KHẢO sát TÍNH tự bất hợp và CHỌN GIỐNG KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI ở cây KHOAI tây BẰNG CHỈ THỊ PHẨN tử DNA

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - - -  - - - - BÀI THI GIỮA KỲ HỌC PHẦN SH03051 – CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CHỌN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG ĐỀ TÀI: “KHẢO SÁT TÍNH TỰ BẤT HỢP VÀ CHỌN GIỐNG KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI Ở CÂY KHOAI TÂY BẰNG CHỈ THỊ PHẨN TỬ DNA” Họ tên MSV Lớp Khoa : VŨ HƯƠNG GIANG : 637217 : K63 - CNSHC : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội, 06/2021 MỤC LỤC Giới thiệu chung khoai tây 1.1 Giới thiệu chung 1.2 Đặc điểm .4 1.3 Lịch sử 1.4 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh khoai tây 1.5 Giá trị dinh dưỡng 1.6 Di truyền học 1.7 Tình hình sản xuất khoai tây giới 1.8 Tình hình sản xuất khoai tây nước Sự tự bất hơp SI khoai tây 2.1 Sự tự bất hợp SI 2.2 Phát đa dạng alen S-RNase loài khoai tây lưỡng bội 2.2.1 Giới thiệu chung 2.2.2 Nguyên liệu phương pháp .9 2.2.3 Kết .12 Phát bệnh mốc sương mai khoai tây 17 3.1 Bệnh mốc sương mai 17 3.2 Lịch sử phát 18 3.3 Phạm vi phân bố 18 3.4 Triệu chứng 18 3.5 Phát bệnh mốc sương mai khoai tây thị phân tử DNA .19 3.5.1 Vật liệu phương pháp nghiên cứu .19 3.5.2 Phương pháp PCR phát gen kháng bệnh sương mai R1 R3a 20 3.5.3 Phân lập mẫu bệnh sương mai khoai tây 20 3.5.4 Đánh giá bệnh lây nhiễm nhân tạo 21 3.5.5 Kết PCR phát gen kháng bệnh sương mai R1 R3a 21 Tài liệu tham khảo 24 4.1 Tài liệu tham khảo tiếng Anh .24 4.2 Tài liệu tham khảo tiếng Việt .24 Giới thiệu chung khoai tây 1.1 Giới thiệu chung Khoai tây lồi nơng nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh bột, loài trồng lấy củ rộng rãi giới loại trồng phổ biến thứ tư mặt sản lượng tươi xếp sau lúa, lúa mì ngơ Lưu trữ khoai tây dài ngày đòi hỏi bảo quản điều kiện lạnh Hình Khoai tây  Phân loại khoa học Bảng Phân loại khoa học Giới Plantae Angiospermae Eudicots Asterids Bộ Solanales Họ solanaceae Phân họ Solanoideae Tông Solaneae Chi Solanum Loài S.tuberrosum Theo Hawkerkks (1991), khoai tây phân thành 18 nhóm, có 68 lồi hoang dại, có lồi trồng trọt, chia thành nhóm chủ yếu dựa vào số lượng nhiễm sắc thể  Nhóm 1: Diploids: 2n=2x=24 S.x arjanhuiri juz.et Buk S gomiocalyx juz.et Buck S stenotomum juz.et Buk S phueja juz.et Buk Trong loài trên, loài S phueja juz.et Buk có ý nghĩa lớn trồng trọt  Nhóm 2: Triploids: 2n=3x=36 S.x chaucha jux.et Buk dạng lai tự nhiên S.tuberosum subp.Andigena S.stenotomum S.xjuzepczukii Buk dạng lai tự nhiên S.acuale S.snenotomum, phân bố trung Peru đến Nam Bolivia, có khả kháng bệnh sương mai  Nhóm 3: Tetraploisd: 2n=4x=48 Lồi S.tuberosum L loài phụ là: Phân loài tuberosum Phân lồi Andigena (juz.et Buk) Hawkes  Nhóm 4: Pentaploids: 2n=5x=60 Loài S.x curtilobum juz.et Buk 1.2 Đặc điểm Cây khoai tây lưu niên thân thảo có chiều cao khoảng 60cm, chết sau hoa Hoa khoai tây có màu trắng, hồng, đỏ, xanh màu tím, nhụy hoa màu vàng Khoai tây thụ phấn chủ yếu trùng, ong vị vẽ mang phấn hoa từ đến khác, nhiên xảy tượng tự thụ phấn.Sau khoai tây hoa, số giống cho màu xanh giống màu xanh cà chua anh đào, chứa 300 hạt Quả khoai tây chứa lượng lớn alkaloid, solanine nên không dùng để ăn Rễ khoai tây trồng từ củ giống phát triển rễ chùm, có rễ cọc trồng hạt, từ rễ cọc phát triển nhiều rễ phụ khác Ở thân ngầm mặt đất có khả rễ, rễ ngắn phân nhánh Bộ rễ phân bố chủ yếu đất canh tác 0-40cm, rễ ăn sâu tới 1,5-2m Thân khoai tây mọc thẳng, đơi có cấu tạo zick zac, có 3-4 cạnh, cao trung bình từ 40-70cm đến 1-1,2m Phụ thuộc vào giống, thời kỳ chăm sóc mà chiều cao khác Thân thường có màu xanh xanh nhạt hay đậm, đối có màu phớt hồng tìm tùy thuộc vào giống Là hình thành hoàn thiện theo tăng trưởng cây, to, kép xẻ lơng chim, có 3-7 đơi mọc đối xứng qua trục lẻ thường lớn gọi chét đỉnh, màu sắc phụ thuộc vào giống, thời vụ, điều kiện chăm sóc mà màu xanh, xanh đậm xanh nhạt Hoa khoai tây thường mọc tập trung chùm hoa Nó thuộc loại hoa lưỡng tính có cấu tạo 5:5:5, cuống ngắn Màu sắc hoa thường trắng, phớt hồng, tím, hồng, vàng đỏ phụ thuộc vào loại giống Quả khoai tây thuộc loại mọng, có dạng hình cầu, hình trứng hình nón Vỏ có màu xanh đơi có xọc vằn đóm, có hai ngăn chứa hạt thịt Hạt khoai tây thuộc loại nhỏ, trọng lượng 1000 hạt đạt khoảng 0,7-1g Hạt có dạng ovan dẹt, bên ngồi vỏ, bên có nội nhũ phơi Phơi khoai tây có hình chữ U, bên hai mầm phôi rễ mầm Củ khoai tây cịn có tên gọi thân củ hay thân ngầm củ hình thành thân phát triển điều kiện bóng tối Hình dạng củ khoai tây trịn, elip, trịn dài, đơi hình vng Màu sắc củ tùy thuộc vào giống, màu trắng, màu trắng nhạt, vàng hay vàng nhạt Mầm khoai tây phát triển từ điểm sinh trưởng mắt củ quan sinh sản vơ tính khoai tây Màu sắc mầm khác phụ thuộc vào giống màu trắng màu tím, gặp ánh sáng mầm có màu xanh 1.3 Lịch sử Khoai tây có nguồn gốc từ Peru, nghiên cứu David Spooner xuất năm 2005 khoai tây có nguồn gốc từ khu vực phía nam Peru Hiện tại, người ta cho khoai tây du nhập vào châu Âu vào khoảng thập niên 1570 sau người biển châu Âu đưa đến lãnh thổ cảng khắp giới chế độ thực dân châu Âu mở rộng vào kỷ XVII XVIII Có hàng ngàn bậc phân lồi khoai tây tìm thấy Andes, nơi người ta tìm thấy trăm thứ khoai tây thung lũng, hộ nơng dân tích trữ tới mười loại khoai tây khác Năm 1845, loại bệnh nấm Phytophthora infestans lan nhanh chóng khắp khu vực tây Ireland, dẫn đến nạn đói lớn Ireland      1.4 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh khoai tây Nhiệt độ Nhiệt độ vụ trồng khoai tây yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả phân bố, thời vụ gieo trồng, trình sinh trưởng, phát triển nắng suất Tổng nhu cầu nhiệt cho khoai tây sinh trưởng phát triển dao động từ 16oC-18oC Nhiệt độ vụ trồng bình quân dao động 16 oC-18oC thích hợp cho suất cao Các thời kỳ sinh trưởng phát triển khác yêu cầu điều kiện nhiệt độ khác - Hạt nảy mầm nhiệt độ tối thiểu 12 oC-15oC nhiệt độ thích hợp 18oC-22oC Nhiệt độ lớn 25oC làm mầm phát triển chậm dễ thối - Thời kỳ sinh trưởng thân nhiệt độ thích hợp 20oC-22oC - Thời kỳ phát triển củ yêu cầu thời gian chiếu sáng ngắn để thúc đẩy hình thành thân củ Ánh sáng Khoai tây ưa sáng, cường độ ánh sáng thích hợp cho khoai tây sinh trưởng cho suất cao từ 40.000-60.000 lux Thời kỳ non đến giai đoạn hình thành củ khoai tây địi hỏi ánh sáng ngày dài để quang hợp tích lũy chất dinh dưỡng, đồng thời hoa, đậu Thời kỳ sinh trưởng sinh thực củ bắt đầu hình thành, khoai tây cần có thời gian chiếu sáng ngắn Độ ẩm Khoai tây có rễ ăn nơng, thâm canh để nâng cao suất cần phải cung cấp nước thường xuyên cho để sinh trưởng phát triển tốt Các thời kỳ sinh trưởng khác yêu cầu nước khác Thời kỳ trồng đến xuất tia củ cần đảm bảo độ ẩm tối thiểu 60-80% Thời kỳ phát triển củ cần giữ độ ẩm 80% Thiếu nước thừa nước ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển Đất trồng pH đất Đất trồng khoai tây thích hợp đất phù sa nhẹ, đất cát pha, đất nhẹ tơi xốp có lượng mùn cao, lớp đất canh tác dày, giữ ẩm tốt, tưới tiêu tốt Khoai tây phát triển đất có pH từ 4,8-7,1; pH lý tưởng khoai tây 5,2-6,4 Nếu pH khoai tây dễ bị nhiễm bệnh ghẻ củ 1.5 Giá trị dinh dưỡng Khoai tây vừa lương thực, vừa thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, hàm lượng dinh dưỡng khoai tây trứng Sử dụng 100g khoai tây đảm bảo 8% nhu cầu protein, 3% lượng, 10% sắt, 10% vitamin B1, 20-50% nhu cầu vitamin C cho người ngày đêm Khi xem xét trồng nhiệt đới cận nhiệt đới, khoai tây sinh lợi trồng khác đem lại lượng protein cao Trong khoai tây có nhiều chất chống oxy hóa, có khả ngăn ngừa lão hóa, hạn chế phát triển ung thư số bệnh khác Đã phát tác dụng giảm ung thứ tuyến tiền liệt hấp thụ khoai tây thường xuyên Nước ép củ khoai tây có tác dụng trung hịa độ axit cao dày, kích thích tiêu hóa, chữa viêm tuyến dịch vị 1.6 Di truyền học Đặc tính sinh sản  Giao tử 2n Sự đa dạng khoai tây liên quan đến địa lý phân bố biến đổi loài Khoai tây trồng phổ biến gồm thể lưỡng bội (2n=24), thể tứ bội (2n=48), thể ngũ bội (2n=60) Giao tử 2n nhiễm sắc thể xôma (somatic chromosome number), thường bị nhầm lẫn với giao tử không giảm phân Giao tử khơng giảm phân giao tử khơng có tái tổ hợp di truyền trình hình thành giao tử, khơng có q trình giảm phân Giao tử 2n sử dụng để tạo thể lưỡng bội nhân giống nhiều đơn vị phân loại thực vật bậc cao, góp phần tạo đa bội hóa có khả di truyền từ đơn bội sang đa bội  Đơn bội Đơn bội từ thể tứ bội thể lưỡng bội xảy tự nhiên Các đơn bội từ tứ bội thường không hoa, bất dục đực giao phối cận huyết trog q trình đơn bội hóa Chọn lọc thể đơn bội, dòng nhân lưỡng bội thu có biến dị di truyền lưỡng bội hoang dã, lai F1 cá thể đơn bội lồi hoang dã sử dụng làm cấu nối chuyển tính trạng có lợi từ thể lưỡng bội sang thể tứ bội Ngoài ra, kiểu đơn bội sử dụng để nghiên cứu phân li tính trạng mức độ tứ bội tạo nhiều kiểu gen đơn bội từ kiểu gen thể tứ bội  Sự tự bất hợp Sự tự bất hợp xảy loài Solanum mang củ, đặc biệt mức lưỡng bội S-locus điều khiển tự bất hợp SI ( Self- Incompatibility) gồm hai gen liên kết chặt: S-RNase (S-locus-RNase) multiple SLFs (S-locus F-box protein) Trong locus S với nhiều alen kiểm soát gametophytic self-incompatibility Cấu trúc gen locus S bao gồm alen S2 với exon intron có tổng kích thước 786bp Vị trí locus S xác định nằm nhiễm sắc thể I  Bộ gen Bản đồ gen khoai tây báo cáo vào năm 1988 sử dụng thị RELP đánh dấu Bảng Các loại thị đồ gen 1.7 Tình hình sản xuất khoai tây giới Sản xuất khoai tây giới trải qua thay đổi lớn Tính đền đầu năm 1990, hầu hết khoai tây trồng tiêu thụ châu Âu, Bắc MỸ, nước thuộc Liên Xơ cũ Kể từ đó, có gia tăng đáng kể sản xuất nhu cầu châu Á, châu Phi, Mỹ Latinh, sản lượng khoai tây tăng từ 30 triệu vào đầu năm 1960 165 triệu vào năm 2007 Hình Bản đồ phân bố địa lý trơng khoai tây tồn giới (Nguồn: RTB Maps) Châu Á châu Âu hai khu vực sản xuất khoai tây lớn, chiếm 80% sản lượng giới năm 2007 Trong châu Phi châu Mỹ Latinh diện tích trồng chiếm khoảng 20% toàn giới Bắc Mỹ nơi sản xuất khoai tây đứng đầu giới với 40 tấn/ha Châu Á chiếm gần nửa nguồn tiêu thụ khoai tây giới, dân số lớn nên sức tiêu thụ bình quân đầu người mức khiêm tốn 24kg vào năm 2005 1.8 Tình hình sản xuất khoai tây nước Sản xuất khoai tây Việt Nam đạt đỉnh điểm vào năm 1979 1980 sau giảm dần Một nguyên nhân chủ yếu dẫn đến suất thấp diện tích trồng giảm dần thiếu nguồn củ giống tốt Hình Diễn biến diện tích, sản lượng khoai tây Việt Nam giai đoạn 2009-2013 (Nguồn: FAOSTAT.2014) Diện tích trồng sản lượng khoai tây tăng dần qua năm từ năm 2009 tới năm 2012 không đáng kể tới năm 2013 diện tích trồng khoai tâu giảm tới 42% suất lại tăng gần 20% so với năm 2012 Diện tích trồng giảm suất khơng giảm theo, tín hiệu đáng mừng cho ngành sản xuất khoai tây nước ta Tuy nhiên, sản xuất khoai tây cịn gặp nhiều khó khăn trình sản xuất chọn tạo giống Giống khoai tây thường bị thối hóa điều kiện ngoại cảnh đặc biệt thối hóa virus Sự tự bất hơp SI khoai tây 2.1 Sự tự bất hợp SI Sự tự bất hợp hay Self-incompatibility (SI) tên gọi chung cho số chế di truyền thực vật hạt kín, ngăn cản q trình tự thụ tinh khuyến khích lai xa dị hợp Khơng nên nhầm lẫn với chế vật lý kiểm soát di truyền ngăn cản trình tự thụ phấn heterostyly, sequantial hermaphroditism (dichnogamy) Đối với thực vật tự bất hợp, xảy hạt phấn hay khác có kiểu gen hay alen Các chế nghiên cứu tự bất hợp SI ức chế nảy mầm hạt phấn vòi nhụy, ảnh hưởng đến kéo dài ống phấn Locus S chứa hai vùng mã hóa protein bản- vùng biểu nhụy hoa vùng bao phấn ( gọi yếu tố định đực cái) Trong gametophytic self-incompatibility (GSI), kiểu hình tự bất hợp hạt phấn định kiểu gen đơn bội giao tử Đây loại SI phổ biến Cơ chế RNase tìm thấy Solanaceae tìm thấy vào năm 1989 Trong chế này, ống phấn phát triển khơng bình thường, S-RNase gây thối hóa RNA ribosome bên ống phấn, ngăn chặn kéo dài ống phấn hạt phấn bị chết 2.2 Phát đa dạng alen S-RNase loài khoai tây lưỡng bội 2.2.1 Giới thiệu chung Phần lớn lồi thực vật có hoa lưỡng tính, quan sinh sản chúng nằm gần dẫn tới xảy trình tự thụ phấn Tuy nhiên tác động có hại q trình tự thụ tinh giao phối cận huyết, loài thực vật phát triển số chế, phổ biến tự bất hợp Sự tự bất hợp tượng ngăn cản tự thụ tinh giúp cho nhụy hoa phân biệt tự thụ phấn giao phấn, dẫn đến việc chọn lọc bắt giữ hạt phấn Tùy thuộc vào chế kiểm soát di truyền tương đồng phấn hoa, thực vật phân loại có chế phát sinh thể bào tử giao tử Sự tiến hóa chế ngăn chặn giao phối cận huyết thực vật có hoa nguyên nhân quan trọng dẫn đến thành cơng q trình tiến hóa chúng, khiến chúng trở thành nhóm thực vật cạn thành cơng Tính bất hợp giao tử hay Gametophytic system (GSI) tìm thấy 60 họ thực vật có hoa Họ Solananceae, Rosaceae, Plantaginaceae, Leguminoceae, Onagraceae, Papaveraceae, Poaceae Các nghiên cứu GSI cấp độ phân tử cho thấy GSI hoạt động theo hai chế khác để có khả nhận loại bỏ hạt phấn tránh tượng tự thụ phấn Một số chế Stylar ribonuclease (S-Nase) xác định đặc trưng cho thành viên họ Solanaceae, họ Rosaceae, họ Plantaginaceae họ Rubiaceae Hầu hết, tự bất hợp giao tử loài Solanum lưỡng bội mang củ kiểm soát S-Locus đa alen 2.2.2 Nguyên liệu phương pháp  Nguyên liệu thực vật Nghiên cứu bao gồm nhóm Phueja, nhóm Stenotomum, nhóm Solanum okadae Các trồng điều kiện nhà kính có kiểm sốt quang chu kỳ thời gian 16 giờ, độ dài ngày tự nhiên mùa hè với ánh sáng bổ sung cần thiết Bảng Nguyên liệu thực vật  Thụ phấn Tự thụ phấn có kiểm sốt tự thụ phấn chéo thực để xác nhận tự bất hợp khoai tây Bao phấn khoai tây ống rỗng có lỗ nhỏ đỉnh Để thu phấn hoa từ bao phấn hình ống này, người ta sử dụng rung để rung hình nón bao phấn phấn hoa thu vào ống ly tâm siêu nhỏ Sau đó, phấn hoa đưa vào đầu nhụy bàng chổi sơn sau nhụy trưởng thành Các phép lai kiểm tra sau khoảng tuần: tự bất hợp khơng có phơi (no berry or no seed set) tính tương hợp mọng (berry or seed set) hình thành  Tách chiết DNA DNA gen chiết tách để định kiểu gen PCR cụ thể cho alen từ lai S.okadae thu phân ly mang alen S khác Hai đĩa có trọng lượng khoảng 10-100mg non xử lý để tách chiết DNA kit DNeasy Plant Mini  Tiến hành phản ứng PCR cụ thể cho alen Các đoạn mồi định thiết kế phép khuếch đại alen cụ thể từ lai phân ly với sở S-Rnase biết Các loại mồi sử dụng sau: +) So1-RNase (So1-F(5’ GGATAAGGAGGGATCACAGC 3’) So1-R (5’ TGTTGGCTTTGTATTTTGTAGCA 3’) +) So2-RNase ( So2-F(5’ TGCGAGTCCGAAGACAAGTA 3’) 10 So2-R(5’ AAGGGAAAGAAAACGGAAGC 3’) +) So4-RNase ( So4-F(5’ TCGATTGGAGTTCTGCACTG 3’) So4-R(5’ TTTCATCGCATGTGTTACCC 3’) +) So5-RNase (So5-F(5’TGGTCGAAAGGAACAACCTT 3’) So5-R(5’ TTCCAACCTGGTCATTCAAAG 3’) Các đoạn mồi thiết kế có nhiệt độ nóng chảy tối ưu 60oC Phản ứng PCR bao gồm đệm PCR 1X, 3mM MgCl2, 0,2mM dNTPs, 0,4mM mồi xuôi, muồi ngược, 2U Taq DNA polymerase Phản ứng PCR thực PTC-200 Thermal Cycler điều kiện chu kỳ sau: biến tính phút ban đầu 94oC, 35 chu kỳ 30 giây 94oC, trình ủ nhiệt độ tùy thuộc vào Tm (nhiệt độ nóng chảy) mồi, phút 72oC theo gian kéo dài cuối phút 72oC  Chiết xuất RNA RNA chiết từ mô nhụy hoa cách sử dụng RNase Plant Mini Khoảng 10100mg mô, làm lạnh nitơ lỏng, nghiền thành bột mịn xử lý để tách chiết RNA  Phản ứng phiên mã ngược (RT)-PCR: 3’RACE Phản ứng phiên mã ngược (RT) thực cách sử dụng mồi oligo-dT (5’-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAA (T)18-3’) với 27bp 18 nucleotide thymidine đầu 3’ Tổng hợp cDNA sợi thực cách sử dụng Omniscrip® Reverse Transcriptase Phản ứng bao gồm 1X RT Buffer, 0,5mM dNTPs, 1mM NotI d(T), 10U chất ức chế RNase, 4U Omniscript Reverse Transcrptase, 1-2mg RNA tổng số biến tính 65oC phút nước khơng có RNase Hỗn hợp phản ứng RT ủ 37oC để tổng hơp cDNA Một đoạn mồi thối hóa, So1C2-F1.3(5’TTTACNRTNCATGGNCTNTGGCC-3’) thiết kế dựa domain Solanaceae S-RNase Điều sử dụng để khuếch đại phần trình tự S-RNase từ RNA nhụy hoa cách sử dụng kỹ thuật 3’RACE dựa RT-PCR Mồi thối hóa (So1C2-F1.3) sử dụng với mồi khác (5’-AACTGGAAGAATTCGCGG-3’) có trình tự nhận biết mồi oligo-dT xử dụng trình tổng hợp cDNA sợi thứ Khuếch đại RT-PCR thực hỗn hợp phản ứng bao gồm 2,5ml phần phản ứng RT(trong phản ứng cDNA), 30mM Tris-HCl(pH8,3), 50mM KCl, 1,5mM MgCl2, 0,2mM dNTPs, 0,4mM So1C2-F1.3 (mồi xuôi), 0,2mM mồi ngược, 2U Taq DNA polymerase Quá trình khuếch đại mơ tả với nhiệt độ ủ 55oC thời gian kéo dài cuối phút  Phản ứng phiên mã ngược RT-PCR: 5’RACE Các đoạn mồi đặc hiệu cho gen thiết kế từ trình tự phần phân lập từ nhân 3’RACE cho S-RNase xác định sử dụng để nhân cDNA có chiều dài đầy đủ kỹ thuật 5’RACE-PCR Ba mồi đặc hiệu cho So2-RNase: +)So2-GSP1 (5’-ATTATACCATGATTTCGGAGAGC-3’) +)So2-GSP2 (5’-AGATCGATACTACACGTTCCATG-3’) +)So2-GSP3 (5’-CAGTGATACTCCAGTTGTTTGC-3’) Đối với Ss2-RNase: 11 +) Ss2-GSP1 (5’-AGAAGTAATACCATTCTTTCCGAG-3’) +) Ss2-GSP2 (5’-AACACGTTCCATGCTTAATG-3’) +) Ss2-GSP3 (5’-CCAGATGTATTCCAGAGCTTC-3’) Tổng hợp cDNA sợi kỹ thuật 5’RACE-PCR thực cách sử dụng Hệ thống 5’RACE để khuếch đại, phiên 2.0 (Invitrgen) theo khuyến nghị nhà sản xuất Sản phẩm PCR thu cách sử dụng mồi AAP AUAP mồi đặc hiệu  Nhân dịng vector pCR® 2.1 Các sản phẩm RACE-PCR nhân kit nhân dòng TA (Invitrogen) Nồng độ sản phẩm PCR cần thiết để liên kết với 50ng vector pCR®2.1 xác định, phản ứng thiết lập (với 1ml of 10xligation buffer, 2ml of 25ng pCR®2.1 vector, 1ml of 4.0 Weiss units T4 DNA ligase) Hỗn hợp ủ 14oC qua đêm, biến đổi thành tế bào One Shot competent cell (TOP10F’Invitrogen), sau đưa vào đĩa LB có chứa 40mg/ml X-Gal, 100mM IPTG 50mg/ml kanamycin 100mg/ml ampicillin  Giải trình tự đoạn chèn plasmid Các khuẩn lạc sàng lọc cách sử dụng mồi M13 universal primer, DNA plasmid chiết xuất từ dịng dương tính giả cách sử dụng QIAprep Spin Miniprep kit Trình tự DNA chèn vào xác định cặp mồi M13 universal primer 2.2.3 Kết  Xác định trạng thái tự bất hợp mối quan hệ mầm khoai tây Các kết từ dịng vơ tính S.okadae bảng cho thấy tất trình tự thụ phấn tự bất hợp Từ phép lai, người ta quan sát thấy số dịng OKA7129 có khả mang cặp alen S giống dựa giao phấn không tương đồng Các phép lai OKA1 OKA3 không tạo theo hai hướng cho thấy dịng vơ tính có chung cặp alen S Bảng Kết thụ phấn S.okadae thu  Nhân RT-PCR nhụy hoa S-RNase Khuếch đại RT-PCR nhụy hoa giả định S-RNase từ S.tuberosum Group Stenotomum, S.tuberosum Group Phureja S.okadae có kích thước dự kiến khoảng 850bp cho vật liệu 12 Hình Kết RT-PCR S.okadae cách sử dụng mồi S-RNase C2  Kết RT-PCR 3’RACE Bảng Kết phản ứng RT-PCR 3’RACE Từ kết xác định trình tự tóm tắt bảng 5, số alen xuất nhiều lần Ví dụ, So1-RNase tìm thấy có mặt bốn số kiểu gen S.okadae bao gồm OKA1, OKA3,OKA5,OKA9 So2-RNase tìm thấy OKA1, OKA3 Ss9 Sp1 có mặt Stenotomum STN 4679 Phueja clone DB226 (Ss9 ban đầu nhân từ Stenotomum, sau nhân từ Phureja đặt tên Sp1) Tuy nhiên so sánh trình tự thấy rằng, hai S-RNase mã hóa trình tự axit amin, tạm thời đổi tên thành Ss9/Sp1 đại diện cho hai alen, mặt lý thuyết chúng đại diện cho hai alen khác biệt mặt 13 chức Quan sát khơng nằm ngồi dự đốn Stenotomum Phureja có liên quan chặt chẽ mặt tiến hóa coi thành viên nhóm lồi Solanum teberosum Tổng số trình tự S-RNase xác định nghiên cứu 16, gồm trình tự từ S.okadae 11 trình tự từ S.tuberosum Sự liên kết trình tự axit amin phần Solanum S-RNase thể hình Ba số miền bảo tồn (conserved domain) (C3-C5), hai miền siêu biến (hypervariable domain) (HVa HVb) đánh dấu phần đặc điểm cấu trúc solanaceous S-RNase Một hai gốc histidine xúc tác biết có liên quan đến hoạt tính ribonuclease SRNase liên kết vùng C3 Sáu số tám gốc Cysteine tìm thấy solanaceous S-RNase Các gốc cysteine quan trọng để xác định cấu trúc bậc ba S-RNase Hai gốc cịn lại nằm ngồi vùng liên kết C1 C2 Tất S-RNase chứa sáu gốc cysteine, trừ cysteine nằm sau vùng C5 Hình Sự liên kết axit amin phần Solanum S-RNase Tỷ lệ phần trăm tương đồng axit amin 16 S-RNase nằm khoảng 32,9 đến 94,5% (Bảng 6) Mức độ tương đồng trình tự thấp phù 14 hợp hợp với mức đa hình cao biết tồn alen S-RNase họ Solanaceae Có thể quan sát thấy mức độ tương đồng axit amin loài thấp 32,9% S.okadae S-RNase, 33,1% Stenotomum S-RNase 44,2% cho Phureja S-RNase Bảng Tỷ lệ phần trăm tương đồng axit amin  Kết RT-PCR 5’RACE Ba đoạn mồi đặc hiệu cho gen antisense (GPS) thiết kế thông qua nhân 3’RACE sử dụng 5’ RACE để xác định trình tự gen SRNase Các sản phẩm RT-PCR amplicon dự kiến hai trường hợp cho So2-RNase hình Sau biến đổi, ba khuẩn lạc có đoạn chèn xác định PCR khuẩn lạc chọn để tách chiết DNA plasmid xác định trình tự đoạn chèn 15 Hình Kết điện di sản phẩm RT-PCR 5’RACE So2-RNase OKA1  Kết RT-PCR 5’RACE RT-PCR 5’RACE bổ sung C1 C2 vào vùng 5’ hai S-RNase Sự xếp trình tự axit amin hai S-RNase nhân dòng So2 từ S.okadae Ss2 từ Group Stenotomum với ba số trình tự S-RNase S.chacoense Hai vùng siêu biến (HVa HVb) vùng conserved domain (C1, C2, C3, C4, C5) tìm thấy solanaceus S-RNase Hai gốc histidine nằm vùng C2, C3 biết có liên quan đến hoạt động ribonuclease S-RNase Tám conserved cysteine tìm thấy S-RNase hịa tan Ngồi ra, vị trí N-glycosyl hóa tìm thấy C2 hầu hết solanaceus S-RNase Hình Trình tự axit amin sau RT-PCR 5’RACE  Phân tích lai với cặp mồi đặc trưng cho alen 16 Để kiểm tra chức alen S, người ta thực phép lai semicompatible cross Solanum okadae Các lai phép lai kiểu gen OKA1, OKA3, OKA5, OKA9 phân tích có mặt alen S-RNase Các đoạn mồi đặc hiệu thiết kế cho alen số bốn alen đại diện cho kiểu gen (So1, So2, So4, So5), sử dụng tình khuyếch đại PCR từ 28-30 hệ cho phép lai Trong trường hợp, kiểu gen riêng lẻ trồng phù hợp với phản ứng semi-compatible cross, hạt phấn chứa alen có điểm chung với bố mẹ không thụ phấn cho Tất chứa alen S “non common” từ bố mẹ cho phấn trạng thái dị hợp tử Ví dụ, phép lai bảng (OKA1 x OKA5), alen S5 bố mẹ hạt phấn di truyền tất hệ lai Ngược lại, alen S1 bố mẹ hạt phấn bị loại bỏ khơng hệ lai S1S1 S1S2 kiểu gen xác định Tất 116 kiểu gen hệ lai di truyền theo alen S-RNase Điều cung cấp chứng trình tự nhân tương đồng với functional S-allele cho thấy kiểm soát giao tử kiểu hình hạt phấn cho alen bị loại bỏ cách hiệu trình thụ phấn không xuất hợp tử hình thành Bảng Kết phép lai OKA1, OKA3, OKA5, OKA9 Phát bệnh mốc sương mai khoai tây 3.1 Bệnh mốc sương mai Phytophthora infestans loài vi sinh vật gây bệnh nghiêm trọng cho khoai tây, gọi bệnh mốc sương mai hay bệnh tàn rụi khoai tây 17 Hình Triệu chứng bệnh mốc sương mai khoai tây Bệnh mốc sương mai thủ phạm gây nạn đói châu Âu thập niên 1840, Ireland năm 1845 Phytophthora infestans gây ảnh hưởng cà chua số loài khác họ Solanaceae Bệnh thường xuất mép chóp tạo vết xám xanh nhạt sau lan rộng vào phiến Phần vết bệnh chuyển màu nâu đen xung quanh vết bệnh thường có lớp bao tử màu trắng xốp bao phủ lớp mốc trắng sương muối làm cho lụi tàn nhanh chóng Bệnh hại cuống lá, cành, thân khoai tây, lúc đầu vết nâu thâm đen, sau lan rộng bao quanh kéo dài thành đoạn Bệnh làm cho thân, cành khoai tây thối mềm dễ bị gãy gục 3.2 Lịch sử phát Bệnh mốc sương mai khoai tây lần ghi nhận Mêxico coi trung tâm đa dạng sinh học nấm mốc sương Triệu chứng bệnh mô tả chi tiết năm 1845 khoai tây Bệnh xác định nguyên nhân nấm Ban đầu Montagne đặt tên nấm Botrytis infestans (1845), tới năm 1854 đổi tên thành Peronospora infestans, năm 1876 nấm Montagne Anton de Bary đặt lại Phytophthora infestans tên gọi tới ngày Sự phát tán nấm chia làm hai giai đoạn kỷ 19 giai đoạn kỷ 20 Giai đoạn kỉ 19 lúc đầu khoai tây bắt đầu xuất phổ biến rộng rãi khắp nước Bắc Mỹ châu Âu Cùng với phổ biến khoai tây, nấm mốc sương phát tán vùng trồng Mỹ theo nguồn bệnh khoai tây dại sau từ Mỹ lan sang châu Âu theo đường củ giống Giai đoạn thứ hai vào kỷ 20 lúc tồn cầu hóa thương mại vận chuyển hàng hóa mốc sương mai theo củ khoai tây phát tán tất vùng có xuất khoai tây Bệnh hại nặng mùa dẫn tới nạn đói Ireland năm 18451846 Đức năm 1919 3.3 Phạm vi phân bố Bệnh phân bố hầu giới nơi có điều kiện lạnh đủ để trồng khoai tây Theo thống kê CABI 1982, nấm P.infestans xuất hầu hết châu lục Tại châu Á, bệnh xuất 26 nước có 18 nước lân cận láng giềng nước ta Trung Quốc, Lào, Thái Lan, Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ bao gồm Việt Nam Do tính chất phức tạp giai đoạn phát tán thứ hai nấm P.infestans không chủng cũ mang chủng nấm A1 phát tán mà chủng A2 phát toàn giới CABI năm 1996 đưa thống kê nước xuất chủng Theo kết chủng nấm A2 xuất 26 nước vùng lãnh thổ châu Á có nước Ấn Độ, Indonesia, Hàn Quốc, Nhật Bản, Israel Quần thể Hàn Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ xuất hai loại chủng nấm Theo cơng bố chủng nấm A2 xuất số tỉnh phía nam Trung Quốc giáp với biên giới nước ta Ở nước ta bệnh phân bố hầu hết khắp vùng trồng khoai tây cà chua Bệnh gây hại mạnh quanh năm vùng có khí hậu mát mẻ Lâm Đồng, Lào Cai, gây hại vào vụ đông đông xuân tỉnh đồng Bắc Bộ Bắc Trung Bộ nơi có mùa đơng lạnh 3.4 Triệu chứng Bệnh hại thân, củ Triệu chứng bệnh đa dạng tùy thuộc vào điều kiện thời tiết Triệu chứng bệnh lá: Vết bệnh ban đầu điểm nhỏ màu xanh thẫm sau lan rộng có màu nâu thẫm, ranh giới mô bệnh mô khỏe không rõ ràng Bệnh thường xuất mép chóp sau lan rộng vào phiến Phần vết bệnh hóa nâu đen đám mơ bị chết hóa nấu, xung quanh vết bệnh thường có đám cành bảo tử bảo tử phân sinh màu trắng Khi thời tiết ẩm ướt buổi sáng có sương đám bào tử phân sinh dày xốp tạo lớp trắng sương muối mặt bệnh Triệu chứng cuống lá, cành, thân Các vết bệnh lúc đầu nâu thâm đen sau lan rộng xung quanh kết hợp với tạo thành đoạn dài Trên thân vết bệnh kéo dài thành đoạn vỏ thân thâm đen thối ướt Khi điều kiện độ ẩm xuống thấp vết bệnh chết tóp lại Khi độ ẩm vết bệnh có lớp cành bào tử bào tử phân sinh trắng sương muối bao phủ Bệnh làm cho thân cành bị thối mềm có mùi mốc Triệu chứng củ khoai tây nhầm lẫn với số bệnh thối củ vi khuẩn có chung đặc điểm có vết màu nâu lõm xuống Tuy vậy, cắt ngang củ thấy mơ bệnh có màu nâu xám lan rộng vào phía đơi cịn ăn sâu vào lõi củ Các củ bị bệnh lát củ đạt nhiệt độ