CHƯƠNG I: ĐIỀU KIỆN CHUNG CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN I) Môi trường lên men: 1)Nguồn gluxit: Gluxit nguồn cung cấp lượng mà nguồn cung cấp vật liệu xây dựng cần thiết để sinh tổng hợp cấu tử cần thiết tế bào Trong điều kiện sản xuất công nghiệp, người ta thường sử dụng nguồn nguyên liệu ban đầu rẻ tiền nguồn chứa gluxit mà chứa yếu tố phát triển khác Khi sử dụng vật liệu có tinh bột cellulose phải cho thủy phân thành đường hay nói cách khác phải đường hóa 2)Photphat vô cơ: P có vai trò quan trọng trình chuyển hoá lượng hệ thống sinh học Photphat thường đưa vào dạng kali photphat amon photphat Nồng độ thường 0,1-0,5% Ngoài photphat vô , người ta đưa vào dạng hợp chất hữu từ bột đậu, bột bắp, bã rượu 3)Nitơ : Nó hợp phần đặc biệt protein, axit nucleic phần lớn hợp chất phức tạp Nhiều vi sinh vật đồng hóa nitơ dạng ion amoni, số dạng nitrat , đa số hợp chất nitơ có nguồn gốc sinh học Nguồn nitơ bổ sung cho trình lên men từ cao ngô, lượng nitơ chiếm 4% thể tích nấm men trích ly 4) Các kim loại vi lượng : Các nguyên tố vi lượng thường gặp: Mn, Zn ,Cu ,Co, Ni, Mo Chúng có hiệu với nồng độ nhỏ cần thiết cho đời sống vi sinh vật Các nguyên tố thường cung cấp từ nước chiết nguyên liệu tự nhiên nước chiết Malt, nước chiết thịt, pepton… 5)Vitamin: Thông thường chất sinh trưởng hay yếu tố sinh trưởng có liên quan với có mặt vitamin nhóm B B1, B2, , pantotenic, PP,B6 , biotin Ta cần ý vitamin nhóm B chất sinh trưởng khác dễ vô hoạt nhiệt độ pH giới hạn.Đồng thời khó xác định cách xác nhu cầu chất dinh dưỡng cho trường hợp cụ thể 6) Nhiệt độ: Nhiệt độ làm ảnh hưởng đến vi sinh vật trình trao đổi chất chúng Cần khoảng nhiệt độ để trình trao đổi chất vi sinh vật xảy với cường độ mong muốn hẹp thường không 20 0C Ngoài ra, ảnh hưởng đến: Vận tốc tạo thành giải phóng sản phẩm cuối Trạng thái vật lý hệ thống hợp thể tạo nên hạt hệ sợi Đảm bảo lọc nhanh chất lỏng tách chất lỏng khỏi sinh khối phương pháp 7) pH: Các vi sinh vật có vận tốc sinh trưởng khoảng pH giới hạn vô hoạt hoàn toàn bị chết pH giới hạn Các vi sinh vật khác thường tồn pH khác thường khoảng pH= 4- 8) Tác nhân lên men vi sinh vật: Vi sinh vật tác nhân chủ yếu gây nên lên men Trong tế bào vi sinh vật có hệ enzyme phức tạp thí nghiệm nghiên cứu thấy loài khác lượng enzyme tổng hợp Do vậy, việc tuyển chọn chủng có hệ enzyme đặc trưng cho sản phẩm đòi hỏi phải khảo nghiệm để chọn thích hợp CHƯƠNG II: SINH TỔNG HP ALDEHYT ACETIC, DIACETYL, ACETOIN TỪ QUÁ TRÌNH LÊN MEN I)Tác nhân tham gia vào trình: Cơ chất trình lên men đường, tinh bột xellulose Nguyên liệu sẵn đường: mật rỉ đường mía hay củ cải Nguyên liệu chứa tinh bột: bắp, khoai mì, khoai lang, bột gạo Nguyên liệu chứa cellulose: gỗ vụn, mạt cưa, rơm rạ Rỉ đường nguyên liệu rẻ tiền, chứa hàm lượng đường cao – gần 50% chất khô, phần đáng kể Nitơ, vitamin, muối vi lượng Tuy nhiên thường có chất keo vi sinh vật tạp gây bất lợi cho trình lên men không xử lý trước Bột khoai mỳ thường sử dụng Tận dụng nguồn cellulo thải từ rơm rạ, giấy, vỏ quả, mùn cưa, xác mía xúc tiến sử dụng, từ Avgerinos cộng đưa phương pháp sản xuất năm 1980 Nếu từ tinh bột, xellulose phải trải qua khâu đường hóa Quá trình đường hóa thường có nấm mốc vi khuẩn tham gia theo chế tổng quát sau: Tinh bột Đường amylase nấm mốc, vi khuẩn nguồn nitơ bổ sung từ cao ngô, lượng nitơ chiếm 4% thể tích Hoặc nấm men trích ly Tác nhân giống Sacchazomyces, số vi khuẩn nấm mốc tham gia vào trình Để ứng dụng quy mô công nghiệp, người ta sử dụng chủng khác giống Sacchazomyces Thường dùng cho sản xuất cồn nấm men Sacchazomyces cerevisiae, kỵ khí không bắt buộc, lên men hô hấp; dùng cho sản xuất bia Sacchazomyces carbergensis dùng sản xuất rượu vang Sacchazomyces ellipsoideus nấm men chìm Nấm men nổi: lên men nhiệt độ tương đối cao( 20280C), lên men mạnh tạo nhiều CO 2, thoát nhiều CO2 làm nấm men bề mặt lửng lơ môi trường Nấm men chìm: lên men nhiệt độ thấp (5-10 0C), chúng lên men chậm chạp lắng xuống đáy thùng lên men Tế bào nấm men có đặc điểm khả tạo nội enzyme, nghóa enzyme tiến hành xúc tác bên tế bào Như vậy, trình chuyển hóa đường tế bào nấm men, chất trung gian tạo thành khỏi tế bào tích tụ môi trường II) Cơ chế trình lên men: Glucose chu trình EMP (5) Axit pyruvic CO2 CO2 (1) CH 3CO-lipoat -Acetolactat (3) NAD (2) NAD.H2 CO2 CO2 Acetoin +O2 Diacetyl Aldehyt acetic (4) NAD.H2 NAD -Các enzym xúc tác -Acetolactatsintertase -Acetolactatdecacboxylase Diacetylsintertase Diacetylreductase pyruvat decacboxylase -Glucose: C6H12O6 - Axit pyruvic : CH3COCOOH O - -Acetolactat : CH3C CH3 O C C OH OH - Diacetyl : CH3 C C O - A cetoin : CH3 C CH3 O CH CH3 O OH -Trong trình lên men, sản phẩm phụ : aldehyt acetic, diacetyl acetoin tạo thành Cloctridium phân giải glucose theo đường EMP dể cuối chu trình tạo axit pyruvic Đầu tiên xúc tác glucokinase, glucose kết hợp với gốc photphat phân tử ATP tế bào nấm men để tạo thaønh glucose –6 photphat vaø ADP C6H12O6 + ATP glucosekinase C H2O(H2PO3)(CHOH)4CHO + ADP glucose –6 photphat Tiếp glucose-6 photphat tác dụng enzyme đồng phân glucose photphat isomerase biến thành fructose-6photphat: glucose photphat isomerase CH2O(H2PO3)(CHOH)4CHO CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2OH fructose-6-photphat Giai đoạn ba tác dụng enzyme photphofructosekinase, phân tử ATP thứ hai đính thêm gốc photphat vào fructose 6-photphat để tạo thành fructose-1, 6- diphotphat phân tử ADP thứ hai : photphofructosekinase CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2OH + ATP +ADP CH 2O(H2PO3)CO(CHOH)3CH2O(H2PO3) Sự tạo thành fructose-1, 6-diphotphat đánh dấu kết thúc giai đoạn chuẩn bị lên men Giai đoạn chuyển hóa nối liên kết cao thành dạng dễ biến đổi tác dụng enzyme Giai đoạn quan trọng phân cắt mạch cacbon fructosediphotphat thành hai phân tử trioza: aldehyt photphoglyceric photphodioxyaceton Phản ứng xúc tác aldolase: aldolase C H2O(H2PO3) CO(CHOH)3 CH2 O (H2PO3) CH2O(H2PO3) COCH2OH + CH2O(H2PO3) CHOHCHO Vai trò chủ yếu biến đổi trình lên men aldehyt, photphoglyceric, dịch lên men chúng chứa Điều giải thích tượng đồng phân tác dụng enzyme triphotphat isomerase: triphotphat isomerase C H2O(H2PO3) COCH2OH C H2O(H2PO3)CHOHCHO Như trình lên men aldehytriphotphoglyceric tạo thành từ photphoxyaceton Giai đoạn hai phân tử aldehyt photphoglyceric bị oxy hóa Phản ứng có tham gia axit phophoric canh trường nhờ xúc tác enzym triphotphatdehyrogenase- coenzym NAD (Nicotinamit-Adenin-Dinucleotit) triphotphatdehyrogenase CH2O(H2PO3)CHOHCHO + 2H3PO4 +2 NAD H2PO3 CH 2O(H2PO3)CHOHCOO+2NAD H2 Phân tử 3-photphoglycero aldehyt kết hợp với photphat, H chuyển sang coenzyme NAD Năng lượng giải phóng oxy hóa 3-photphoglycero aldehyt tích tụ liên kết cao axit 1,3-diphotphoglyceric tạo thành Tiếp theo với tham gia phophoglyceratkinase, gốc photphat chứa cao axit 1,3-diphotphoglyceric chuyển vào ADP Kết 3-photphoglyceric tạo thành , ADP nhận thêm lượng biến thành ATP: phophoglyceratkinase 2C H2O(H2PO3)CHOHCOO-H2PO3 2CH2O(H2PO3)CHOHCOOH + 2ADP + 2ATP Dưới tác dụng enzym photphoglyceromutase, gốc axit photphoric chuyển từ vị trí cacbon thứ ba sang cacbon thứ hai Kết 3-photphoglyceric biến thành axit 2photphoglyceric theo phản ứng : photphoglyceromutase 2C H2O(H2PO3)CHOHCOOH 2C H2OHCHO(H2PO3)COOH Dưới tác dụng enolase, axit 2-photphoglyceric nước, tạo thành axit photphopyruvic: 2C H2 OHCHO(H2PO3) COOH enolase 2C H2CO (H2PO3) COOH + 2H2O Axit photphopyrovic không bền nên dễ bị gốc axit photphoric enzym pyruvatkinase axit pyruvic tạo thành : pyruvatkinase 2C H2=CO-(H2PO3) COOH +2ADP CH3COCOOH +2ATP Axit pyruvic bò decacboxyl để tạo thành aldehyt acetic: CH3COCOOH pyruvat decacboxylase 2CO + CH3CHO Bên cạnh đó, axit pyruvic bị chuyển hoá thành acetolactat Dưới tác dụng enzym acetolactatsintetase, enzym xúc tác cho ngưng tụ phân tử pyruvat loại CO2 để taïo -acetolactat -acetolactatsintetase CH3 COCOOH + CH3 CHO –lipoat + lipoatTPP) CH3 CH COCOH-COOH -acetolactat -acetolactat tạo thành bị decacboxyl tách CO tác dụng enzym -acetolactat decacboxylase để tạo thành acetoin CH3 + CH3COCOH-COOH CO2 CH COCHOH-CH3 Ngoài ra, -acetolactat bị oxy hoá decacboxyl hoá tạo thành diacetyl CH3 -acetolactat-dehydrogenase CH3COCOH-COOH H2 + CO2 CH COCO-CH3 + Diacetyl Diacetyl bị phân hủy dể tạo thành acetoin Phản ứng xảy chậm acetoindehyrogenase CH3 COCO-CH3 + CH3 H2 CH COCHOHAcetoin Axit pyruvic bị decacboxyl để tạo thành aldehyt acetic: CH3COCOOH pyruvat decacboxylase 2CO + CH3CHO Sản phẩm tạo thành tùy thuộc điều kiện môi trường Môi trường acid, pH – 5, aldehyt acetic (thời kỳ tónh) Glyceraldehyt – 3P nhận H2 tạo sản phẩm glycerin Khi nồng độ aldehyt acetic đạt đến giới hạn chuyển thành rượu etanol Môi trường kiềm hóa nhờ Na2CO3, K2CO3, (NH4)2CO3 5% hạn chế lượng cồn tạo thành H chuyển cho dihydroxyacetophosphat tạo thành nhiều glyceerin acid acetic (từ 1t rỉ cho 80kg glycerin, 40kg cồn 20kg aldehyt) Thêm Bisulfit Natri NaHSO3 vào môi trường chúng kết hợp với aldehyt acetic tạo thành tủa khó tan nước trung tính, phản ứng chuyển theo hướng tạo thành glycerin Aldehyt acetic nhận kết tủa hòa tan môi trường acid hay kiềm loãng + HCl CH3–CH–SO3Na OH CO2 + H2O CH3CHO + NaCl + SO2 + H2O + NaOH +Na2CO3 CH3CHO + Na2SO3 + H2O CH3CHO + 2Na2SO3 + III) Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp chất aldehyt ceton: 1)nh hưởng nhiệt độ: -Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ thích hợp cho nấm men sinh trưởng : 25-300C, ngừng hoạt động 400C ( nấm men bia) -Nhiệt độ dung dịch đường lên men: nhiệt độ trước đưa vào lên men thích hợp 8-100C -Lên men nhiệt độ thấp khả lên men cao Lên men nhiệt độ 6-100C thồi kỳ sản sinh nhiều chất diacetyl, aldehyt Nhiều dẫn liệu cho thấy hình thành diacetyl chủ yếu giai đoạn lên men (đối với lên men bia) Khi nhiệt độ 1-20C (thời kỳ tàng trữ bia) hàm lượng diacetyl, aldehyt giảm diacetyl bị phân hủy thành acetoin lúc acetoin tăng -Tùy theo chủng nấm men mà có nhiệt độ lên men phát triển tốt Ví dụ: lên men bia- người ta chia nấm men bia thành loại: lên men thuộc chủng Saccharomyces cerevisiae – loại phát triển lên men bia nhiệt độ 12-13 0C trở lên Còn nấm men chìm thuộc loại Saccharomyces carlsbergensis, phát triển tốt nhiệt độ thấp (6-70C) 2) nh hưởng pH: -acetolactat chất để tạo acetoin diacetyl.Mà enzym -acetolactatsintetase chuyển hoá pyruvat thành acetolactat tạo thành pH= Do vậy, phải điều chỉnh pH dịch lên mentiến pH=6 3)nh hưởng nồng độ dịch lên men: - Nồng độ dịch đường cao dẫn đến làm tăng áp suất làm cân trạng thái sinh lý nấm men Kết ức chế làm nấm men chết Thường người ta khống chế nồng độ chất khô dịch đường16-18%, tương đương 13-15% đường 4)nh hưởng sục khí: -Giai đoạn đầu cần nấm men thích nghi sinh trưởng phát triển tốt cần sục khí để nấm men sử dụng oxy, oxy hóa chất tạo lượng, cung cấp cho sinh sản phát triển tốt -Giai đoạn lên men nên tạo môi trường yếm khí để trình lên men tốt sản sinh nhiều sản phẩm , phụ 5)nh hưởng yếu tố khác: -Nồng độ CO2 0,2% nấm men nảy chồi chậm, còn1,5%CO làm ngừng lên men Nồng độ cồn > 1,5% sinh sản chậm, với 0,5% H2SO4 1% axit acetic nấm men chết IV)Điều khiển trình sinh tổng hợp aldehyt ceton: Mục đích ta phải sinh tổng hợp aldehyt ceton nhiều tốt Dựa vào chế, ta phải điều khiển sinh tổng hợp nhiều -Để tạo nhiều acetoin cần phải bổ sung enzym acetolactatdecacboxylase để chuyển -acetolactat thành acetoin, để diacetyl phân hủy tự nhiên, đồng thời, phải điểu chỉnh pH 10 dịch lên men =6 để tạo enzym -acetolactatsintetase để tạo nhiều -acetolactat Có tạo nhiều acetoin diacetyl -Hàm lượng axit amin dịch lên men cao cho hàm lượng diacetyl cao Do ta cần phải bổ sung axit amin vào trình lên men -Nên lên men kín nhiệt độ 6-10 0C tạo nhiều aldehyt ceton Vì thời kỳ lên men sản sinh nhiều chất diacetyl -Ngoài ra, ta sục khí để oxy hoá acetoin tạo nhiều diacetyl 11 CHƯƠNG III: SINH TỔNG HP ACETON TỪ QUÁ TRÌNH LÊN MEN I)Tác nhân tham gia trình : Aceton sản phẩm trình lên men hydrat cacbon thực nhóm vi khuẩn hô hấp kỵ khí có bào tử thuộc giống Clostridium Giống Clostridium bao gồm vi khuẩn gam dương có khả di động nhờ tiêu mao mọc khắp thể Tác nhân cung cấp phức hệ enzym vi khuẩn Clostridium acetobutilicum Nguyên liệu để sản xuất aceton bằnh phương pháp lên men tinh bột (các nguyên liệu tinh bột), không cần phải đường hóa trước vi khuẩn có hệ amylase hoạt động Yêu cầu nguyên liệu có gluxit, nitơ,và øphotpho Do bột ngũ cốc nguyên liệu hoàn hảo có chứa thành phần cần thiết cho lên men Rỉ đøng dịch thủy phân gỗ, rơm,bẹ gỗ,… nguyên liệu không đầy đủ , bắt buộc phải trộn với bột ngũ cốc II) Cơ chế trình sinh tổng hợp aceton: -Cơ chế trình lên men: Các chất tham gia vào trình: -Glucose : C6 H12 O6 - Axit pyruvic : - Acetyl-ScoA : - Axit acetic : - Acetoacetyl- CoA : - Acetoacetat - Aceton CH3COCOOH CH3CO- SCoA CH3COOH CH3CO-CH2CO- SCoA : CH3CO-CH2COOH : CH3CO CH3 12 Glucose Chu trình EMP Axit pyruvic (1) H2 CO2 TPP CoA.-SH Axit acetic Acetyl-SCoA Acetyl-SCoA (2) CoA-SH Acetoacetyl- CoA CoA-SH H2O CoA-SH (3) Acetoacetat CO2 Butanol (4) Aceton -Các enzym xúc tác: 1) Pyruvat-deny-drogenase 2) Acetyl-ScoA tiolase 3) Acetoacetat dehyrat hoaù 4) Acetoacetatdecacboxylase -Các phản ứng: C6 H12 O6 - 2ATP+2NAD 2CH3COCOOH +4ATP+2NAD.H2 Axit pyruvic CH3COCOOH + TPP(CoA-SH) CH3CO-SCoA Acetyl-ScoA CH3CO-SCoA + CH3CO-SCoA CoA-SH CH 3COCH2CO- SCoA + Acetoacetyl- CoA CH3COCH2CO-SCoA + H 2O CH3COCH2COOH + CoA-SH Acetoacetat CH3COCH2COOH CH3COCH3 Aceton III)Caùc yếu tố ảnh hưởng: 13 + CO2 - Nhiệt độ lên men thích hợp cho vi khuẩn aceton 36- 37 0C -Nồng độ dịch hồ để lên men không cao: 8-10% tính theo chất khô 4-6% tính theo tinh bột Vì lẽ, lượng aceton tạo tỷ lệ với nồng độ gluxit giới hạn nồng độ 5,5-6% Nồng độ gluxit cao dư thừa không lên men Khi nồng độ aceton đạt đến xấp xỉ 1,5% trình lên men bị ngừng Thực môi trường không khí Thời gian lên men đầu phài tạo pH= 4,5 CO tạo nhiều làm giảm sản phẩm lên men - - Vi khuẩn kỵ khí nghiêm ngặt , đòi hỏi oxy hoá khử 250mV thấp , cho sinh trưởng tạo thành dung môi - Nếu dùng chất lên men rỉ đường chứa 4-6% đường phải bổ sung Nitơ photphat Cả nguồn Nitơ(cao ngô, rượu) nitơ vô cơ(NH3 muối nó) sử dụng - Chất điều chỉnh pH pha sinh axit nồng độ sử dụng 1-1,4% - Thiếu Fe gây ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ butanol: aceton thu hồi - Khi mà dùng chủng Cl Acetobutylicum cần phải bổ sung nhân tố sinh trưởng cần thiết biotin p-amiobenzoat IV) Điều khiển trình sinh tổng hợp aceton: - Để tăng hiệu suất lên men tạo aceton ta phải khống chế thấp tỷ lệ gluxit: protein = 5,5: thuận lợi cho việc tạo aceton , ức chế trình tạo rượu etilic -Bổ sung Nitơ cần phải phối hợp nguồn nitơ vô (NH4SO4-4-6% trọng lượng đường) theo thực nghiệm thấy bổ sung nguồn nitơ không cho sản lượng dung môi aceton cao -Trong trình lên men, phải bổ sung Fe vi khuẩn sản sinh mức độ giới hạn phản ứng bị tiêu giảm nồng độ Fe bị hạn chế tế bào -Để thu nhiều aceton việc tuyển chọn chủng vi khuẩn quan trọng Ở đây, ta nên chọn chủng Cl Acetobutylicum.Vì thực nghiệm cho thấy dùng chủng thu hồi butanol :aceton = 2:1 Hơn chủng chịu nồng độ dung môi cao -Môi trường lên men phải thật yếm khí thích hợp cho vi khuẩn phát triển tốt lên men tốt Sản phẩm lên men thu cao điều kiện thật kỵ khí 14 15 - -Sơ đồ kỹ thuật sản xuất aceton sau: Tinh bột Vi khuẩn Cl Acetobutylicu m Nước Dịch hồ Hơi Nấu trùng Nước Nhân giống dịch cháo Làm nguội CO2 + H2 Lên men Dấm chín Chưng cất Bã Nước Hơi Aceton 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1)TS- Nguyễn Thị Xuyến Vi sinh vật chế biến sản phẩm Thủy Sản.- Trường Đại Học Thủy Sản.- 1996 2)PGS-TS-Nguyễn Đình Thưởng ; TS- Nguyễn Thanh Hằng Công nghệ sản xuất kiểm tra cồn etylic.- NXB KH KT Hà Nội-2000 3)Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thắng,… Hoá sinh công nghiệp-NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội-2000 4)Kesen Ma and Michael An Unsual Oxygen-Sensitive, Iron-Andzinc- Containing Alcohol Dehydrogenase from the Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furious - -Department of Biochemistry and Molecular Biology and centre for Metalloenzyme Studies, University of Georgia, Athens, Georgia 30602( accepted 30 November 1998) 5)Transcription profile of brewery yeast under fernentation conditions.-revised 28 october 2002 and accepted 12 November 2002 6) Nguyễn Đức Lượng – Nguyễn Hữu Phúc Công nghệ vi sinh vật Trường ĐH Bách khoa TP Hồ Chí Minh 1996 7) Trần thị Thanh Nội-2000 8) Alan Wiseman 9) Ben Rotter Công nghệ vi sinh NXB Giáo dục Hà Handbokk of Enzyme biotechnology Malolactic fermentation 10) The Chemical Educator, Vol 5, No 3, S1430-4171(00)03378-X, 10.1007/s00897000378a, © 2000 Springer-Verlag New York, Inc Yet Modern Biotechnology 17 Beer: An Ancient