Khảo sát một số yếu tố liên quan đến chất lượng tế bào gốc tạo máu phân lập

Tai lieu, luan van1 of 102 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Bích KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƢỢNG TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU PHÂN LẬP TỪ MÁU DÂY RỐN TẠI NGÂN HÀNG TẾ BÀO GỐC, BỆNH VIỆN ĐA KHOA TÂM ANH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2021 khoa luan, tieu luan1 of 102 Tai lieu, luan van2 of 102 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Bích KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƢỢNG TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU PHÂN LẬP TỪ MÁU DÂY RỐN TẠI NGÂN HÀNG TẾ BÀO GỐC, BỆNH VIỆN ĐA KHOA TÂM ANH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: Hƣớng dẫn 1: TS Thẩm Thị Thu Nga Hƣớng dẫn 2: TS Nguyễn Trung Nam Hà Nội - 2021 khoa luan, tieu luan2 of 102 Tai lieu, luan van3 of 102 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu thân dƣới hƣớng dẫn khoa học TS Thẩm Thị Thu Nga TS Nguyễn Trung Nam Các số liệu kết thu đƣợc luận văn hoàn toàn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tồn trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tôi xin chịu trách nhiệm liên quan đến nội dung đề tài Hà Nội, tháng 04 năm 2021 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Bích khoa luan, tieu luan3 of 102 Tai lieu, luan van4 of 102 LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Thẩm Thị Thu Nga – giáo viên hƣớng dẫn Cảm ơn cô cho hội, hƣớng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện giúp hồn thành luận văn Nhờ có hỗ trợ tơi có đƣợc điều kiện tốt để học tập nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Thị Thanh Mai, ngƣời giải đáp cho nhiều kiến thức chuyên mơn q trình làm luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Trung Nam, phó viện trƣởng Viện Công nghệ sinh học, Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam hƣớng dẫn, hỗ trợ q trình hồn thiện luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất đồng nghiệp Trung tâm Tế bào gốc, Bệnh viện đa khoa Tâm Anh, Hà Nội hỗ trợ nhiều công việc suốt năm học tập nghiên cứu Xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Học viện Khoa học Công nghệ tạo điều kiện học tập giảng dạy tốt cho học viên để hồn thành khóa học thành công hiệu Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Bệnh viện đa khoa Tâm Anh Hà Nội tạo điều kiện, hỗ trợ thời gian, kinh phí để tơi hồn thành nghiên cứu Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình bạn bè chỗ dựa tinh thần cho tơi gặp phải khó khăn, áp lực thời gian năm học tập nghiên cứu vừa qua Hà Nội, ngày 11 tháng 04 năm 2021 Nguyễn Thị Bích khoa luan, tieu luan4 of 102 Tai lieu, luan van5 of 102 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú giải AABB American Association of Blood Banks (Hiệp hội truyền máu Hoa Kỳ) AGM Aorto-Gonado-Mesonephros CD Cluster of Differentiation (Cụm biệt hóa) CFU Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) CMV Cytomegalo virus DMSO Dimethyl sulfoxide EDQM European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare (Cục Quản lý Chất lƣợng Thuốc & Chăm sóc sức khỏe Châu Âu) FDA Food and Drug Administration (Cục quản lý thuốc dƣợc phẩm Hoa Kỳ GVHD Graft versus host disease (Bệnh ghép chống chủ) HLA Human leukocyte antigen (Kháng nguyên bạch cầu ngƣời) HPC Hematopoietic progenitor cell (Tế bào tiền thân tạo máu) HSC Hematopoietic Stem Cell (Tế bào gốc tạo máu) HSCT Hematopoietic Stem Cell Transplantation (Cấy ghép tế bào gốc tạo máu) khoa luan, tieu luan5 of 102 Tai lieu, luan van6 of 102 iPSC Induced Pluripotent Stem Cells (Tế bào gốc đa cảm ứng) IT-HSC Intermediate-term Hematopoietic Stem Cell (Tế bào gốc tạo máu trung hạn) LT-HSC Long-term Hematopoietic Stem Cell (Tế bào gốc tạo máu dài hạn) MEP Megakaryocyte/erythrocyte progenitors (Tế bào tiền thân Megakaryocyte/erythrocyte) MPP Multipotent progenitors (Tế bào tiền thân đa năng) NK Natural Killer cell (Tế bào giết tự nhiên) ST-HSC Short-term Hematopoietic Stem Cell (Tế bào gốc tạo máu ngắn hạn) TNC Total Nucleated Cell (Tế bào đơn nhân) WBMT Worldwide Network for Blood & Marrow Transplantation (Hiệp hội ghép tủy toàn cầu) khoa luan, tieu luan6 of 102 Tai lieu, luan van7 of 102 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TẾ BÀO GỐC 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Phân loại 1.2 TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Sự hình thành phát triển tế bào gốc tạo máu 1.2.3 Q trình biệt hóa tế bào gốc tạo máu 1.2.4 Nguồn phân lập tế bào gốc tạo máu 10 1.3 TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU TỪ MÁU DÂY RỐN 11 1.2.1 Cấu tạo dây rốn 11 1.2.2 Đặc điểm tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn 12 1.2.3 So sánh HSC từ máu dây rốn với tủy xƣơng máu ngoại vi 13 1.2.4 Ƣu điểm máu dây rốn cấy ghép 15 1.2.5 Nhƣợc điểm máu dây rốn cấy ghép 15 1.2.6 Ứng dụng tế bào gốc máu dây rốn 15 1.2.7 Ngân hàng tế bào gốc máu dây rốn 17 1.2.8 Nghiên cứu giới yếu tố liên quan đến chất lƣợng máu dây rốn 20 1.2.9 Tình hình nghiên cứu tế bào gốc tạo máu Việt Nam 22 CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 24 2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 24 khoa luan, tieu luan7 of 102 Tai lieu, luan van8 of 102 2.2.2 Hóa chất 24 2.2.3 Thiết bị 24 2.2.4 Vật tƣ tiêu hao 25 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 27 2.3.2 Nội dung nghiên cứu 28 2.3.3 Kỹ thuật thu thập máu dây rốn 29 2.3.4 Kỹ thuật xử lý máu dây rốn 31 2.3.5 Kỹ thuật đánh giá chất lƣợng máu dây rốn sau xử lý 33 2.3.6 Phân tích thống kê 37 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39 3.1.1 Kết thu thập mẫu 39 3.1.2 Đặc điểm thống kê đơn vị máu dây rốn đạt tiêu chuẩn 40 a) Đặc điểm sản phụ 40 b) Đặc điểm trẻ sơ sinh 42 c) Đặc điểm số chất lượng máu dây rốn 44 3.1.3 Các yếu tố liên quan đến số chất lƣợng tế bào gốc tạo máu 48 a) Các yếu tố sản phụ trẻ sơ sinh với thể tích máu dây rốn 48 b) Các yếu tố sản phụ trẻ sơ sinh với số lượng TNC 50 c) Các yếu tố sản phụ trẻ sơ sinh với số lượng tế bào CD34+ 52 d) Các yếu tố sản phụ trẻ sơ sinh với tỷ lệ tế bào CD34+ 53 3.1.4 Tƣơng quan yếu tố sản phụ số đánh giá chất lƣợng đơn vị máu dây rốn 54 khoa luan, tieu luan8 of 102 Tai lieu, luan van9 of 102 3.1.5 Tƣơng quan yếu tố trẻ sơ sinh số đánh giá chất lƣợng đơn vị máu dây rốn 55 3.1.6 Tƣơng quan số yếu tố khác 56 3.1.7 rốn Ảnh hƣởng số yếu tố đến chất lƣợng đơn vị máu dây 57 a) Ảnh hưởng thể tích máu dây rốn đến số lượng TNC 57 b) Ảnh hưởng thể tích máu đến số lượng tế bào CD34+ 59 c) Ảnh hưởng thời gian bảo quản mẫu đến tỷ lệ tế bào sống 60 3.1.8 Mơ hình ƣớc lƣợng số lƣợng TNC 61 3.2 THẢO LUẬN 64 3.2.1 Các yếu tố sản phụ 64 3.2.2 Các yếu tố trẻ sơ sinh 67 3.2.3 Thời gian bảo quản mẫu trƣớc xử lý 70 3.2.4 Các số chất lƣợng tế bào gốc máu dây rốn 71 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 4.1 KẾT LUẬN 75 4.2 KIẾN NGHỊ 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 khoa luan, tieu luan9 of 102 Tai lieu, luan van10 of 102 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Sự khác biệt tế bào gốc tạo máu có nguồn gốc khác 14 Bảng 1.2 Tổng hợp yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng máu dây rốn 20 Bảng 2.1 Danh mục hóa chất 24 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị 24 Bảng 2.3 Danh mục dụng cụ, vật tƣ tiêu hao 25 Bảng 2.4 Tóm tắt thơng tin nhuộm mẫu với kháng thể 36 Bảng 3.1 Thống kê đơn vị máu dây rốn đƣợc tiến hành thu thập 39 Bảng 3.2 Đặc điểm độ tuổi sản phụ 40 Bảng 3.3 Đặc điểm sản khoa 41 Bảng 3.4 Đặc điểm thống kê tuổi thai cân nặng trẻ sơ sinh 42 Bảng 3.5 Đặc điểm thống kê số chất lƣợng máu dây rốn đạt tiêu chuẩn sau xử lý 44 Bảng 3.6 Một số yếu tố liên quan với thể tích máu thu thập 48 Bảng 3.7 Một số yếu tố liên quan đến số lƣợng TNC 50 Bảng 3.8 Một số yếu tố liên quan với số lƣợng tế bào CD34+ 52 Bảng 3.9 Một số yếu tố liên quan với tỷ lệ tế bào CD34+ 53 Bảng 3.10 Tƣơng quan số yếu tố sản phụ số đánh giá chất lƣợng đơn vị máu dây rốn 54 Bảng 3.11 Tƣơng quan số yếu tố sơ sinh số đánh giá chất lƣợng đơn vị máu dây rốn 55 Bảng 3.12 Tƣơng quan số yếu tố khác số đánh giá chất lƣợng đơn vị máu dây rốn 56 Bảng 3.13 Ảnh hƣởng thể tích máu dây rốn lên số lƣợng TNC 57 Bảng 14 So sánh số TNC với ngƣỡng thể tích 80mL 58 khoa luan, tieu luan10 of 102 Tai lieu, luan van84 of 102 72 giúp cho việc lựa chọn đối tƣợng thu thập máu dây rốn cách hiệu quả, đặc biệt phục vụ cho ngân hàng máu dây rốn công  Số lượng TNC tế bào CD34+ Để ƣớc tính đơn vị tế bào gốc đƣợc sử dụng cho bệnh nhân ghép điều trị hay không, ngƣời ta sử dụng khái niệm liều tế bào gốc hay số lƣợng tế bào gốc kilogram cân nặng bệnh nhân Liều tế bào gốc tối ƣu đơn vị máu dây rốn chƣa đƣợc xác định rõ ràng, thơng thƣờng thể tích cao liên quan đến chất lƣợng tế bào cao Các nghiên cứu trƣớc cho thấy có mối tƣơng quan chặt chẽ phục hồi tế bào gốc tạo máu thải ghép với số lƣợng TNC cân nặng bệnh nhân đƣợc ghép [105] Điều khiến ngân hàng tế bào gốc máu dây rốn ƣu tiên cung cấp đơn vị tế bào gốc máu dây rốn cho trẻ em ngƣời lớn có trọng lƣợng thể thấp Số lƣợng tế bào tối thiểu cần thiết cho đơn vị cấy ghép chƣa thống Nó phụ thuộc vào yếu tố nhƣ khả tƣơng thích HLA loại bệnh đƣợc điều trị Liều tế bào gốc đƣợc đề xuất tối thiểu ứng dụng cho bệnh nhân 2.5x107 TNC/kg 1.5x105 CD34+/kg để cấy ghép thành công [115, 116] Một số nghiên cứu chất lƣợng đơn vị tế bào gốc dây rốn ảnh hƣởng yếu tố sản khoa sơ sinh [59, 96] Vì vậy, nghiên cứu chúng tơi nhằm mục đích điều tra yếu tố liên quan đến việc thu thập máu dây rốn để thu đƣợc đơn vị máu dây rốn có chất lƣợng tốt tăng khả ghép thành công Trong nghiên cứu chúng tơi, TNC trung bình đạt 2.72x108 tế bào, số lƣợng CD34+ trung bình đạt 2.31x106 tế bào Theo FDA khuyến cáo, tiêu chí cấp cho đơn vị máu dây rốn ngân hàng máu dây rốn công phải đạt 5x108 TNC/đơn vị 1.25x106 CD34+/đơn vị, cịn ngân hàng tƣ nhân khơng có tiêu chuẩn cụ thể Trong nghiên cứu chúng tôi, tỷ lệ đơn vị máu dây rốn có số lƣợng TNC ≥ 5x108 7.21%, tỷ lệ đơn vị có số lƣợng CD34+ ≥ 1.25x106 66.37% Nguyên nhân nghiên cứu chúng tôi, máu dây rốn đƣợc xử lý theo phƣơng pháp ly tâm phân lớp theo tỷ trọng sử dụng Ficoll Kết thu đƣợc, loại bỏ hồng cầu huyết tƣơng, lớp buffy coat thu đƣợc loại gần hết bạch cầu hạt có khoa luan, tieu luan84 of 102 Tai lieu, luan van85 of 102 73 máu dây rốn, TNC sau xử lý chủ yếu thành phần tế bào đơn nhân (Mononuclear cells - MNC) bao gồm tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, tế bào miễn dịch, tế bào gốc tạo máu số loại tế bào đơn nhân khác Chính số lƣợng TNC thấp đáng kể so với tiêu chuẩn giới đƣa TNC từ lâu đƣợc sử dụng để xác định việc chấp thuận hay loại trừ đơn vị đƣợc lƣu trữ cấy ghép ngân hàng máu dây rốn giới Tuy nhiên, TNC thông thƣờng chứa nồng độ khác tế bào hồng cầu, bạch cầu hạt trƣởng thành, tiểu cầu tế bào làm loãng khác Mà nay, việc ghép tế bào gốc tạo máu chƣa có quán quan điểm cần quần thể thể bào vai trò cụ thể chúng Một số nghiên cứu công bố cho thấy TNC tạo phản ứng tế bào gốc thấp so với MNC, TNC từ đơn vị máu dây rốn khác cho hiệu ghép thay đổi khác đáng kể so với MNC [117] Sự khác biệt chủng tộc có ảnh hƣởng lớn đến số lƣợng TNC Nhiều nghiên cứu giới cho thấy số lƣợng TNC ngƣời da trắng cao đáng kể ngƣời da vàng da màu [118] Điều dẫn đến tiêu chí TNC tổ chức Hoa Kỳ hay Châu Âu cao cho nƣớc Châu Á, cụ thể Việt Nam Số lƣợng TNC có tƣơng quan thuận với cân nặng trẻ sơ sinh thể tích máu dây rốn, tƣơng quan nghịch với số lƣợng thai thời gian bảo quản mẫu Số lƣợng CD34+ khơng nhận thấy có tƣơng quan với yếu tố sản khoa sơ sinh, mà có tƣơng quan thuận với thể tích máu dây rốn thu thập (r= 0.458, p