Cây Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla Vahl) được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền để chữa các bệnh như xuất huyết tiêu hóa, ho ra máu, nôn ra máu, chảy máu cam, đòn ngã sưng đau, thấp khớp, đau nhức xương. Cặn chiết tổng của thân, lá và quả của cây Tử châu lá to thể hiện hoạt tính gây độc in vitro trên ba dòng tế bào ung thư ở người (phổi: Lu-1, gan: Hep-G2 và vú: MCF-7) bằng phương pháp SRB với giá trị CS (%) trong khoảng từ 30,23 1,5 đến 90,22 0,15%.
No.21_June 2021 |p.81-86 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC TÂN TRÀO ISSN: 2354 - 1431 http://tckh.daihoctantrao.edu.vn/ THE IN VITRO CYTOTOXICITY ACTIVITIES OF THE EXTRACTS FROM CALLICARPA MACROPHYLLA VAHL IN THAI NGUYEN PROVINCE Vu Thi Thu Le1, Pham Thi Hong Minh2, Nguyen Thuong Tuan1, Dao Viet Hung1, Hoang Thi Bich2, Do Tien Lam2* Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry, Vietnam Institute of Natural Products Chemistry, Vietnam * Email address: dotienlam198@gmail.com http://doi.org/10.51453/2354-1431/2021/553 Article info Abstract Callicarpa macrophylla Vahl has widely been used in traditional medicine for Recieved: 30/3/2021 Accepted: 3/5/2021 the treatment such as gastrointestinal hemorrhage, coughing up blood, vomiting blood, nosebleeds, swollen and painful fall, rheumatism, bone pain, etc The crude extract of the stem, leaves and fruits of Callicarpa macrophylla Vahl have exhibited demonstrated cytotoxicity against three human cancer cell lines (Lu-1, Hep-G2 MCF-7) was tested by SRB assay with CS (%) values ranging from Keywords: Callicarpa macrophylla Vahl, Callicarpa, Lu-1, Hep-G2 and MCF-7 30,23 1,5 to 90,22 0,15% Inside, The methanol extract of the leaves of Callicarpa macrophylla Vahl have showed relatively potent cytotoxicity with CS (%) values ranging from 30,23 1,5 to 47,84 2,1% The n-hexane fraction (L.CM.H) of the leaves of Callicarpa macrophylla Vahl have exhibited potent against three human cancer cell lines (Lu-1, Hep-G2 MCF-7) than ethyl acetate fraction (L.CM.E) and methanol fraction (L.CM.M) with CS (%) values ranging from 12,49 1,4 to 20,18 0,8% No.21_June 2021 |p.81-86 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC TÂN TRÀO ISSN: 2354 - 1431 http://tckh.daihoctantrao.edu.vn/ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO CỦA CÁC CẶN CHIẾT LOÀI TỬ CHÂU LÁ TO (CALLICARPA MACROPHYLLA VAHL.) Ở THÁI NGUYÊN Vũ Thị Thu Lê1, Phạm Thị Hồng Minh2, Nguyễn Thương Tuấn1, Đào Việt Hùng1, Hồng Thị Bích2, Đỗ Tiến Lâm 2* Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Việt Nam Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên, Việt Nam * Địa email: dotienlam198@gmail.com http://doi.org/10.51453/2354-1431/2021/553 Thông tin viết Tóm tắt Cây Tử châu to (Callicarpa macrophylla Vahl) sử dụng rộng rãi Ngày nhận bài: y học cổ truyền để chữa bệnh xuất huyết tiêu hóa, ho máu, nơn 30/3/2021 Ngày duyệt đăng: máu, chảy máu cam, đòn ngã sưng đau, thấp khớp, đau nhức xương… Cặn chiết tổng thân, Tử châu to thể hoạt tính gây độc 3/5/2021 in vitro ba dòng tế bào ung thư người (phổi: Lu-1, gan: Hep-G2 vú: MCF-7) phương pháp SRB với giá trị CS (%) khoảng từ 30,23 Từ khóa: 1,5 đến 90,22 0,15% Trong đó, cặn chiết methanol tổng Tử châu to (Callicarpa macrophylla Vahl) thể hoạt tính gây độc tế bào tốt với Callicarpa macrophylla giá trị CS (%) khoảng từ 30,23 1,5 đến 47,84 2,1% Phân đoạn n- Vahl, Callicarpa, Lu-1, hexane (L.CM.H) Tử châu to biểu hoạt tính gây độc tế bào tốt Hep-G2 MCF-7 so với phân đoạn ethyl acetate (L.CM.E) methanol (L.CM.M) với giá trị CS (%) từ 12,49 1,4 đến 20,18 0,8% I MỞ ĐẦU Chi Callicarpa L (Chi Tu hú, Nàng nàng hay Tử trung Nghệ An, Huế, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Kon châu) có khoảng 140 lồi, thuộc họ Verbenaceae, bao Tum, Đắc Lắc, Gia Lai, Ở phía Nam có Bình Dương, gồm thân gỗ nhỏ bụi, hay gặp phổ biến Đồng Nai [ 6] vùng nhiệt đới cận nhiệt đới, chủ yếu Có nhiều lồi thuộc chi Callicarpa sử nước thuộc châu Á, số loài gặp dụng y học dân gian nhiều dân tộc, vùng xích đạo châu Mỹ Australia [2] Ở Việt nước châu Á, Australia Mỹ Khoảng 20 loài thực Nam, Theo tác giả Võ Văn Chi, chi Callicarpa có 14 lồi vật chi Callicarpa cơng bố tác dụng [3,4], tác giả Phạm Hoàng Hộ thống kê chi Callicarpa có sử dụng y học dân gian Trong đó, 26 lồi [5], cịn theo nhà thực vật học thuộc Viện số loài biết đến hay sử dụng y học cổ Sinh thái tài nguyên sinh vật thống kê 21 loài truyền Trung Quốc Nam Á việc điều [6] Được phân bố rải rác khắp nước Phía Bắc trị bệnh viêm gan, bệnh thấp khớp, sốt, nhức đầu, Tuyên Quang, Lạng Sơn, Sơn La, Bắc Cạn, Phú khó tiêu bệnh khác Một số loài Callicarpa Thọ, Bắc Giang, Ba Vì, Thái Ngun, số vùng miền cơng bố sử dụng chống lại ung thư V.T.T.Le et al/ No.21_Jun 2021|p.81-86 (ví dụ, rễ Callicarpa americana để điều trị thiết bị siêu âm nhiệt độ phòng Dịch tổng thu bệnh ung thư da vỏ Callicarpa rubella để cất kiệt dung môi áp suất giảm, nhiệt độ < 50 oC thu cặn cô methanol (ethanol) Cặn cô điều trị khối u ruột già) Các dịch chiết thu từ 14 loài chi Callicarpa đánh giá tác dụng sinh học gồm khả kháng khuẩn, methanol (ethanol) thêm nước chiết với dung mơi có độ phân cực tăng dần n- bào hoạt động phytotoxic Ngoài acid hexane ethyl acetate Sau đuổi dung môi thu cặn n-hexane, cặn ethyl acetate cặn nước amin, benzenoid, carbohydrate đơn giản, lipid, tương ứng diterpene, flavonoid, phenylpropanoid, phytosterol, Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro theo phương pháp SRB kháng nấm, chống côn trùng sinh trưởng, gây độc tế sesquiterpene, triterpene phát hiện, phân lập từ chi Callicarpa [3] Trong y học đại, kết nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính sinh học số lồi thực 3.1 Ngun liệu Theo phương pháp Skehan & cs (1990) [7] vật Callicarpa chứng minh chúng chứa Likhiwitayawuid & cs (1993) [8] áp dụng Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia Mỹ nhiều hoạt chất có tác dụng sinh học q hoạt tính kháng viêm, cầm máu, bảo vệ thần kinh, (NCI) trường đại học Dược, đại học Tổng hợp chống lao, giảm đau, kháng khuẩn, chống oxy hóa chống ung thư… góp phần làm sáng tỏ việc sử Illinois, Chicago, Mỹ Dòng tế bào: dụng thực vật chi dân gian cho thấy cung cấp lượng lớn chất chuyển Dòng Hep-G2 (Human carcinoma – Ung thư gan) hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học [2,3] Dòng Lu-1 (Human lung adenocarcinoma – Ung thư biểu mơ phổi) Lồi Callicarpa macrophylla Vahl Việt Nam, thuộc chi Callicarpa nhân dân sử dụng thuốc hepatocellular Dòng MCF-7 (Human breast adenocarcinoma – chữa bệnh dân gian, có tiềm lớn hoạt chất sinh học mà nước chưa Ung thư vú) nghiên cứu đầy đủ Nghiên cứu tập trung vào hoạt tính gây độc in vitro dịng tế bào ung Môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) MEME (Minimum Essential thư người: phổi (Lu-1), gan (Hep-G2) vú (MCF- Medium with Eagle’s salt) có bổ sung LGlutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF 7) cặn chiết thu từ loài Callicarpa macrophylla Vahl theo phương pháp SRB II THỰC NGHIỆM Nguyên liệu Môi trường dụng cụ, hóa chất: (Penicillin - Streptomycin sulfate - Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum), Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO Lá, thân cành loài Tử châu to thu huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên vào tháng 10 năm (Dimethyl Sulfoside); TCA (Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB 2017 TS Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên (Sulfo Rhodamine B); Acid acetic nhiên Việt Nam - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học Callicarpa macrophylla Vahl, số tiêu CA20171002.HN lưu Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam Phương pháp xử lý chiết mẫu Các mẫu thực vật sau thu hái xử lý theo phương pháp chung sau: Các dụng cụ dùng lần: Bình ni cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur, đầu týp cho micropipet… Chất chuẩn chứng dương tính: Ellipticine pha DMSO 3.2 Phương pháp tiến hành Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein Các mẫu thực vật sau thu hái thái nhỏ, phơi bóng mát, sấy khơ nhiệt độ 60 oC đến tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – khối lượng khơng đổi, sau đem nghiền nhỏ Mẫu ngâm chiết lần methanol (ethanol) tế bào nhuộm Sulforhodamine B Optical Density) đo thành phần protein (SRB) Giá trị OD máy đo tỉ lệ thuận với V.T.T.Le et al/ No.21_Jun 2021|p.81-86 ( ( lượng SRB gắn với phân tử protein, lượng tế bào nhiều (lượng protein nhiều) giá ) ) ( ( ) ) trị OD lớn Phép thử thực Giá trị CS (%) sau tính theo cơng thức trên, điều kiện cụ thể sau: Chất thử (10 l) pha đựơc đưa vào tính tốn Excel để tìm % trung DMSO 10% đưa vào giếng khay 96 bình ± độ lệch tiêu chuẩn phép thử lặp lại giếng để có nồng độ sàng lọc 100 g/ml Chất lần theo cơng thức Ducan sau: Độ lệch thử có hoạt tính xác định IC50 nhờ dải nồng độ tiêu chuẩn σ: 100 g/ml; 20 g/ml; g/ml; 0,8 g/ml Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào đếm buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm Thêm vào giếng thí nghiệm xi x ^ 2 / n 1 Các thử nghiệm thực Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam lượng tế bào phù hợp (trong 190 l môi trường) III Kết nghiên cứu để chúng phát triển vòng từ 3-5 ngày Một 3.1 Thu nhận cặn chiết Lá Tử châu to: Mẫu sấy khô nhiệt độ 60 khay 96 giếng khác khơng có chất thử có tế bào ung thư (190 l) sử dụng làm đối chứng ngày Sau giờ, đĩa đối chứng ngày cố định tế bào Trichloroacetic acid – TCA Sau giai đoạn phát triển tủ ấm CO2, tế bào cố định vào đáy giếng TCA 30 phút, nhuộm SRB 37 oC Đổ bỏ SRB giếng thí nghiệm rửa lần 5% acetic acid để khơ khơng khí nhiệt độ phòng Cuối cùng, sử dụng 10 M dung o C đến khối lượng không đổi 3500 g, đem nghiền nhỏ ngâm chiết lần với MeOH thiết bị siêu âm nhiệt độ phòng Dịch tổng thu cất kiệt dung môi áp suất giảm, nhiệt độ < 50 oC thu cặn cô MeOH (L.CM, 195g) Cặn cô MeOH thêm nước chiết với dung mơi có độ phân cực tăng dần n-hexane, EtOAc sau cất kiệt dung mơi thu cặn tương ứng: n-hexane (CMH: 45 g), ethyl acetate (CME: 25 g) nước (CMW: 110 g) dịch base Tris để hòa tan lượng SRB bám Thân cành Tử châu to: sấy khô, xay nhuộm phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhỏ thu bột mẫu khô (4,5 kg) Bột mẫu khô nhẹ 10 phút sử dụng máy ELISA Plate ngâm chiết với etanol Quá trình chiết thực Reader (Bio-Rad) để đọc kết hàm lượng gián đoạn nhiệt độ 40 °C thiết bị chiết siêu âm màu chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ bước gia nhiệt lần, lần khoảng 4-5 Dịch chiết sóng 515nm Các phép thử lặp lại lần để gom lại, lọc qua giấy lọc cất loại dung mơi đảm bảo tính xác Ellipticine (Sigma) ln áp suất giảm thu cặn chiết tổng thân sử dụng chất đối chứng dương cành Tử châu to (T.CM, 230 g) thử nghiệm nồng độ: 10 g/ml, g/ml, 0,4 Quả Tử châu to: sấy khô, xay nhỏ thu g/ml 0,08 g/ml DMSO 10% sử bột mẫu khô (0,12 kg) Bột mẫu khô ngâm dụng đối chứng âm chiết với etanol Q trình chiết thực gián 3.3 Tính kết Kết đọc máy ELISA bước sóng 495-515 nm Giá trị CS (Cell Survival): khả sống sót đoạn nhiệt độ 40 °C thiết bị chiết siêu âm gia nhiệt lần, lần khoảng 4-5 Dịch chiết gom lại, lọc qua giấy lọc cất loại dung môi áp suất giảm thu cặn chiết tổng Tử châu to (Q.CM, g) tế bào nồng độ chất thử tính theo Kết xử lý chiết mẫu thực vật, tạo % so với đối chứng Dựa kết đo cặn chiết tổng cặn dịch chiết phân đoạn n- chứng OD (ngày 0), DMSO 10% so sánh với hexan, etyl axetat metanol Tử châu to giá trị OD trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo (Callicarpa macrophylla Vahl) tóm tắt cơng thức: bảng 1: V.T.T.Le et al/ No.21_Jun 2021|p.81-86 Bảng Kết xử lý chiết mẫu Tử châu to (Callicarpa macrophylla Vahl) Danh sách mẫu thu thập Khối Khối Khối lượng tươi lượng khô lượng cặn (kg) (kg) tổng (g) Lá 15 3,5 190 Quả 0,5 0,12 19 Thân cành 25 4,5 230 Bộ phận Ký hiệu mẫu mẫu C macrophylla Khối lượng phân đoạn (g) Hexan EtOAc EtOH 45 25 110 phương pháp SRB Tiếp đó, dịng tế bào ung 3.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro thư bị ức chế mạnh cặn chiết methanol cao chiết từ loài Tử châu to Hoạt tính gây độc tế bào in vitro cặn chiết lựa chọn để sàng lọc hoạt tính cặn methanol từ lá, thân cành Tử châu chiết phân đoạn n-hexane, EtOAc nước Các to (C macrophylla) thử nghiệm dòng tế mẫu đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ba bào ung thư (Lu-1, Hep-G2 MCF-7) theo dòng tế bào ung thư Kết thể bảng Bảng Hoạt tính gây độc tế bào in vitro cặn chiết Tử châu to TT Ký hiệu mẫu Nồng độ đầu Giá trị CS (%) dòng tế bào (g/ml) Hep-G2 LU-1 MCF-7 DMSO - 100 100 100 Chứng (+) 1,34 0,8 2,66 0,9 1,21 0,7 Q.CM 40 60,02 2,3 47,31 1,5 38,86 2,3 T.CM 40 64,66 2,2 55,64 2,8 90,22 0,2 L.CM 40 47,84 2,1 39,40 2,2 30,23 1,5 (Q : quả, T : thân cành, L : lá, CC: C candicans, CM: C macrophylla) Kết cho thấy cặn chiết tổng methanol hóa học ưu tiên tập trung vào Tử (ethnanol) từ lá, quả, thân loài Tử châu to thể châu to hoạt tính ức chế tốt dịng tế bào ung thư Tiếp tục thử hoạt tính cặn chiết phân đoạn n-hexane, EtOAc methanol Tử châu to dòng tế bào ung thư Hep-G2, Lu1 MCF-7, kết thử nghiệm thể bảng Ngoại trừ cặn chiết phân đoạn methanol khơng thể hoạt tính, cặn chiết phân đoạn lại lồi có tác dụng mức độ khác nhau, phân đoạn nhexane (L.CM.H) thể hoạt tính mạnh với giá trị CS (%) thấp với giá trị CS (%) từ 12,49 1,4 đến 20,18 0,8% Kết giải thích diện nhóm chất có hoạt tính gây độc tế bào mạnh terpenoid flavonoid phân đoạn có độ phân cực yếu trung bình thử nghiệm với giá trị CS (%) khoảng từ 30,23 1,5 đến 90,22 0,15% Đặc biệt cặn chiết methanol Tử châu to (L.CM) có tác dụng ức chế tốt với giá trị CS (%) 47,84 2,1 (đối với dòng tế bào ung thư Hep-G2); 39,40 2,2 (đối với dòng tế bào ung thư Lu-1) 30,23 1,5 (đối với dòng tế bào ung thư MCF-7) Qua kết sàng lọc sơ hoạt tính gây độc tế bào ung thư 03 dòng tế bào ung thư HepG2, Lu-1 MCF-7 cho thấy Tử châu to có tác dụng mạnh thân cành chúng Do vậy, nghiên cứu hoạt tính thành phần V.T.T.Le et al/ No.21_Jun 2021|p.81-86 Bảng Hoạt tính gây độc tế bào cặn chiết phân đoạn từ Tử châu to TT Ký hiệu mẫu Nồng độ đầu (g/ml) Giá trị CS (%) dòng tế bào Hep-G2 LU-1 MCF-7 DMSO - 100 100 100 Chứng (+) 1,34 0,8 2,66 0,9 1,21 0,71 L.CM.H 40 20,18 0,8 12,49 1,4 11,61 2,11 L.CM.E 40 98,03 0,9 18,20 1,3 40,43 2,79 L.CM.M 40 100 100 91,29 0,32 (L: lá, H: n-hexane, E: ethyl acetate, M: methanol, CM: C macrophylla) KẾT LUẬN Cặn chiết tổng methanol (ethnanol) từ lá, quả, [3] Yanhua, T., Lianna, S., Meili, Guo., Wansheng, C (2013) The medicinal uses of thân loài Tử châu to thể hoạt tính ức chế tốt dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá Callicarpa L in traditional Chinese medicine: An ethnopharmacological, phytochemical and trị CS (%) khoảng từ 30,23 1,5 đến 90,22 pharmacological review Journal ethnopharmacology, 146(2): 465-481 0,15% Cặn chiết methanol Tử châu to (L.CM) có tác dụng ức chế tốt với giá trị CS (%) từ 30,23 1,5 đến 47,84 2,1% Các cặn chiết phân đoạn n-hexane, EtOAc methanol Tử châu to dòng tế bào ung thư Hep-G2, Lu-1 MCF-7, ngoại trừ cặn chiết phân đoạn methanol of [4] Chi, V.V (2012) Dictionary on Vietnamese Medicinal Plants Publishers of Medical, Ho Chi Minh City, 2, 198, Vietnam [5] Ho, P.H (2000) Vietnamese plants Tre Publishing House Ho Chi Minh City, 213-216, Vietnam hoạt tính, cặn chiết phân đoạn cịn lại lồi có tác dụng mức độ khác nhau, of Vietnam Agriculture Publishing House, Hanoi, phân đoạn n-hexane (L.CM.H) thể 2, 284-286, Vietnam hoạt tính mạnh với giá trị CS (%) từ 12,49 1,4 đến 20,18 0,8% REFERENCES [1] Phuong, V.X (2007) Science and technics publishing house Flora of Vietnam Verbenaceae Scientific & Technical Publishing, Hanoi, 6, 284, Vietnam [2] Jones William P., Kinghorn A.D (2008) Biologically active natural products of the genus Callicarpa Current bioactive compounds 4(1): 1532 [6] Ban, N.T (2003) Checklist of Plant Species [7] Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., McMahon, J., Vistica, D., Warren, J.T., Bokesch, H., Kenney, S., Boyd, M.R (1990) New Colorimetric Cytotoxicity Assay for Anticancer-Drug Screening Journal of National Cancer Institute 82(13): 1107-1112 [8] Likhitwitayawuid, K., Angerhofer, C.K., Cordell, G.A., Pezzuto, J.M., Ruangrungsi, N (1993) Cytotoxic and antimalarial bisbenzylisoquinoline alkaloids from Stephania erecta Journal of Natural Products 56(1): 30-38 ... cao chiết từ loài Tử châu to Hoạt tính gây độc tế bào in vitro cặn chiết lựa chọn để sàng lọc hoạt tính cặn methanol từ lá, thân cành Tử châu chiết phân đoạn n-hexane, EtOAc nước Các to (C macrophylla) ... http://tckh.daihoctantrao.edu.vn/ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO CỦA CÁC CẶN CHIẾT LOÀI TỬ CHÂU LÁ TO (CALLICARPA MACROPHYLLA VAHL.) Ở THÁI NGUYÊN Vũ Thị Thu Lê1, Phạm Thị Hồng Minh2, Nguyễn Thương Tuấn1,... nghiệm dòng tế mẫu đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ba bào ung thư (Lu-1, Hep-G2 MCF-7) theo dòng tế bào ung thư Kết thể bảng Bảng Hoạt tính gây độc tế bào in vitro cặn chiết Tử châu to TT Ký hiệu