Mô hình Tăng Giảm được các nước thuộc OECD áp dụng và ban hành chính thức năm 2001 (OECD 425). Thử nghiệm được tiến hành trên các mức liều được tính theo hệ số bước nhảy liều, thực hiện lần lượt trên từng ĐVTN theo tiến trình tăng hoặc giảm liều và tiếp tục cho đến khi đạt điều kiện dừng lại. Đánh giá kết quả bằng quan sát các biểu hiện và triệu chứng ngộ độc theo qui định chung và tính giá trị LD50 gần đúng (nếu có) theo qui định riêng của phương pháp.
HỌC HỌC VIỆN VIỆN KỸ KỸ THUẬT THUẬT QUÂN QUÂN SỰ SỰ Mơn học: ĐỘC HỌC MƠI TRƯỜNG ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP TÍNH THEO MƠ HÌNH TĂNG - GIẢM UDP (OECD 425) GVHD: TS NGUYỄN TRUNG DŨNG LỚP: CAO HỌC KTHH 32 HVTH: NGUYỄN PHƯƠNG THẢO I Phân loại PP đánh giá độc tính cấp tính ACUTE ORAL SYSTEMIC TOX GUIDELINES Test Method Acute Toxicity Guideline Up-Down Procedure Fixed Dose Procedure Acute Toxic Class Method International Acceptance Deleted Dec 2002 OECD 401 2001, Revised 2008 OECD TG 425 2002 OECD TG 420 2002 OECD TG 423 In Vitro Cytotoxicity 3T3 Cells (For choosing starting dose) 2010 OECD GD 129 In Vitro Cytotoxicity NHK Cells (For choosing starting dose) 2010 OECD GD 129 II Nguyên tắc PP OECD 425 Mơ hình Tăng- Giảm nước thuộc OECD áp dụng ban hành thức năm 2001 (OECD 425) Thử nghiệm tiến hành mức liều tính theo hệ số bước nhảy liều, thực ĐVTN theo tiến trình tăng giảm liều tiếp tục đạt điều kiện dừng lại Đánh giá kết quan sát biểu triệu chứng ngộ độc theo qui định chung tính giá trị LD50 gần (nếu có) theo qui định riêng phương pháp II Nguyên tắc PP OECD 425 Thử nghiệm giới hạn Thử nghiệm thức -Là thử nghiệm sử dụng tối đa động vật -Liều thử nghiệm 2000mg/kg đặc biệt 5000 mg/ kg - Quy trình thử nghiệm mức 2000 5000mg/kg khác -Thử nghiệm bao gồm tiến trình liều theo thứ tự nhất, động vật phân liều, liều khoảng thời gian, 48 - Con vật nhận liều thấp bậc so với mức tốt ước tính LD50. - Nếu vật sống sót, liều cho vật tăng lên [hệ số] 3,2 lần liều ban đầu; nếu chết, liều cho vật giảm theo tiến trình liều tương tự - Mỗi vật phải quan sát cẩn thận tối đa 48 trước đưa định liệu liều lượng cho vật - Quyết định dựa mơ hình tồn 48 tất lồi động vật thời điểm - LD50 tính phương pháp khả xảy tối đa III Các bước tiến hành III.1 Thử nghiệm giới hạn Tiến hành thử nghiệm thức để xác định LD50 Chết ĐVTN2 Sống ĐVTN1 Nếu có chết dừng thử nghiệm giới hạn, tiến hành thử nghiệm thức theo nguyên tắc giảm liều Trong trường hợp này, LD50 nhỏ mức liều giới hạn ĐVTN3 ĐVTN4 ĐVTN5 Nếu có sống LD50 lớn mức liều giới hạn thử, dừng thử nghiệm theo dõi tiếp cho đủ thời gian quy định tiến hành thử nghiệm thức mức liều cao để tính giá trị LD50 thấy cần thiết giảm để xác định mức liều khơng gây triệu chứng ngộ độc III Các bước tiến hành III.1 Thử nghiệm giới hạn LD50 nhỏ liều giới hạn (2000mg/kg) hay nhiều ĐVTN chết OXOXX OOXXX OXXOX OXXX Nếu ĐVTN chết chuyển sang thử nghiệm thức III Các bước tiến hành III.1 Thử nghiệm giới hạn Thử nghiệm với ĐV LD50 cao liều giới hạn (2000mg/kg) hay nhiều ĐVTN sống OOOOO OOOXO OOOOX OOOXX OXOXO OXOOX OOXXO OOXOX OXXOO III Các bước tiến hành III.2 Thử nghiệm thức - Các động vật đơn lẻ thử nghiệm theo trình tự thường cách 48 Sống sót Chết ủ rũ ĐVTN2: ĐVTN2: ĐVTN1 Liều tăng lên Liều giảm xuống - Khi khơng có thơng tin chất cần thử nghiệm, tiến trình liều chọn từ trình tự 1,75; 5,5; 17,5; 55; 175; 550 2000 (hoặc 1,75, 5,5, 17,5, 55, 175, 550, 1750, 5000 cho nhu cầu quy định cụ thể) Nếu khơng có ước tính khả gây chết chất này, nên bắt đầu định lượng 175 mg/kg - Dừng thử nghiệm thỏa mãn điều kiện sau: + ĐVTN liên tiếp sống sót mức liều giới hạn (2,0g/kg; 5,0g/kg 10g/kg) + Có cặp đảo ngược ĐVTN thử liên tiếp + Có ĐVTN thử sau xuất cặp đảo ngược khả tỉ lệ IV Ưu nhược điểm phương pháp IV.1 Ưu điểm - Giảm thiểu số lượng động vật cần thiết để ước tính độc tính qua đường miệng hố chất - Ước tính LD50 khoảng tin cậy - Phép thử cho phép quan sát dấu hiệu nhiễm độc IV.2 Nhược điểm - Chỉ có hiệu xác định hóa chất khả có độc tính thấp V Thử nghiệm thực tế Đánh giá khả gây độc cấp tính dịch chiết etanolic nước rễ S.munja chuột bạch theo OECD 425 V.1 Chuẩn bị mẫu độc tính Rễ S.munja (lấy Pakistan) làm sạch, rửa nước máy, lau khơ, để bóng râm ngày Khi rễ khô nghiền mịn thành bột Ngâm bột rễ 70% etanol + 30%nước cất ngày Lọc qua vải muslin, sau qua giấy lọc Dịch lọc (các dung môi thừa loại bỏ thiết bị cô quay 40oC) V.2 Thử nghiệm độc tính cấp tính * Thử nghiệm tiến hành nhóm: nhóm điều trị nhóm đối chứng - Chuột bạch tạng không mang thai, cân nặng từ 28 có tuổi từ 8-10 tuần chọn ngẫu nhiên - Động vật giữ điều kiện tiêu chuẩn ngày - Giới hạn liều lượng: 2000mg/kg dạng liều - Chuột phải thức ăn 3-4h trước dùng thuốc, dùng nước - Liều sử dụng cho chuột theo trọng lượng thể V.2 Thử nghiệm độc tính cấp tính +carboxylmethyl cellulose 1% 2000mg/kg S.munja Sau 1-2h: cho ăn Nhóm thử nghiệm (TG) Nhóm đối chứng(CG) V.2 Thử nghiệm độc tính cấp tính - Các vật quan sát chặt chẽ 30p đầu sau 4h - Sau 4h vật thử nghiệm sống tiếp tục theo dõi tiếp tục thử nghiệm với ĐVTN bổ sung với nhóm theo liều tương tự - Các ĐVTN quan sát chặt chẽ đặn khoảng thời gian 14 ngày V.3 Kết thử nghiệm • LD50 chiết xuất lớn 2000mg/kg Khơng có dấu hiệu thay đổi đáng kể tìm thấy trọng lượng thể quan với số khối thể • So với nhóm đối chứng, nhóm thử nghiệm có tăng đáng kể nồng độ ALT, AST, tổng số protein, nồng độ globulin, urê huyết thanh, cholesterol, triglycerides, LDL, số lượng hồng cầu, MCV, MCH, số lượng bạch cầu tế bào lympho mức ALP MCHC lại giảm đáng kể • Mặc dù LD50 >2000mg/kg dấu hiệu nhiễm độc trung bình xuất gan, thận, lipit CBC cho thấy rối loạn chức máu liều lượng giới hạn V.3 Kết thử nghiệm Trọng lượng thể ĐVTN đối chứng chiết xuất rễ S.munja tăng dần suốt thời gian nghiên cứu V.3 Kết thử nghiệm - tốc độ hô hấp cao 30 phút trongnhóm xử lý chiết xuất tăng hoạt động somatomotor quan sát trong nhóm V.3 Kết thử nghiệm Khơng có tổn thương tìm thấy kiểm tra quan quan trọng như: tim, thận gan từ động vật thử nghiệm V.3 Kết thử nghiệm Không quan sát thấy thay đổi nồng độ creatinin (huyết thanh) urê nhóm nhiễm độc cấp tính cao so sánh với nhóm đối chứng V.3 Kết thử nghiệm Alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST),tổng mức protein globulin nâng lên phosphatase kiềmgiảm nhóm độc tính cấp so với nhóm VI Kết luận Phương pháp cho phép ước tính LD50 với khoảng tin cậy kết cho phép hoá chất xếp hạng phân loại theo Hệ thống hài hịa tồn cầu (GHS) để phân loại hóa chất gây độc cấp tính TÀI LIỆU THAM KHẢO Acute oral toxicity evaluation of aqueous ethanolic extract of Saccharum munja Roxb roots in albino mice as per OECD 425 TG https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2214750017300720 OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS https://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/suppdocs/feddocs/oecd/oecd_gl425-508.pdf ... https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2214750017300720 OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS https://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/suppdocs/feddocs/oecd/oecd_gl425-508.pdf ... ĐVTN4 ĐVTN5 Nếu có sống LD50 lớn mức liều giới hạn thử, dừng thử nghiệm theo dõi tiếp cho đủ thời gian quy định tiến hành thử nghiệm thức mức liều cao để tính giá trị LD50 thấy cần thiết giảm để... nghiệm với ĐVTN bổ sung với nhóm theo liều tương tự - Các ĐVTN quan sát chặt chẽ đặn khoảng thời gian 14 ngày V.3 Kết thử nghiệm • LD50 chiết xuất lớn 2000mg/kg Khơng có dấu hiệu thay đổi đáng