phân tích các chỉ tiêu sinh lí hóa
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ CÔNG NGHỆ SAU THH HOẠCH CƠ BẢN PHÂN TÍCH PHỊNG THÍ NGHIỆM TÀI LIỆU LƯU HÀNH NỘI BỘ PHỊNG THÍ NGHIỆM D006 2019 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm LỜI NĨI ĐẦU Tài liệu tổng hợp kiến thức phương pháp phân tích sử dụng phịng thí nghiệm, áp dụng phạm vi đề tài thực phòng D006 Các bạn sinh viên cần nắm vững lý thuyết trước tiến hành thực cơng việc phịng thí nghiệm Thứ nhất, nắm vững lý thuyết để đảm bảo an toàn cho thân người thực Thứ hai, nắm vững lý thuyết để đảm bảo kết ghi nhận xác sử dụng Cuối cùng, nắm vững lý thuyết để dịng cơng việc thực diễn thuận lợi “Quy tắc chết, người sống”, nắm vững lý thuyết đảm bảo nội dung cần thiết ln thực lúc tiến hành cơng việc “mềm dẻo”, tùy thuộc vào điều kiện phịng thí nghiệm Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm MỤC LỤC LỜI NĨI ĐẦU i MỤC LỤC ii Chương DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 1.1 Thiết bị, dụng cụ cân đong 1.1.1 Đối với vật rắn 1.1.2 Đối với chất lỏng 1.2 Dụng cụ chứa, đựng 1.3 Quản lý thiết bị, dụng cụ trước sau làm việc Chương HĨA CHẤT THÍ NGHIỆM 2.1 Đơn vị pha chế hóa chất 2.1.1 Đơn vị tỷ lệ phần trăm 2.1.2 Đơn vị nồng độ mol (M) nồng độ đương lượng (N) 2.2 Quy tình pha chế hóa chất 2.2.1 Thứ tự pha chế 2.2.2 An toàn pha chế 2.3 Loại thải hóa chất Chương PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VẬT LÝ 3.1 Xác định khối lượng 3.2 Xác định kích thước 3.3 Xác định thể tích 3.3.1 Đo thể tích trực tiếp 3.3.2 Phương pháp thay thể tích (Choi and Okos, 2002) 3.4 Xác định khối lượng riêng 3.4.1 Xác định trực tiếp 3.4.2 Khối lượng riêng biểu kiến (cho mẫu rắn có cấu trúc rỗng rời rạc) (Dashpande et al., 1993) 3.4.3 Xác định khối lượng riêng thực theo thành phần nguyên liệu (Sahin and Sumnu, 2006) 3.5 Phương pháp đo màu (Morris et al., 1986) 3.6 Xác định cấu trúc 10 3.6.1 Chuẩn bị mẫu 10 3.6.2 Đo độ bền gel (Seki et al., 1990 trích dẫn Jiang et al., 2000) 10 3.6.3 Đo lực đàn hồi 10 3.6.4 Phương pháp đo độ giòn 11 Tài liệu lưu hành nội Phòng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm 3.6.5 Lực cắt lực phá vỡ 11 Chương PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN NGUYÊN LIỆU 13 4.1 Xác định ẩm phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi (phương pháp AOAC 950.46) 13 4.1.1 Nguyên tắc 13 4.1.2 Tiến hành 13 4.1.3 Tính toán kết 13 4.2 Phương pháp xác định hàm lượng tro (phương pháp NMKL số 23-1991) 13 4.2.1 Nguyên tắc 13 4.2.2 Tiến hành 14 4.2.3 Tính tốn kết 14 4.3 Định lượng protein tổng số phương pháp Kjeldahl (phương pháp NMKL số 6-2003) 14 4.3.1 Định nghĩa 14 4.3.2 Nguyên tắc 15 4.3.3 Dụng cụ, hóa chất 15 4.3.4 Cách tiến hành 16 4.3.5 Tính kết 17 4.4 Xác định hàm lượng chất béo tự theo phương pháp Soxhllet (phương pháp NMKL số 31-1989) 17 4.4.1 Nguyên lý 17 4.4.2 Tiến hành 17 4.4.3 Tính kết 18 4.5 Xác định hàm lượng carbonhydrate (FAO food and nutrition paper 77) 18 Chương PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU HÓA LÝ 19 5.1 Xác định độ hoạt động nước 19 5.2 Xác định khả giữ nước cách đo lượng nước 19 Chương phân tích tiêu vi sinh 20 6.1 Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí (TCVN 4884:2005) 20 6.1.1 Nguyên tắc 20 6.1.2 Tiến hành 20 6.1.3 Tính tốn kết 21 Chương MỘT SỐ CHỈ TIÊU NGUYÊN LIỆU ĐỘNG VẬT 22 7.1 Xác định hàm lượng muối (Phương pháp Mohr, TCVN 4330:1986) 22 7.1.1 Nguyên lý 22 7.1.2 Tiến hành 22 Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm 7.1.3 Tính kết 22 7.2 Xác định hàm lượng đạm hòa tan theo phương pháp Biuret (AOAC Offical Methol 960.04) 23 7.2.1 Cách pha thuốc thử 23 7.2.2 Phân tích nồng độ protein 23 7.2.3 Xây dựng đường chuẩn 23 7.2.4 Tính tốn kết 24 7.3 Xác định số peroxide (TCVN 6127:2010) 24 7.3.1 Nguyên tắc 24 7.3.2 Chuẩn bị hóa chất 24 7.3.3 Tiến hành thí nghiệm 25 7.3.4 Tính tốn kết 25 7.4 Xác định hàm lượng nitơ anomiac (TCVN 3706 – 90) 25 7.4.1 Nguyên tắc 25 7.4.2 Chuẩn bị 25 7.4.3 Cách tiến hành 26 7.4.4 Tính tốn kết 26 Chương MỘT SỐ CHỈ TIÊU NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT 28 8.1 Phương pháp xác định hàm lượng đường (Phạm Văn Sổ Bùi Thị Như Thuận, 1991) 28 8.1.1 Nguyên tắc 28 8.1.2 Chuẩn bị 28 8.1.3 Tiến hành 28 8.1.4 Cơng thức tính toán 29 8.2 Phương pháp xác định độ acid toàn phần (Phạm Văn Số Bùi Thị Như Thuận, 1991) 29 8.2.1 Nguyên tắc 29 8.2.2 Chuẩn bị mẫu 29 8.2.3 Phân tích dịnh lượng 30 8.2.4 Tính kết 30 8.3 Phương pháp phân tích hàm lượng vitamin C (phương pháp Muri) 30 8.3.1 Nguyên tắc 30 8.3.2 Tiến hành 30 8.3.3 Tính tốn kết 31 Chương PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC 32 9.1 Định tính số thành phần có hoạt tính sinh học 32 9.1.1 Định tính tannin 32 9.1.2 Định tính flavonoid 32 Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm 9.1.3 Định tính anthraquinone 33 9.1.4 Định tính alkaloid 33 9.1.5 Định tính saponin 34 9.2 Xác định hàm lượng polyphenol tổng (TPC) 34 9.2.1 Nguyên tắc 34 9.2.2 Cách thực hiện: 34 9.3 Xác định hoạt tính chống oxy hóa hợp chất sinh học 36 9.4 Phân tích flavonoid tổng qua phản ứng với aluminium chloride (Madal et al.,2013) 37 9.4.1 Nguyên tắc 37 9.4.2 Tiến hành 38 9.5 Phương pháp xác định hàm lượng naringin (Davis, 1947) 38 9.5.1 Nguyên tắc 38 9.5.2 Tiến hành 39 9.5.3 Tính tốn kết 39 Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm Chương DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 1.1 Thiết bị, dụng cụ cân đong Thiết bị, dụng cụ để lấy lượng xác Cần lưu ý đến độ xác thiết bị trước sử dụng 1.1.1 Đối với vật rắn Sử dụng cân điện tử: - Cân ký điện tử (tối đa 2÷3 kg, độ xác 0,5g) - Cân số lẻ (tối đa 200 g, độ xác 0,01 g) - Cân số lẻ (tối đa 200 g, độ xác 0,0001 g) Cần quan tâm đến độ xác Ví dụ số lẻ, trường hợp cần cân mẫu độ xác 95%, tương ứng sai số 5%, ta cần lượng mẫu lớn 0,01/0,05 = 0,20 g Đối với pha hóa chất phân tích xác hay dung dịch chuẩn, độ xác chấp nhận thường 1% 1.1.2 Đối với chất lỏng Sử dụng thiết bị đong xác: - Bình định mức 500 mL, 200 mL, 100 mL, 50 mL, 25 mL - Pipet thủy tinh: loại 5, 10, 20 mL, độ xác 0,1 mL; loại 1mL 2mL sử dụng thể tích (chú ý loại pipet vạch vạch) - Micropipet: loại - mL, độ xác 0,1 mL; loại - 1000 µL, độ xác µL; loại – 100 µL, độ xác µL Chú ý đến khoảng hoạt động thiết bị để đảm bảo độ xác Ví dụ: pipet sử dụng để lấy lượng mẫu lớn mL Dưới mL sử dụng micropipet – 1000 µL Dưới 100 µL sử dụng loại – 100 µL đảm bảo sai số mẫu lớn µL để kết xác 1.2 Dụng cụ chứa, đựng Phân biệt theo loại nguyên liệu: - Thủy tinh, sứ: sử dụng cho hầu hết loại hóa chất (erlen, becher, …) - Inox: hạn chế acid, kiềm với nồng độ cao (thau, muỗng, ….) Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm - Kim loại nói chung: hạn chế acid, kiềm kể với nồng độ thấp chất oxy hóa mạnh - Nhựa: hạn chế acid, kiềm dung mơi hữu ăn mịn (ly, thau, rỗ, …) 1.3 Quản lý thiết bị, dụng cụ trước sau làm việc Trước làm việc, cần đảm bảo độ thiết bị, dụng cụ sử dụng: - Chứa nguyên liệu: dụng cụ cần làm nước máy - Chứa hóa chất: dụng cụ làm nước cất hóa chất cần chứa đựng - Chứa vật rắn dụng cụ cần phải khơ (sấy, phơi nắng) Sau làm việc cần rửa thiết bị: - Rửa nước: vật chất chứa đựng có khả tan nước tốt Ví dụ: đường, loại muối trung tính - Rửa xà bơng: vật chất chứa đựng có khả tan nước Ví dụ: dầu ăn, mỡ, số loại chất kết tủa - Rửa dung mơi; rửa hóa chất (nâng cao) Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm Chương HĨA CHẤT THÍ NGHIỆM 2.1 Đơn vị pha chế hóa chất 2.1.1 Đơn vị tỷ lệ phần trăm Thường gặp Đơn vị biểu hai phần vật chất cần sử dụng cần xác định lượng chất hai phần để pha chế xác Điều cần quan tâm phải ý đến đơn vị sử dụng: - w/v = weight/volume hay khối lượng thể tích Ví dụ: dung dịch muối 18% w/v hiểu dung dịch 180 g muối pha lít nước Cân 180 g muối, đong L nước pha muối với nước để có dung dịch cần thiết - w/w = weight/weight hay khối lượng khối lượng Ví dụ: dung dịch muối 18% w/v hiểu dung dịch 180 g muối pha kg nước Cân 180 g muối, kg nước pha muối với nước để có dung dịch cần thiết - v/v = volume/volume hay thể tích thể tích Ví dụng dung môi nước:cồn tỷ lệ 1:1 v/v hiểu dung mơi có L nước L cồn (tổng thể tích dung mơi thấp L) - g/L = gram lít (pha khối lượng g đến L) - ppm: part per milion hay phần triệu, tương ứng g triệu g, hiểu rộng mg/1kg, 1mg/L nước hay 1mL/L - % cbk, % tính khối lượng chất khơ có ngun liệu Ví dụ: 100g trà có độ ẩm 10% lượng naringin 100 mg% cbk có 100 g x (100%10%) = 90 g chất khô có lượng naringin 100mg% x 90 g chất khơ = 90 mg naringin - Đơn vị % thông thường, hiểu % tổng khối lượng Ví dụ dung dịch muối 21% dung dịch 21 g muối 89 g nước 2.1.2 Đơn vị nồng độ mol (M) nồng độ đương lượng (N) Thường gặp pha hóa chất chuẩn độ Đơn vị M = mol/L: - Ví dụ pha dung dịch chứa CuSO4 0,1 M Đơn vị 0,1 M tương ứng 0,1 mol CuSO4 pha 1L dung dịch, 100 mL CuSO4 0,1 M chứa 0,01 mol CuSO4 Ta tìm hóa chất CuSO4.5H2O nên lượng cần sử dụng 0,01 mol CuSO4.5H2O, tương ứng khối lượng 0,01 x 249,69 = 2,4969 g CuSO4 Dùng cân phân tích số lẻ để cân lượng 2,50 g CuSO4.5H2O, hòa Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm tan lượng nước 100 mL, chuyển dung dịch sang ống đong 100 mL, tráng dụng cụ đổ nước tráng sang ống đong sau định mức lên vạch 100 mL, đậy nắp lắp đều, ta có dung dịch cần pha - Cơng thức thường gặp pha loại hóa chất: C1V1 = C2.V2 Đơn vị N = đương lượng/L: - Nồng đương lượng hiểu tương đương nồng độ mol với công thức n.CN = CM; điểm khác dung số n hay số đương lượng - Để xác định xác n, cần biết xác chất phản ứng Thơng thường, n tính hóa trị, số ion H+, OH- phản ứng trao đổi số chêch lệch điện tích phản ứng oxy hóa - Ví dụ: NaOH có nhóm OH- nên n = 1, dung dịch NaOH 1N dung dụng NaOH 1M BaSO4 chất tạo thành từ phản ứng trao đổi, Ba có hóa trị nên n = Đối với KMnO4 tham gia phản ứng oxy hóa khử, (1) sản phẩm MnO2 tức mangan bị khử từ +7 +4, chênh lệch số oxy hóa tức n = 3; (2) sản phẩm K2MnO4 tức tức mangan bị khử từ +7 +6 chênh lệch số oxy hóa tức n = Vậy dung dịch KMnO4 0,03N trường hợp (1) dung dịch KMnO4 0,01 M trường hợp (2) dung dịch KMnO4 0,03 M - Công thức thường gặp hai chất phản ứng xác định với nồng độ đương lượng: CN1V1 = CN2.V2 Ví dụ: L NaOH 0,1 N phản ứng hết với 200 mL H2SO4 có nồng độ (1 x 0,1)/0,2 = 0,5 N 2.2 Quy trình pha chế hóa chất 2.2.1 Thứ tự pha chế Hóa chất cần pha chế theo thứ tự Thứ tự thể rõ cách tiến hành theo thứ tự trước sau Ví dụ: lấy lượng mL H2SO4 đậm đặc hịa tan mL nước sau chuyển sang bình định mức 100 mL định mức đến vạch Câu hiểu cần chuẩn bị cốc chứa mL trước, sau dùng pipet hay dụng cụ đong thủy tinh lấy xác 1mL H2SO4 cho từ từ vào cốc nước, sau chuyển sang bình định mức, tráng cốc, đổ nước tráng vào bình định mức đến vạch Không làm ngược lại, đổ mL nước vào mL H2SO4 đậm đặc chẳng hạn Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm Chất thị hỗn hợp (thuốc thử Tashiro): 200 mg đỏ metyl 100mg xanh metyl hòa tan 200ml etanol (C2H5OH) 96%; phenolphtalein, dung dịch 1% etanol 60% 7.4.3 Cách tiến hành Cân xác 10 – 15 g mẫu thử vào cốc thủy tinh dung tích 100ml Dùng nước cất hịa tan mẫu chuyển tồn (cả nước tráng cốc) vào bình định mức dung tích 250ml Thêm nước cất đến khoảng 200ml lắc phút, để yên phút, lặp lại lần Thêm nước cất đến vạch mức, lắc sau lọc Lấy xác 200ml dung dịch axit sunfuric 0,1N vào bình nón dung tích 250ml giọt thị hỗn hợp Đặt bình vào đầu ống sinh hàn máy cất đạm cho đầu ống sinh hàn ngập hẳn vào dung dịch Dùng pipet lấy xác 50ml dịch lọc mẫu thử cho vào bình cất máy cất đạm Thêm tiếp 20ml nước cất, giọt phenolphlatein 1% cho dung dịch magie oxyt 5% vào dung dịch bình xuất màu hồng Tráng nước cất cho dung dịch magie oxyt phễu khóa máy lại (để tránh bị amoniac cần khóa máy phễu cịn nước cất) Cuối giữ phễu lớp nước cất cao 1,5 - cm để kiểm tra độ kín máy (ghi toàn lượng nước cất cho vào bình cất để biết lượng nước cất cần thiết chuẩn độ mẫu trắng) Cho nước lạnh chảy qua ống sinh hàn cất liên tục 30 phút kể từ dung dịch bình bắt đầu sơi Hạ bình hứng để ống sinh hàn lên khỏi mặt nước Sau hứng nước ngưng chảy đầu ống sinh hàn, thử giấy pH, khơng có phản ứng kiềm Dùng natri hydroxyt 0,1N chuẩn độ lượng axit dư bình hứng dung dịch chuyển từ màu tím sang xanh mạ Tiến hành xác định mẫu trắng với lượng hóa chất, nước cất với bước thí nghiệm trên, khơng có mẫu thử 7.4.4 Tính tốn kết Hàm lượng nitơ amoniac (N-NH3) tính phần trăm, theo cơng thức: Trong đó: V1 – Thể tích dung dịch natri hydroxyt 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu trắng, tính ml; Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm V2 – Thể tích dung dịch natri hydroxyt 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu thử, tính ml; m – Khối lượng mẫu thử, tính g; 250 - Thể tích dịch pha lỗng mẫu thử, tính ml; 50 – Thể tích dịch lọc pha lỗng lấy xác định, tính ml; 100 – Hệ số tính phần trăm Đối với nước mắm số mẫu lỏng, mẫu thử pha loãng 20 lần, lấy 50ml dịch pha lỗng xác định Hàm lượng nitơ amoniac (X9) tính phần trăm theo cơng thức: Trong đó: 20 – Độ pha loãng nước mắm; 1000 – Hệ số tính g/l; Các ký hiệu khác ghi Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm Chương MỘT SỐ CHỈ TIÊU NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT 8.1 Phương pháp xác định hàm lượng đường (Phạm Văn Sổ Bùi Thị Như Thuận, 1991) 8.1.1 Nguyên tắc Dựa vào phản ứng đường nghịch đảo khử đồng dung dịch Fehling thành oxit đồng (Cu2O) có màu đỏ gạch 8.1.2 Chuẩn bị Hóa chất: NaOH 30%, 10%, 0,1N; Pb(CH3COO)2 30%; Na2SO4 bão hòa 30%; xanh metylen 1% nước; fehling A (CuSO4 tinh thể 69,28 g, nước cất đến 1000 mL dung dịch); fehling B (kalinatritartrate 346 g, NaOH 100 g nước cất đến 000 mL); phenolphtalein 1% cồn 8.1.3 Tiến hành Chuẩn bị mẫu + Cân g mẫu cần phân tích + 50 mL nước cất + mL HCl đậm đặc Trung hòa với NaOH với nồng độ giảm dần từ 30%, 10%, N (dùng phenolphtalein làm chất thị màu) Sau cho dung dịch vào bình định mức 100ml Khử tạp chất mL Pb(CH3COO)2 Để yên phút đến thấy xuất lớp chất lỏng suốt bên lớp cặn coi khử tạp chất xong Loại bỏ Pb(CH3COO)2 18 20 mL Na2SO4 Na2HPO4 Lắc để kết tủa lắng xuống Nếu có kết tủa Na2HPO4 tác dụng với chì acetate thừa để yên 10 phút, với Natri sunphat, lớp nước bên bị đục phải để lâu đến 24 Kiểm tra lại xem kết tủa chì acetate thừa chưa cách cho cẩn thận vài giọt dinatri phosphat hay Natri sunphat Nếu không thấy đục, chất lỏng tiếp xúc với coi hết chì acetate Thêm nước cất vào dung dịch cho đủ 100mL Lọc, pha loãng sử dụng Tuỳ hàm luợng đường thực phẩm mà ta có HSPL khác nhau.Ví dụ: hàm lượng đường 60% cân gam pha lỗng 2÷3 lần Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm Cho vào becher mL fehling A + mL fehling B + 15 mL dịch lọc Đem đốt bếp chuẩn độ Mỗi lần chuẩn nhỏ 1mL dung dịch đường đến màu đỏ gạch khơng cịn ánh xanh Thử lại cách nhỏ giọt xanh metylen vào dung dịch sôi thấy màu xanh trở màu đỏ gạch Đọc kết tra bảng tính hàm lượng đường 8.1.4 Cơng thức tính toán Bảng 8.1: Bảng tra hàm lượng đường nghịch chuyển mL dung dịch đường sử dụng Lượng đường nghịch chuyển mg/100 mL mL dung dịch đường sử dụng Lượng đường nghịch chuyển mg/100 mL mL dung dịch đường sử dụng Lượng đường nghịch chuyển mg/100 mL mL dung dịch đường sử dụng Lượng đường nghịch chuyển mg/100 mL 15 16 17 18 19 20 21 22 23 336 316 298 282 267 254,5 242,9 231,8 222,2 24 25 26 27 28 29 30 31 32 213,3 204,8 197,4 190,4 183,7 177,6 171,7 166,3 161,2 33 34 35 36 37 38 39 40 41 156,06 152,2 147,09 143,9 140,2 136,6 133,3 130,1 127,1 42 43 44 45 46 47 48 49 50 124,2 121,4 118,7 116,1 113,7 111,4 109,2 107,1 105,1 Hàm lượng đường = Số tra bảng*HSPL*100 % (mg/100mL) Khối lượng mẫu*1000 8.2 Phương pháp xác định độ acid toàn phần (Phạm Văn Số Bùi Thị Như Thuận, 1991) 8.2.1 Nguyên tắc Dùng dung dịch kiềm chuẩn NaOH KOH để trung hòa hết lượng acid có thực phẩm 8.2.2 Chuẩn bị mẫu Mẫu rắn: Cân xác khoảng 10 g thực phẩm, nghiền nhỏ, lắc với nước trung tính Sau cho thêm nước trung tính vừa đủ 50 ml, lọc lấy dịch trong, lấy 25 mL nước đem định lượng Tài liệu lưu hành nội Phòng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm Mẫu lỏng: lấy V mL định lượng thẳng Nếu thực phẩm có màu sẫm, pha lỗng với nước trung tính cồn trung tính để dễ nhận biết điểm chuyển màu 8.2.3 Phân tích dịnh lượng Cho mẫu thử vào bình nón tam giác 25 mL dịch thử + giọt dung dịch phenolphtalein Chuẩn độ dung dịch NaOH 0,1 N từ buret xuống dịch thử có màu hồng nhạt bền vững 8.2.4 Tính kết Độ acid tồn phần tính theo phần trăm tính cơng thức: X = K*n*(50/25)*(100/P) Trong đó: n: Số mL NaOH sử dụng để chuẩn độ 25 mL dung dịch thử P: Khối lượng mẫu thử, tính gam K: Hệ số loại acid Hệ số acid sử dụng acid cirtric: K = 0,0064 Với sữa thực phẩm lên men lactic, K = 0,009 Với dấm, acid acetic, K = 0,006 8.3 Phương pháp phân tích hàm lượng vitamin C (phương pháp Muri) 8.3.1 Nguyên tắc Vitamin C có hai dạng đồng phân quang học D L, dạng D hoạt tính sinh học Định lượng vitamin C dựa tính khử thuốc thử 2,6 diclophenol – indophenol Dạng oxy hóa thuốc thử 2,6 diclophenol – indophenol có màu xanh bị khử acid ascorbic có dung dịch chiết nguyên liệu thành dung dịch không màu Ở điểm cân bằng, tất acid ascorbic phản ứng hết thuốc thử màu dư khơng bị khử có màu hồng dung dịch 8.3.2 Tiến hành Cân gam mẫu có chứa acid ascorbic thái nhỏ, chuyển sang cối sứ với 20 mL HCl 1%, chắt lấy dịch ngâm giữ lại cốc, đem phần thịt nghiền mịn, xong chuyển sang bình định mức 100 mL với dung dịch HCl 1% vừa chiết Rửa cối tráng dụng cụ nhiều lần (3 lần), lần Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm acid oxalic 1% dồn vào bình định mức Dùng acid oxalic 1% để đưa thể tích lên vạch 100mL Lắc kỹ, để yên 10 phút lọc qua giấy lọc khô Tiến hành thí nghiệm mẫu đối chứng: Lấy mL acid oxalic 1% + 2mL HCl 1% cho vào bình tam giác 100 ml, dùng microburet với 2,6 diclophenol – indophenol 0,001N để chuẩn độ đến xuất màu hồng bền 30 giây Chuẩn độ mẫu thật: Dùng pipet hút 10 mL dịch lọc chứa vitamin C, cho vào bình tam giác dung tích 100 mL, tiến hành chuẩn độ mẫu đối chứng 8.3.3 Tính tốn kết X= (a-b)*V*100*0,088 (mg%) v*m Trong đó: a số mL trung bình chuẩn mẫu thật b số mL trung bình chuẩn mẫu đối chứng 0,088 số mg acid ascorbic tương đương với 1mL dung dịch chuẩn 2,6 diclophenol – indophenol 0,001N V thể tích dịch chiết ban đầu v thể tích dung dịch chiết lấy để định chuẩn m: khối lượng mẫu vật cân lúc đầu (g) Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm Chương PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC 9.1 Định tính số thành phần có hoạt tính sinh học 9.1.1 Định tính tannin a) Thuốc thử - Chuẩn bị 100 mL dung dịch FeCl3 5% (w/v): Hòa tan g FeCl3 vào nước, cho vào bình định mức 100 mL, bổ sung nước đến vạch định mức - Chuẩn bị 100 mL dung dịch gelatin mặn- gelatin 1% dung dịch NaCl 10% (w/v): Cân 10 g NaCl hịa tan vào nước, sau bổ sung từ từ g gelatin, khuấy trộn để tan hoàn toàn, cho vào bình định mức 100 mL thêm nước đến vạch - Chuẩn bị 100 mL dung dịch chì acetate 10% (w/v): Hòa tan 11,52 g Pb(CH3COO)2.3H2O vào nước, cho vào bình định mức 100 mL, bổ sung nước đến vạch định mức b) Cách thực Mẫu dịch chiết chia thành phần, phần mL để kiểm tra phương pháp: - Kiểm tra FeCl3 5%: hòa tan giọt FeCl3 5% vào phần thứ (khoảng mL dịch chiết), màu sắc sản phẩm thay đổi từ màu xanh đen sang xanh olive chứng minh có tồn tannin - Kiểm tra gelatin mặn: lấy mL dịch chiết (phần thứ 2), cho vào 15 giọt gelatin mặn, có xuất kết tủa bơng trắng chứng minh có tồn tannin - Kiểm tra chì acetate 10%: hịa tan giọt chì acetate 10% vào phần thứ (4 mL) có xuất kết tủa màu chứng minh có tồn tannin Sự diện tannin có hàm lượng cao phương pháp xác định cho kết dương tính 9.1.2 Định tính flavonoid a) Thuốc thử - Chuẩn bị 100 mL dung dịch NaOH 10% (w/v): Hòa tan 10 g NaOH rắn vào nước đến tan hồn tồn, cho vào bình định mức 100 mL định mức đến vạch nước cất Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm Chuẩn bị 100 mL dung dịch FeCl3 1% (w/v): Hòa tan g FeCl3 vào nước, cho vào bình định mức 100 mL, bổ sung nước đến vạch định mức b) Cách thực Mẫu dịch chiết chia thành phần, kiểm tra phương pháp - Kiểm tra NaOH 10%: Cho mL dịch chiết vào ống nghiệm Sau thêm vào mL dung dịch NaOH 10% Nếu thấy xuất màu vàng cho thêm HCl 10% trở thành khơng màu, cho biết mẫu dịch chiết có flavonoid Kiểm tra FeCl3 1%: mL dung dịch nhỏ thêm giọt FeCl3 1% vào xuất màu xanh đen chứng tỏ có mặt flavonoid 9.1.3 Định tính anthraquinone a) Thuốc thử Amoni 10% (đã nhà sản xuất chuẩn bị sẵn nồng độ tương ứng) b) Cách thực Lấy mL mẫu cho vào ống nghiệm với mL chloroform; lắc mạnh phút Hỗn hợp lọc sau thêm vào dung dịch amoni (NH4OH) 10% có khối lượng khối lượng dịch lọc, có màu đỏ tím hồng lớp nước cho thấy diện anthraquinone tự 9.1.4 Định tính alkaloid a) Thuốc thử - Dragendorff: Bi(NO3)3 trung hoà (20g), HNO3 đđ (30g), KI (68g), H2O (250 mL) - Bouchardat: I2 (2,5g), KI (5g), H2O (100 mL) b) Cách thực Cho vào ống nghiệm mL dịch mẫu, nghiêng ống nghiệm nhỏ từ từ giọt đến hết 1mL thuốc thử theo thành ống nghiệm, lắc đều, để yên, quan sát + Thuốc thử Dragendorff: cho kết tủa vàng cam đến đỏ dương tính, có diện alkaloid + Thuốc thử Bouchardat: cho kết tủa màu nâu vàng đậm dương tính Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm 9.1.5 Định tính saponin Cách 1: Lấy mL mẫu đặt ống nghiệm có khoảng 10mL nước cất; lắc mạnh 30 giây sau để yên 30 phút quan sát Nếu có bọt hình thành cho thấy diện saponin Cách 2: Cho giọt máu động vật vào dịch chiết ống tiêm trộn nhẹ nhàng cách đảo ngược ống (không lắc), để yên 15 phút Việc lắng xuống tế bào máu đỏ biểu thị diện saponin 9.2 Xác định hàm lượng polyphenol tổng (TPC) 9.2.1 Nguyên tắc Dựa nguyên tắc phản ứng oxy hóa khử, dùng acid gallic làm chất chuẩn Thuốc thử Folin-Ciocalteu chất oxy hóa, làm giảm hàm lượng polyphenol dễ dàng bị oxy hóa nhóm hydroxy phenolic tạo thành màu xanh lam với độ hấp thụ cực đại bước sóng 738 nm Đó hình thành ion superioxide Hàm lượng polyphenol tổng (TPC) xác định nhờ phương pháp so màu 9.2.2 Cách thực hiện: (1) Chuẩn bị thuốc thử, hóa chất - Pha dung dịch 100 mL Folin- Ciaucalteu 10% (thể tích): Hịa tan 10 g Folin- Ciaucalteu vào nước cất (khoảng 70 mL) đến tan hồn tồn Cho vào bình định mức 100 mL định mức đến vạch nước cất Trữ lạnh 4C sử dụng ngày - Pha 500 mL Na2CO3 20%: Hòa tan 100g Na2CO3 vào 400 mL nước, khuấy đến tan hoàn toàn Bảo quản nhiệt độ phòng (đến tháng) - Pha 100 mL dung dịch acid gallic 100 ppm: Cân (0,110 ± 0,001) g acid gallic ngậm phân tử nước (M = 188,14) cho vào bình định mức vạch 100 mL Hịa tan nước, pha lỗng đến vạch trộn Sử dụng ngày (2) Chuẩn bị đường chuẩn acid gallic theo Bảng PL 1.1 Từ giá trị mật độ quang đo được, vẽ đồ thị biểu diễn thay đổi mật độ quang A (Hàm y) theo nồng độ acid gallic (hàm x) có dạng y = ax + b (3) Xác định hàm lượng polyphenol tổng dịch chiết khảo sát: Cho 0,1 mL dịch chiết phản ứng với 1,5 mL FC 10%, để yên phút thêm mL Na2CO3 20% định mức đến 10 mL nước cất Hỗn hợp để yên bóng tối 30 phút đo độ hấp thu bước sóng 738 nm, ghi giá trị Amẫu Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm - Thay giá trị Amẫu vừa đo vào giá trị y phương trình đường chuẩn y = ax + b, suy x = Cx (ppm) - Tính hàm lượng polyphenol tổng số có 100 g bột vỏ chuối xiêm ban đầu theo cơng thức Trong : Cx : nồng độ TPC mẫu đo, xác định từ đường chuẩn (ppm) Vđo: thể tích ống đo (10 mL) Vđm: thể tích dịch chiết polyphenol thu (Vđm, mL) Vhút: thể tích dịch định mức hút vào ống nghiệm (0,1 mL) m: khối lượng bột vỏ chuối xiêm sử dụng để trích ly (g) Bảng 9.1: Phương pháp dựng đường chuẩn acid gallic Số TT ống 10 Acid gallic 100ppm (mL) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 Na2CO3 (mL) 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 Nước cất (mL) 4,5 4,4 4,3 4,2 4,1 3,9 3,8 3,7 3,6 3,5 Nồng độ (ppm) 10 FC (mL) Lắc đều, để yên phút Lắc ủ điều kiện bóng tối, nhiệt độ phịng 30 phút Đo quang bước sóng 738 nm Hình 9.1: Đồ thị tương quan nồng độ acid gallic độ hấp thu Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm 9.2.3 Tính tốn kết Đối với mẫu cao chiết, hàm lượng polyohenol tính sau: B= Trong đó: Vcao: Thể tích cao chiết sử dụng để pha loãng, tạo dung dịch đo (mL) Vđm2: Thể tích dịch chiết pha lỗng từ thể tích Vcao (mL) Trường hợp tính hàm lượng polyphenol tổng cao chiết theo khối lượng: C= Khi mcao: Khối lượng cao chiết sử dụng để pha loãng, tạo dung dịch đo (g) 9.3 Xác định hoạt tính chống oxy hóa hợp chất sinh học Sử dụng phương pháp xác định gốc tự hiệu chỉnh xác định TEAC, với chất chuẩn DPPH (2,2 –Diphenyl–1–picrylhydrazyl) Trolox Gốc tự vị trí nguyên tử nitơ DPPH phản ứng với hợp chất có khả cho nguyên tử hydro làm giảm màu tím ban đầu dung dịch DPPH (có thể chuyển dần sang màu vàng nhạt) Hàm lượng DPPH lại dung dịch sau phản ứng xác định phương pháp so màu bước sóng 517 nm mL DPPH 0,1 mM phản ứng với 0,1 mL dịch chiết, hỗn hợp định mức đến mL cồn, để yên khoảng 30 phút đo độ hấp thu bước sóng 517 nm Hiệu chỉnh xây dựng đường chuẩn Trolox TEAC tính theo µmol Trolox/g chất khơ (CK) (Chmelová et al., 2015) Trong đó: Cx : nồng độ TPC ống (ppm) Vđo: thể tích ống đo (mL) Vđm: thể tích định mức (mL) Vhút: thể tích dịch định mức hút vào ống nghiệm (mL) Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm W: độ ẩm mẫu (%) M = 250,29: phân tử lượng Trolox m: khối lượng mẫu ban đầu (g) Bảng PL1.2 Phương pháp dựng đường chuẩn theo Trolox Số ống Trolox 50 ppm (mL) 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, Mẫu (mL) DPPH (0,1mM) Cồn etylic (mL) Nồng độ (ppm) Mẫu Mẫu Mẫu 0 0,1 0,1 0,1 0,9 0,9 0,9 mL 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 2 Cx Lắc ủ điều kiện bóng tối, nhiệt độ phòng 30 phút Đo quang bước sóng 517 nm Hình PL1.2 Đồ thị đường chuẩn AC theo Trolox 9.4 Phân tích flavonoid tổng qua phản ứng với aluminium chloride (Madal et al.,2013) 9.4.1 Nguyên tắc Phương pháp xác định dựa việc đo độ hấp thu ánh sáng dung dịch phức, tạo thành chất cần xác định với thuốc thử vô hay hữu cơ, mơi trường thích hợp Đối với flavonoid tạo màu vàng tạo phức với aluminum chloride (AlCl3), đo độ hấp thụ bước sóng 415 nm Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm 9.4.2 Tiến hành Hút mL dịch trích vào ống nghiệm, cho thêm mL methanol, 0,2mL aluminum chloride (10%), 0,2 mL sodium acetate 1M 5,8 mL nước cất Giữ nhiệt độ phòng 30 phút đo độ hấp thu hỗn hợp phản ứng 415 nm Hàm lượng flavonoid thể qua miligram đương lượng QE gram chất khơ phân tích Dựa vào đường cong chuẩn điều chế cách pha loãng quercetin ethanon (y = 0,0054x + 0,0026 R2= 0,9995) Hàm lượng flavonoid tổng (TFC), miligam quercetin tương đương) gram chất khơ (DM), tính theo cơng thức sau: TFC = ((A-0,0026)*DF*V*100)/(0,0054*m*(100-W)) Trong đó: TFC: hàm lượng flavonoid tổng (mg QE/g CKNL) A: độ hấp thu mẫu thử nghiệm DF: yếu tố pha loãng (DF = 10) V: thể tích dịch trích thu (L) m: khối lượng mẫu trích ly (g) W: phần trăm ẩm mẫu vật liệu (%) 9.5 Phương pháp xác định hàm lượng naringin (Davis, 1947) 9.5.1 Nguyên tắc Dựa vào mối quan hệ mật độ quang nồng độ dung dịch theo định luật Lambert – Beer A= = .C.l Trong đó: : hệ số hấp thu phân tử C: Nồng độ dung dịch (mol/l) L: Chiều dài đường chuyền ánh sáng (cm) A: độ hấp thu quang Phương trình với tia sáng đơn sắc Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm Trong phân tích định lượng phương pháp trắc quang người ta chọn bước sóng định, chiều dài l cuvet định lập phương trình độ hấp thụ quang A nồng độ C Cơ sở phương pháp phan tích hàm lượng naringin dựa vào phản ứng tạo màu vàng đặc trưng naringin với Ethylene glycol môi trường kiềm Tùy vào hàm lượng naringin có mẫu mà màu vàng có độ đậm nhạt khác Sử dụng máy đo quang phổ UV - VIS để xác định hàm lượng naringin mẫu theo phương pháp Davis (1947) Dựa vào giá trị độ hấp thu đo với phương trinh đường chuẩn, ta xác định hàm lượng naringin dung dịch mẫu 9.5.2 Tiến hành Cân 3g sản phẩm nghiền nhuyễn cho vào cốc thủy tinh 50ml, thêm vào 42ml cồn 80o Mẫu chiết tách 70oC, thời gian giờ, sau lọc qua giấy lọc để thu hồi dịch trích Lấy 0,1ml dịch lọc cho vào bình định mức 10ml, thêm 0,1ml dung dịch NaOH 4N, sau định mức ethylen glycol đén vạch, để yên 15 phút để hình thành màu vàng Sau cho vào cuvet đem đo màu Mật độ quang đọc bước sóng 420nm sử dụng máy đo quang phổ Chuẩn bị mẫu trắng: Lấy 0,1ml nước cất, thêm 0,1ml NaOH 4N, định mức ethylen glycol đến vạch 9.5.3 Tính tốn kết Hàm lượng naringin xác định dựa vào đường chuẩn naringin Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006 Cơ Phân tích Phịng thí ngiệm Hình 9.1: Đường chuẩn naringin Tài liệu lưu hành nội Phịng Thí nghiệm D006