THUY - NAM MEN

Tiểu luận nấm men độc ChươngI MỞ ĐẦU Như biết nấm men ứng dụng nhiều lónh vực:trong công nghệ thực phẩm, y học ngành công nghiệp nhẹ khác Nấm nem thuộc thể đơn bào, chúng phân bố rộng khắp nơi Đặc biệt chúng có nhiều đất trồng nho nơi trồng hoa Ngoài thấy có mặt trái chín, nhụy hoa, không khí, … Nấm men có hình dáng kích thước khác Thường chúng có hình cầu, hình elip, hình bầu dục hình que Một số loài nấm men có tế bào hình que nối với thành sợi gọi khuẩn ty hay khuẩn ty giả Nhiều tế bào nấm men sử dụng để hoàn tất trình lên men Chỉ vài hệ tế bào đạt tới số lượng cực đại Hầu hết nhà làm rượu vang thích lượng lớn nuôi cấy giống nấm men nuôi cấy nhanh chóng lấn át vi sinh vật khác Nấm men độc khám phá năm 1963 Nhiều thông tin nòi nấm men độc nghiên cứu từ đó, kiểu hình độc hại nấm men S.cerevisiea mô tả lần vào năm 1963 (do Bevan Makower,1963; Somers Bevan,1969), điều chắn nòi loài nấm men độc đựơc xếp vào ba kiểu hình: độc hại, nhạy cảm, trung lập Khi tế bào nhạy cảm tế bào độc hại phát triển môi trường nuôi cấy tế bào nhạy cảm bị chết với tỷ lệ cao, tế bào trung lập không tiêu diệt tế bào nhạy cảm không bị tiêu diệt tế bào độc hại khác Hiện có khoảng loài nấm men tạo độc tố Biểu độc nấm men biểu mô hình mẫu gây nhiều ý đến nhà Sinh vật học, Thực vật học, Vi trùng học, chuyên gia nấm, nhà dược học Sự kiện biểu độc hại lang rộng đáng ngạc nhiên số VSV tính phân loài, gồm tác nhân gây bệnh prokaryot eukaryot Và kiện gây quan tâm ý nghóa sinh học Trang Tiểu luận nấm men độc áp dụng lý thuyết vào thực tiễn Các nghiên cứu hội điều trị bệnh cách sử dụng nấm men độc mở hướng cho việc ngừa kiểm soát chứng bệnh có khả gây chết người nấm gây thông qua mạng idiotypic điều khai thác cách ngẫu nhiên hệ miễn dịch trình nhiễm trùng tự nhiên Nấm men độc tạo độc tố protein hay glycoprotein, độc tố có hại với nòi nấm men khác miễn dịch với độc tố Không phải tất loài nấm men điều nhạy cảm với độc tố Tính độc xác định quan sát ức chế phát triển nòi nấm men với nấm men khác Nghiên cứu cho thấy độc tố có hoạt tính với pH – Tuy nhiên nhiều độc tính lại rượu vang có pH – tiêu diệt vi sinh vật Nhiều nhà nghiên cứu hy vọng nấm men độc sử dụng trì môi trường nuôi cấy tinh khiết Không may điều dường thực dù độc tố độc với vài nấm men chúng không ảnh hưởng đến chủng khác độc tố nấm men ảnh hưởng bất lợi người tiêu thụ Trang Tiểu luận nấm men độc Chương II ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA NẤM MEN ĐỘC Khái niệm nấm men độc: Nấm men độc nấm men tiết độc tố gây hại nấm men nhạy cảm miễn dịch với độc tố 2.Những giống nấm men độc: Từ đặc điểm gây độc Saccharomyces cerevisiae phát phòng thí nghiệm, sau nhiều nòi nấm men độc, nhö: Saccharomyces, Hansenula, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Kloeckera, Hansenniaspec, Khodotoreela, Trichosporon, Debaryomyces Cryptococus phân lập từ nguồn khác Theo điều tra Trung Tâm Nấm Men Quốc Gia Anh phát 964 giống nấm men 59 giống thể tính độc, 38 giống thuộc Saccharomyces giống lại thuộc Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces Debaryomyces (Philliskirk and Young, 1975) Nấm men độïc phân thành 10 nhóm (K1 đến K10) dựa phản ứng trực tiếp giống sinh độc tố với loài khác (Young Yagiu, 1978) Candida glabrata sinh độc tố phát phòng thí nghiệm (Bussey Skipper, 1975) xếp vào nhóm thứ 11, K11 (Wickner, 1979) Hầu hết nấm men độc (có chứa độc tố) nghiên cứu định danh Những nghiên cứu có liên quan đến kiểu gen độc tố Những giống nấm men độc phục vụ cho hoạt động thương mại hầu hết dạng khô Hình thái, cấu tạo nấm men độc: a Hình thái: Giống loài nấm men khác, thuộc thể đơn bào, phân bố khắp nơi, đặc biệt chúng có nhiều đất trồng nho, nơi trồng hoa quả,… Trang Tiểu luận nấm men độc Chúng có hình dáng kích thước khác nhau: hình cầu, hình elíp, hình bầu dục b cấu tạo: Cấu tạo tế bào nấm men độc gần giống virut Cơ thể chúng tạo thành bưởi: thành tế bào nhân - Thành tế bào cấu tạo từ chất như: kitin, glucan ( β-1,3-D-glucan β-1,6-D-glucan ) monoprotein - Nhân a.nucleotic plasmid DNA sợi đơn, đoạn dsRNA VD: - Kluyveromyces lactic nhân chứa 2plasmid DNA sợi đơn : pGKL1 (8,9kb) pGKL2 (13,4 kb) - Ustilago maydis nhân chứa đoạn gen dsRNA Vì chúng có tính di truyền giống virut Môi trường phân lập nấm men độc: Những giống nấm nem sinh độc tố phân lập từ tự nhiên, thực phẩm lên men sản phẩm giải khát; 17% phân tích từ trái cây, nấm mũ, mục đất Những giống phân bố loại nấm men: Saccharomyces, Pichia, Hanssenula, Kluyveromyces Cryptococcus (Stumm et al, 1977) Starmer et al (1987) phân lập nòi gây độc từ loài khác mẫu từ nấm men liên quan đến trồng Chúng xuất tác nhân gây hư hỏng lên men bia truyền thống (Maule Thomas, 1973), rượu (Heard Fleet, 1987) rượu Sake (Imamura et al, 1974) Trong vài trường hợp, giống gây độc nguyên nhân gây vấn đề đáng ngại lên men làm hương sản phẩm Bortol et al, (1986) phân lập giống Saccharomyces cerevisie gây độc từ bánh mì, táo, măng tây dấm Nấm men sinh độc tố tìm thấy thực phẩm lên men ø miso, sốt đậu nành rau muối xác định Hansenula anomala, Pichia farinosa, Debaryomyces hansenii vaø Candida naeodendra (Kagiyama et al, 1988; Suzzuki et aaal, 1989 ) Suzzuki et al (1989) cho biết men độc yếu deryomyces có 76 % rau muối Trang Tiểu luận nấm men độc Những giống nấm men sinh độc tố phát nấm men gây bệnh từ loài Crytococus, Candida Trichosporon (Kandel Stern, 1979; Middlebeek et al, 1980) Chúng gây bệnh nấm thể người Hệ sinh thái nấm men độc: Kiểu hình tự nhiên nấm men độc cho thấy tính cạnh tranh, độc tố ngăn cản vi sinh vật cạnh tranh nguồn dinh dưỡng tạo điều kiện chọn lọc suốt trình phát triển sinh vật Độc tố nấm men tạo đáng kể phát triển tế bào môi trường có nguồn dinh dưỡng cao pH thấp Sinh thái nấm men độc (tạo độc tố tính nhạy cảm) nghiên cứu chi tiết nhóm nấm men điển hình thực vật thối rữa, trái nhựa Những nấm men có tính trội phân lập từ trái cây, tính độc chúng sau thời gian ngắn nuôi cấy phòng thí nghiệm, có lẽ ủ nhiệt độ cao làm plasmid Chứng cớ cảnh báo nhà nghiên cứu hiểu sai đối tượng tương tác nhạy cảm với độc tính nấm men việc chọn lựa môi trường Những yếu tố môi trường pH cho thấy nấm men độc nấm men nhạy cảm không phân bố độc lập nhau, quần xã độc tố hạn chế phát triễn nấm men khác Tuỳ thuộc vào đặc điểm sinh thái môi trường vùng, thực vật chủ, vùng tồn hai loại nấm men, nấm men tạo độc tố giết tế bào nấm men nhạy cảm Những giống S cerevisiae P anomala hạn chế rõ phát triển loài nấm đảm (sống gỗ mục) nấm gây bệnh thực vật Nấm men xem tác nhân điều khiển sinh học chống nấm lạ Nấm men độc công nghiệp: Trong năm gần cố gắng đáng kể tạo kỹ thuật chấp nhận trình sinh học vào công nghiệp thực phẩm Qui trình lên men Trang Tiểu luận nấm men độc đưa đến chất lượng thực phẩm, rượu, nước nho, bia Nấm men độc chọn trình lên men Nhiều giống ứng dụng sản xuất, lên men cồn, lên men lactic Do trách nhiệm vi sinh vật chuyển hóa sinh học nấm men vi khuẩn xem xét kỹ trao đổi chất vi khuẩn mục đích công nghiệp Nấm men độc lên men tư nhiên khảo sát Những nấm men độc tìm thấy 88% trình lên men nhà máy rượu vang nghiên cứu, phổ biến chúng có ảnh hưởng lên men thời gian thu hoạch S cerevisiae nấm men lên men chiếm nhiều ưu thành phần hóa học chất thuận lợi cho phát triển nấm men thực vật phân sinh Các thông số môi trường (nhiệt độ, oxy hóa, pH, vi khuẩn đối kháng) thay đổi điều kiện nuôi cấy, phát triển, dẫn đến lên men rượu thành công Theo lịch sử, lên men để sản xuất rượu vang nấm men như: Kloeckera, Metschnikowia, Hanseniaspora spp, khắc phục vấn đề tiêu chuẩn hóa, sử dụng môi trường tinh khiết cho nòi chọn lọc tạo rượu nho Tất nòi tạo rượu vang có độc tố K2 tìm thấy trình lên men, nòi lại có thành tế bào kháng với độc tố quan hệ kiểu gen.Trong lên men rượu vang S cerevisiae có pH từ đến 3.5 làm giảm đáng kể độc tố K1 so với K2 độc tố K2 hầu hết phóng thích trình lên men rượu vang Hệ thống sinh học liên quan đến plasmid dsRNA: Hai plasmid dsRNA có mặt Saccharomyces cerevisiae, Hanseniaspora uvarum Kloeckera apiculata kiểm soát Trong Saccharomyces cerevisiae có loại độc tố liên quan đến plasmid dsRNA xác định Loại K1, K2 K3 xác định Young Yagiu (1978) loại (KT28 “K3”) đïc tìm thấy từ quần xã sinh vật nấm men (Pfeiffer Radler, 1982) nấm men rượu (Extremera et al, 1982) Hệ thống sinh độc tố Saccharomyces cerevisiae gồm có phân đoạn dsRNA phân biệt theo kích thước L M Kích thước M dsRNA loại Saccharomyces cerevisiae sinh độc khác K1 (1.9kb), K2 (1.7kb), K3 (1.5kb), KT28 (1.99kb), “K3” (20 kb), kích thước L dsRNA khác biệt loại (4.7 Kb) Giống sinh độc tố Hanseniaspora uvarum K apiculata chứa L dsRNA kích thước với phát giống Trang Tiểu luận nấm men độc Saccharomyces cerevisiae, M dsRNA với kích thước khác loài (Kitano et al, 1987; Zorg et al, 1988 ) L vaø M dsRNA bao bọc capsid (Herring and Bevan, 1974; Hopper et al, 1977) Hai phân đoạn dsRNA, gen M mã hóa cho khả sinh độc tố gen L mã hóa cho tổng hợp mạch protein vỏ capsid cho gen (Tipper Bostian, 1984) Trong Saccharomyces cerevisiae sinh độc tố, gen sản xuất độc tố K1 đoạn gen M1 dsRNA nghiên cứu kỹ (Bostian et al, 1984), đoạn M1 dsRNA chứa phân đoạn, M1-1 (1kb) M1-2 (0.6kb) phân biệt Adenine – Uracil (AU) liên tiếp ( 0.2kb) M1-1 mã hóa sản xuất độc tố K1, (Bostian et al, 1984) Sự thể chức plasmid phụ thuộc vào nhiễm sắc thể (Wickeser, 1978; Tipper Bostian, 1984) Gen MAK SKI bị ảnh hưởng plasmid dsRNA (Wickner, 1986) Gen KEX1 KEX2 mã hoá cho carboxypeptidase endopeptidase liên quan đến trình sinh độc tố (Bussey et al.,1983) Hơn nữa, có nhiều gen khác SEC (sự tiết độc tố), END (endocytosis), KHR (độc tố chịu nhiệt), KHS (độc tố không chịu nhiệt), VPL REX công bố Wickner Leibowitz, 1976; Al - Aidroos vaø Bussey, 1978; Bussey et al, 1983; Chvatchko et al, 1986; Rothman vaø Stevens, 1986 Ngoaøi ra, số giống sinh độc có liên quan đến L M dsRNA tìm thấy gần Candia stellata (Shimizu et al) Giống S cerevisiae với M dsRNA không mã hoá cho độc tố kháng lại độc tố K1 K2 (Wingfield et al,1990; Shimizu et al) xác định Hệ thốáng sinh độc liên quan đến Plasmid DNA sợi đơn: Hệ thống sinh độc liên quan đến Plasmid DNA sợi đơn phát nấm men Kluyveromyces lactic Giống sinh độc K lactic chứa plasmid DNA sợi đơn, pGKL1 (8,9Kb) pGKL2 (13,4 Kb) Trong pGKL1 mã hoá cho việc sản xuất độc tố, pGKL2 cần phải có để trì tồn pGKL1 Số lượng nucleotid xếp pGKL1 (887bp) pGKL2 (1345bp) Những plasmid thuộc loại protein cuối gắn protein thứ truyền vào S cerevisiae hợp nguyên sinh chất biến đổi trì ổn định S cerevisiae, plasmid thể hiệân khả sinh độc tố Trang Tiểu luận nấm men độc Khi nghiên cứu hệ thống sinh độc tố dsRNA, chức gen nhiễm sắc thể giống K lactic theo dõi Gen K lactic KEX1 chép có tính đồng thể với gen KEX2 endopeptidase S cerevisiae, nhà khoa học cho chúng thực trình chuyển gen αβ thành tiểu đơn vị α β độc tố Những giống nấm men sinh độc tố khác: Những độc tố khác mô tả S cerevisiae, KHR (độc tố chịu nhiệt) KHS(độc tố không chịu nhiệt) chúng khác tính chịu nhiệt pH Độc tố KHR KHS trưởng thành protein sợi đơn, trọng lượng phân tử khoảng 20 75kDa, mã hóa nhiễm sắc thể thứ độc tố hoàn thành có khối lượng phân tử nhỏ lúc thành lập Quá trình tổng hợp protein xem xảy suốt trình phát triển tế bào Gen KHR, KHS bao gồm 888 2.124 cặp bazơ, không giống với gen sinh đốc tố khác KHR mã hóa cho protein 33kDa, có đầu kỵ nước, có điểm nhận biết protease Độc tố KHR vùng kỵ nước rõ ràng kiểu phản ứng khác với K1 KHS mã hóa cho protein 79kDa có đầu kỵ nước, tạo độc tố hoàn chỉnh Độc tố KHS cho thấy ba nhóm amino acid kỵ nước có chức ion hóa tương tự K1 K2 gen mã hóa cho tính độc chứa đựng vùng đáp ứng miễn dịch nấm men độc tố chúng 10 Độc tố nấm men: Đến độc tố phân lập mô tả đặc điểm bảng sau: Nấm men độc Bản chất Phân tử lượng (kDa) pH tối Tham khảo thích S cerevisiae (K1) Protein 20 4,6 – 4,8 Bostia et al (1984) S cerevisiae (K2) Glycoprotei 16 4,2 Trang Pfeifer Radler Tiểu luận nấm men độc n (1984) S cerevisiae (KT28) Glycoprotei n 16 5,8 Pfeifer (1984) vaø Radler S cerevisiae (KHR) Protein 20 5,7 Klyveromyces Glycoprotei n 180 4,0 – 8,0 Stark et al., (1990) Pichia kluyveri Glycoprotei n 19 3,8 – 4,0 Middelbeek (1970) Hansenula mrakii Protein 10,7 4,0 – 9,0 Ashida et al (1983) Hansenula saturnus Protein 11 12 Candida sp SW-55 Glycoprotei n >200 3,8 – 5,8 Yokomori et al (1988) Pichia farinosa Protein 25 2,0 – 4,0 Suzuki (1989) Hansenula anomala Glycoprotei n 300 Hanseniaspora uvarum Protein 18 Goto et al., (1990) et – 3,5 – 7,0 Henschke (1979) - vaø Kagiyama (1988) Nikkuni et 4,0 – 4,5 Radler et al (1990) Chúng protein glycoprotein, số đơn vị tiểu phần Hầu hết độc tố không ổn định nhiệt độ cao pH cao; độc tố giống Hansenula sinh thể tính ổn định cao (Henschke,1979; Ashida et al.,1983) Hai giống nấm men độc tố P farinosa H anomala, sản xuất độc tố mà tính gây độc chúng tăng theo tăng nồng độ NaCl (Kagiyama et al, 1988; Suzuki Nikkuni,1989) Trong độc tố giống S cerevisiae K3 tiết có chứa 18 kDa glycoprotein Ngoại trừ độc tố KHR, độc tố S cerevisiae hoạt động chống lại giống nấm men nhạy cảm gồm có S cerevisiae, C glabrata độc tố H mrakii, K lactis, K drosphilarum Candida spp SW–55 có quang phổ chống nấm men rộng nhiều Trang al al Tiểu luận nấm men độc ChươngIII MỘT SỐ GIỐNG NẤM MEN SINH ĐỘC TỐ Hêï Ustilago maydis độc: Kiểu hình độc nấm Ustilago maydis (gây bệnh than bắp) đoạn gen dsRNA virus tạo Những nấm men độc tiết ba loại độc tố khác gọi KP1, KP4, KP6, có hoạt tính độc hại (killer) tác động lên tế bào nhạy cảm loài loài có mối quan hệ gần gủi Mỗi nòi nấm men độc chứa từ đến đoạn dsRNA có kích thước từø 0.36 đến 6.2kb phân loại thành ba nhóm: H (nặng), M (trung bình), L (nhẹ) Trong P1 chứa sáu đoạn dsRNA (H1, H2, M1,M2, M3 L) P4 chứa bảy đoạn (H1 đến H4, M2 M3, L) P6 chứa (H1, H2, M2, M3 L) dsRNA bao bọc vỏ capsid dày 43nm có khối lượng khoảng 73-75kDa Những H dsRNA bao bộc lớp capside (vỏ protein) Trong độc tố P1 P4 protein mã hóa H2 (4.6kb) P6 mã hóa đoạn H1 (6.2kb), protein hoàn toàn mối quan hệ với Những đoạn H khác mã hóa polypeptid có khối lượng phân tử từ 100 đến 128kDa Những M dsRNA bao bọc lớp vỏ capside đoạn capside xoắn với mà xem mã hóa cho độc tố Dựa sở di truyền học thí nghiệm in vitro cho thấy đoạn M giống nấm men độc xuất để mã hóa độc tố M2 tron P6, M1 và/hoặc M2 P1, M2 P4 Những độc tố KP có đặc tính khác nhau, tế bào kháng độc tố nhạy cảm với độc tố Giống độc tố K S.cerevisea, Ustilago maydis dường tổng hợp thành preprotoxin, chuyển hóa liên tục nội bào để sản sinh đôi KP1 KP6, độc tố đơn phụ KP4 Trong số độc tố này, KP6 thể tính chất rõ ràng tinh lọc nhiều, cDNA bị vô hoạt Trang 10 Tiểu luận nấm men độc trình tự biểu hệ thống đối xứng bất đối xứng Độc tố KP6 gồm polypeptide α (78 a.a; 8,6 kDa ) (81 a.a; 9,1kDa ), kết dinh Kex2 enzym protease từ preprotoxin chứa 219 a.a (24,1 kDa) Trong độc tố α β không liên kết trực tiếp vớinhau, chúng tương tác cách độc lập monomer với tế bào nhạy cảm Trong thành phần α có khả khởi động tương tác thành phần β tham gia tương tác lên tế bào mà β tác động(những quan cảm ứng thành tế bào chưa nhận dạng) Những toxin bám vào thành tế bào ức chế hoạt động tế bào nhạy cảm (kiểu hoạt động nhà khoa học chưa tìm ra), thành phần β chứa ba vùng kỵ nước mà người ta tin chúng có chức cấu trúc quan trọng Trong 78 a.a thành phần α có cystein cần cầu nối nội phân tử disulfide để hoạt động, hoạt động dẫn tới hình thành dãi ion Giống KD6, độc tố KP1 gồm hai thành phần α β không liên kết trực tiếp với mà tác động độc lập Gần độc tố KP4 tinh xác định đặc tính, độc tố tổng hợp thành preprotoxin chứa 127a.a (13,6 kDa) sau phát triễn thành polypeptide đơn chứa 105 a.a (11,1kDa) với 10 cystein liên quan đến trình kiềm hãm liên kết disulfide mà xem đóng vài trò quan trọng hoạt tính độc tố Kiểu hoạt động chưa biết (vẫn ?) Trang 11 Tiểu luận nấm men độc Hình 1: quan hệ Ustilago maydis độc với tế bào nhạy cảm Hêï Kluyveromyces lactis độc: Hiện tượng sinh độc tố nấm men thụ động Kluyveromyces lactis Gunge et al tìm thấy ngăn chặn plastid từ loài nấm men khác nhau, phát mang tính ngầu nhiên tượng gắn liền với AND plasmid mạch thẳng Những giống nấm men độc chứa khoảng 50 đến 100 tế bào cặp plasmid mạch thẳng gắn liền gọi pGKL1 (k1) pGKL2 (k2) có kích thước tương ứng 8,874 13,447 bp Cả hai plasmid sếp trình tự Những giống K lactis tiết độc tố heterotrimeric, độc tố kìm hãm phát triển nhiều loại nấm men nhạy cảm củng số giống K lactis không độc hại Trang 12 Tiểu luận nấm men độc Hình 2: quan hệ Kluyveromyces lactic killer với tế bào nhạy cảm Hệ Pichia and Williopsis độc: Những giống nấm men độc tìm thấy giống nấm tạo bào tử Pichia Hansenula, nòi có nhiều hoạt tính chống lại S cerevisias nấm men khác, chống lại C albican lưỡng tính Hệ pichia and williopsis độc không giống với độc tố K1 S cercisiae -hướng vào liên kết beta-1,6-D-glucan, vài độc tố can thiệp vào trình tổng hợp beta-1,3-Dglucan, polyme polysaccharide thành tế bào gốp phần việc xác định morphology tế bào di trì thẩm thấu Trang 13 Tiểu luận nấm men độc Hình 3: quan hệ tế bào Willopsis mrakii killer tế bào nhạy cảm Đặc tính occidentalis: protein độc Schwanniomyces Nấm men Schwanniomyces occidentalis tạo độc tố gây hại giống S cerevisiea nhạy cảm Ngưởi ta cho độc tố protein, hoạt tính độc hại bị sau xử lý pepsin papain Khi tinh chế protein độc hại người ta phát cấu tạo từ hai cấu trúc siêu phân tử với khối lượng phân tử tương ứng sấp só 7.4 va ø4.9 kDa, phát chúng acid Schiff Hoạt tính độc hại cực đại chúng pH 4.2 – 4.8 ổn định pH 2.0 – 5.0 hoạt tính nhiệt độ 40oC Protein độc hại giải mã dạng NST Mannan( beta-glucan Laminarin) ngăn chặn tế bào nấm men nhạy cảm không bị protein độc hại giết chết, người ta cho mannan kiềm hãm độc tính protein Việc xác định hình dạng tinh chất giống Schwanniomyces occidentalis giúp ta tránh nguy lây nhiễm nấm men không mông muốn suốt trình lên men Schwanniomyces occidentalis tạo enzym amylotic, gồm α – amylase gluccoamylase Nó Trang 14 Tiểu luận nấm men độc nhiều nấm men thủy phân tinh bột cách hoàn toàn Hơn phát triễn khối lượng lớn tế bào cách xử dụng tinh bột rẽ tiền từ thân thảo( ngủ cốc, khaoi tây, sắn mì )và lúa mì nguồn cacbon S occidentalis dùng sản xuất ethanol protein đơn bào từ trình lên men tinh bột Trứơc kiểu hình độc hại S occidentalis không mô tả, mực tiêu nghiên cứu sau: - Để ngăn chặn giống nấm men độc hại S occidentalis khỏi kiểu hình độc hại - Để tinh lọc mô tả phần độc tố này, bao gồm nhứng ảnh hưởng pH nhiệt độ lên ổn định hoạt tính - Để xác định liệu protein độc hại có quan hệ với protein độc hại nấm men khác trật tự N-terminal amino acid hay không - Để xác định vị trí gen protein độc hại - Để xác định nhứng vị trí kết khối độc tố thành tế bào náâm men nhạy cảm Từ nghiên cứu chúng xác định mối quan hệ giống S occidentalis giống nấm men độc khác xác định liệu toxin độc hại nấm nem sử dụng lên men công nghiệp không Phương pháp xác định mức độ gây độc nấm men độc: Người ta xác định hoạt tính độc nấm men thí nghiệm “well test” Mẫu thí nghiệm cấy giống nhạy cảm với mật độ 6*10 tế bào/1ml môi trường thí nghiệm Những vùng ức chế đánh giá sau 48 ủ 24oC Mối quan hệ ngang khảo sát phạm vi đường kính vùng sáng (đo đơn vị mm trục x ) pha logarit tế bào độc hại (tính đơn vị ng – nanogram trục y ) Số lượng protein độc mẫu khảo sát tính theo phương trình y = 0.3x 0.36 ; R2 = 0.999 Chúng ta định nghóa arbitrary unit (aU ) tổng số protein độc hại tạo khu vực sáng 1mm mẫu Vậy aU tương ứng với 0.9ng protein độc Do hoạt tính độc đanh giá từ thí nghiệm sinh học cách chuyển đường kính vùng sáng sang aU Trang 15 Tiểu luận nấm men độc Đối với thí nghiệm tương tác chéo S occidentalis xác định mẫu thí nghiệm cấy với giống nấm men độc khác Thuộc tính protein độc tinh sạch: Protein độc có hoạt tính pH acid (hình ), với pH tối ưu từ 4,2 – 4,8 Nhưng protein độc ổn định khoảng pH rộng từ – thời gian Khi trì pH 5.0 24oC protein độc hoạt tính, hoạt tính hoàn toàn pH 6.0 ( hình ) Protein ổn định 20mM citrate photphate(pH 4.4, nhiệt độ 20oC 30oC, giờ) View larger version (17K): Hình nh hưởng pH lên hoạt tính độc ( ) lên tính ổ định ( ) protein độc tinh từ S occidentalis Sự thay đổi giá trị pH điều chỉnh với dung dịch đệm citrate photphate 0.1 M 100% hoạt tính độc 500 aU, điều kiện chứa 0.4 µg protein độc Để xác định pH tối ưu, dung dịch protein độc điều chỉnh đến giá trị pH khác nhau, hoạt tính độc mẫu sau xác định với mẫu thí nghiệm có giá trị pH xác định Sau ủ với giá trị pH khác 24oC h, giá trị pH mẫu điều chỉnh đến giá trị pH cuối 4.4, ta xác định hoạt tính độc sót lại FIG nh hưởng nhiệt độ lên ổn định protein độc tiết từ S occidentalis 100% hoạt tính độc 500 aU, điều kiện chứa 0.4 µg protein độc , 20oC; , 30oC; , 40oC; , 50oC View larger version (17K): Trang 16 Tiểu luận nấm men độc Quá trình tinh lọc protein độc: phương pháp sắc ký Đầu tiên dùng cột QAE – sephadex A – 25 (5.5 by 11cm; Pharmacia Biotech, Uppsale, Sweden) để tập trung protein độc cho chúng không kết khối làm cân với dd đệm citrate photphat 20mM (pH 4.4 ) Eluate tập trung đưa vào cột butyl – Toyopearl 650M (2.5 by 27cm; Tosoh Corporation, Tokyo, Janan) với dd đệm citrate photphat 20mM (pH 4.4 ) chứa 0.7M ammonium sulfate Cột rửầu tiên 200 ml dd đệm citrate photphat (pH 4.4 ) chứa 0.7M ammonium sulfate, sau 1lit dd đệm citrate photphat 20mM (pH 4.4 ) Protein độc lắng với 1.2lít dd đệm citrate photphat 20mM (pH 4.4 ) chứa 10% ethylene glycol ( Nacalai Tesque,Inc, Kyoto, Japan) sau đưa vào cột FractogelEMDCOO - 650 (s)(1 by 2cm, E Merck, Darmstadt, Germany) thành phần chứa hoạt tính độc tập trung lại cột tách lấy dd đệm citrate photphat 20mM (pH 4.4) Những thành phần chứa protein hòa với dd đệm citrate photphat 20mM (pH 4.4) chứa 0.3 M NaCl ta thu hỗn hợp protein gồm protein độc tinh chế, insulin, Cytochrome C, ovalbumin xanh dextran Để tách lấy protein độc tinh chất ta dùng cột Fractogel TSK HW 50 (F) (1.5 by 95cm, E Merck) Trang 17 Tiểu luận nấm men độc ChươngIV ỨNG DỤNG NẤM MEN ĐỘC TRONG SẢN XUẤT CÔNG NGHIỆP Nấm men độc ứng dụng rộng rãi sản xuất công nghiệp đặc biệt công nghệ lên men ( công nghệ lên men rượu, bia, nước ép, nước đường,…), ứng dụng y học (lợi dụng khả nang sinh độc tố chúng mà ta sản xuất toxin làm thuốc kháng sinh, số loại thuốc chữa trị bệnh nấm da đặc hiệu) I Nấm men độc nhà máy sản xuất rượu vang: Trong công nghiệp cồn, bia, rượu, loại nước uống có cồn người ta thường sử dụng loại nâm men sau: Saccharomyces, Shizosaccharomyces, Kluyveromyces: Đối với công nghệ rượu vang: nho ép thành nước ép nho (must) Đây hỗn hợp chứa 85 – 95% dịch nho, – 12% vỏ nho – 4% hạt nho Cần xử lý chất sinh SO2 ( natri metabisunphit, natri bisunphit ), để ức chế phát triễn sau vi khuẩn, nấm sợi, nấm men dại Loại nấm men thường sử dụng sản xuất rượu vang loại có khả chống chịu với nồng độ đường cao, độ CO cao, tạo nhiều etanol, kháng SO2 tạo hương vị đặc trưng Nên người ta thường sử dụng loài S.cerevisiae chúng có khả tích lũy tới 18 – 20% etanol dịch ép nho Ngoài ứng dụng trên, nấm men độc tiết độc tố tiêu diệt VSV lạ (có hại trình sản xuất), để trình sản xuất thuận lợi kéo dài thời gian bảo quản Sự xuất nấm men độc: Nấm men độc phân lập từ nguồn sản xuất rượu nho khác gồm có trái nho, dịch nho, lên men nho rượu Những khảo sát thực Pháp vào năm 1981 phát có mặt nấm Trang 18 Tiểu luận nấm men độc men đôc rượu nho địa phương thay đổi từ – 90% tùy theo vùng Vùng phát cao Miditerrenean (65-90%) vườn nho Beaujolais (83%) vùng khác phát thấp (0-16%) Rosini công bố có mặt nhóm K2 (12-83%) giống chủ đạo (17-87%) S.cerevisiae rượu Segrantino loại rượu Ý Ciolfi phân lập nhóm sinh độc tố Candida S cerevisiae từ lên men rượu Barbera, Grignolino, Nebbiolo, Chardonnay, Malvasia Freisa Ở Đức, Benda phân lập 209 giống nấm men độc Saccharomyces từ 30 loại rượu lên men vùng Frankonia Shimizu phân lập giống sinh độc tố S cerevisiae từ rượu lên men tự nhiên giống Candida từ dịch nho Tất S cerevisiae thể đặc trưng nhóm K2 Nhà khoa học Ribeiro báo cáo có mặt nhóm K2 nấm men S cerevisiae (21%) lên men Ngược lại, điều tra thực Kitano phát S cerevisiae phân lập từ nhiều nguồn K1 tính chất sinh độc tố lạ thường Ở Yamanashi, Nhật bản, kết tương tự tìm thấy vườn nho Hầu hết nấm nem độc phân lập từ vườn nho thuộc S cerevisiae hay Hanennula Hơn nữa, 31 giống phân lập từ chủng S cerevisiae, có giống thể tính trạng K2 giống lại thể đặc điểm giống K1 Đặc trưng nấm men độc nguồn sinh học tự nhiên quan sát Southern Hemisphere Heard Fleed kiểm tra 16 loại rượu lên men nhà máy rượu vang khác Australia để theo dõi nấm men độc Hoạt tính độc phát mẫu S cerevisiae, không phân lập Kloeckera, Candida, Hansenula Torulaspora Ở Nam Mỹ, 230 giống sinh độc tố phân lập thuộc loại rượu sản xuất từ giống nho Chenin từ vỏ nho Trong loại rượu Braxin, nấm men độc phân lập cho thấy cao (>27%) Tính chất sinh độc tố rượu S cerevisiae: Đặc tính độc phát nhiều giống S cerevisiae Những giống giống có sẵn thương mại hoá, thường xuyên sử dụng để bắt đầu lên men rượu Tại Nga Naumov Naumova (1975) báo cáo có mặt 17 giống sinh độc tố 19 giống có tính nhạy cảm Trong điều tra khoảng 1000 giống S.cerevisiae làm rượu Pháp, có khoảng 60% có tính sinh Trang 19 Tiểu luận nấm men độc độc tố, 30% mẫn cảm 10% trung lập Khi cấy 454 giống S cerevisiae Ý, Nga, có 9% có tính sinh độc tố, 90% mẫn cảm 1% trung lập Ở Đức, Ý Nam Phi kết tương tự giống sinh độc tố thấp (