếp ml thạch màng lên mặt 5.3 Ủ ấm Khi thạch đông, lật sấp đĩa petri để vào tủ ấm nhiệt độ 30 ± 1oC từ 48 đến 72 Sau 48 tính kết sơ cách đếm khuẩn lạc mọc đĩa ni cấy, sau 72 tính kết thức Tính kết Chọn tất đĩa có khơng q 300 khuẩn lạc để tính kết Sự phân bố khuẩn lạc đĩa ni cấy phải hợp lý: độ pha lỗng cao số khuẩn lạc Nếu kết không hợp lý, phải tiến hành lại bước nuôi cấy (5) Tính kết sau: 6.1 Chọn đĩa có từ 15 đến 300 khuẩn lạc đĩa đậm độ pha loãng liên tiếp Nếu chênh lệch giá trị đậm độ nhỏ lần, tính số (N) khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí cho g ml sản phẩm cách tính trung bình cộng tổng số khuẩn lạc đĩa theo công thức sau: 73 C: số khuẩn lạc đếm đĩa chọn n1, n2: Số đĩa đậm độ pha loãng liên tiếp chọn thứ 1, thứ d: Hệ số pha loãng đậm độ pha lỗng chọn thứ Làm trịn số kết có được, giữ lại số có nghĩa Biểu thị kết dạng thập phân 1,0 9,9 nhân với 10n (n số mũ thích hợp 10) Ví dụ: đậm độ pha lỗng 10-2 có 150 215 khuẩn lạc; đậm độ pha lỗng 10-3 có 16 25 khuẩn lạc Kết quả: 1,8.104 vi khuẩn hiếu khí g ml sản phẩm 6.2 Nếu chênh lệch giá trị đậm độ pha loãng lớn lần, lấy giá trị đậm độ pha loãng thấp để tính kết Ví dụ: đậm độ pha lỗng 10-2 có 180 250 khuẩn lạc; đậm độ pha lỗng 10-3 có 60 75 khuẩn lạc Chọn đậm độ pha lỗng thấp (10-2) để tính kết Kết quả: 2,2.104 vi khuẩn hiếu khí g ml sản phẩm 6.3 Nếu đĩa sản phẩm lỏng nguyên chất đậm độ pha lỗng ban đầu có 15 khuẩn lạc, tính kết theo trung bình cộng khuẩn lạc đếm đĩa tính cho g ml sản phẩm Ví dụ: đậm độ pha lỗng 10-1 sản phẩm đặc có 12 khuẩn lạc Kết quả: 1,0.102 vi khuẩn hiếu khí g sản phẩm 6.4 Nếu tất đĩa khơng có khuẩn lạc mọc, đánh giá kết sau: - Ít vi khuẩn hiếu khí ml sản phẩm - Ít vi khuẩn hiếu khí g sản phẩm 74 d: Hệ số pha loãng đậm độ pha loãng ban đầu (10-1) Báo cáo kết quả: Trong báo cáo kết kiểm nghiệm phải nêu phương pháp dùng kết tính được: số vi khuẩn hiếu khí có g ml sản phẩm kiểm tra Sai lệch phương pháp: 95% trường hợp, sai lệch giới hạn phương pháp từ 12 đến 37% 75 Den 1-20,22,24-42,45-47,49-64,70-75 Mau 21,23,43,44,48,65-69 ... Đề tài nghiên cứu sử dụng chế phẩm probiotic (Bacillus subtilis Lactobacillus plantarum) phần thức ăn nuôi lợn F1 (L x MC) giai đoạn lợn sau cai sữa lợn thịt với mục tiêu thay kháng sinh tăng suất... sung vào thức ăn nuôi lợn sau cai sữa theo giai đoạn sau: - CT0 (khẩu phần lô ĐC): Khẩu phần sở giai đoạn I lợn từ - 20kg: gồm bột ngô, cám gạo, bột sắn, gạo tẻ thức ăn đậm đặc - Khẩu phần sở giai. .. lợn sau cai sữa đến 20kg từ 39,0 - 51,3% Xuất phát từ sở khoa học tiến hành đề tài: "Nghiên cứu sử dụng chế phẩm probiotic (Bacillus subtilis Lactobacillus plantarum) phần thức ăn ni lợn F1 (Large