Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là lai tạo và tuyển chọn được các chủng nấm sò, nấm chân dài sinh trưởng và phát triển tốt, có năng suất và chất lượng cao đồng thời xây dựng được quy trình kỹ thuật nhân giống, nuôi trồng thích hợp nhằm phát triển các chủng nấm mới có triển vọng trong sản xuất.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGÔ XUÂN NGHIỄN NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO, HỒN THIỆN QUY TRÌNH KỸ THUẬT NI TRỒNG NẤM SỊ (PLEUROTUS SP.) VÀ NẤM CHÂN DÀI (CLITOCYBE SP.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGƠ XN NGHIỄN NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO, HỒN THIỆN QUY TRÌNH KỸ THUẬT NI TRỒNG NẤM SỊ (PLEUROTUS SP.) VÀ NẤM CHÂN DÀI (CLITOCYBE SP.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TSKH Trịnh Tam Kiệt PGS.TS Đặng Trọng Lƣơng Hà Nội, 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình ― Nghiên cứu chọn tạo, hồn thiện quy trình kỹ thuật ni trồng nấm sị (Pleurotus sp.) nấm chân dài (Clitocybe sp.) tập thể tác giả đồng ý cho phép nghiên cứu sinh sử dụng bảo vệ luận án tiến sĩ Số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa sử dụng bảo vệ học vị tác giả khác Tôi xin cam đoan thông tin trích dẫn khóa luận rõ nguồn gốc giúp đỡ cảm ơn Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả Ngô Xuân Nghiễn i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, bên cạnh nỗ lực phấn đấu thân, tơi cịn nhận nhiều động viên, giúp đỡ nhiều mặt cấp lãnh đạo, cá nhân, tập thể đơn vị khác Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS.TSKH Trịnh Tam Kiệt PGS.TS Đặng Trọng Lương, người thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt cho tơi thực hoàn thành luận án Cố GS.TS Nguyễn Hữu Đống, cử nhân Đinh Xuân Linh, cử nhân Nguyễn Thị Sơn người thầy, người anh/chị giúp đỡ chặng đường đến với nghề nấm Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán Trung tâm Nghiên cứu phát triển nấm, Trung tâm Nấm Văn Giang đồng hành tơi phần lớn q trình nghiên cứu Tơi gửi lời cảm ơn tới giúp đỡ quý báu Lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp, Bộ môn Kỹ thuật Di truyền phòng ban chức Viện Tập thể cán Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội cộng tác, giúp đỡ việc thực đề tài nghiên cứu Lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, tập thể thầy cô Ban đào tạo Sau Đại học tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực luận án Tôi trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Khoa Công nghệ Sinh học phòng ban chức Học viện tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ thời gian, sở vật chất, học thuật nhân lực Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới người thân gia đình, ln bên, chăm lo, động viên vật chất, tinh thần TS Nguyễn Thị Bích Thùy tồn thể bạn bè giúp đỡ tơi hồn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả Ngô Xuân Nghiễn ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình x MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu đề tài 4.1 Nấm sò 4.2 Nấm chân dài Ý nghĩa khoa học thực tiễn 5.1 Ý nghĩa khoa học 5.2 Ý nghĩa thực tiễn 5.3 Tính luận án CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm lớn giá trị dinh dưỡng nấm lớn 1.1.1 Giá trị dinh dưỡng nấm ăn 1.1.2 Giá trị dinh dưỡng cụ thể số số loài nấm ăn 1.1.3 Giá trị dinh dưỡng, dược học số loài nấm sò, nấm chân dài 1.2 Vị trí phân loại, phân bố, đa dạng, chu trình sống nấm sò, nấm chân dài 18 1.2.1 Vị trí phân loại 18 1.2.2 Chu trình sống nấm đảm (nấm sò, nấm chân dài) 20 1.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất nấm 22 1.3.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất nấm giới 22 1.3.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất nấm Việt Nam 31 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng sợi nấm thể (nấm sò, nấm chân dài) 35 1.4 Vai trò trồng nấm phát triển nông nghiệp bền vững 40 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Vật liệu nghiên cứu 42 iii 2.1.1 Giống nấm: 42 2.1.2 Vật tư hóa chất 43 2.1.3 Các điều kiện, trang thiết bị sử dụng thí nghiệm 44 2.2 Phương pháp nghiên cứu 45 2.2.1 Thu thập, lai tạo tuyển chọn chủng nấm sò 45 2.2.2 Thu thập, tuyển chọn chủng nấm chân dài nhập nội 48 2.2.3 Phương pháp RAPD - PCR kết hợp với đặc điểm hình thái để nhận diện chủng nấm sò lai, nấm sò nhập nội nấm chân dài 49 2.2.4 Nghiên cứu quy trình cơng nghệ nhân giống nấm dịch thể cấp 1, cấp trung gian (cấp 2) nấm sò lai nấm chân dài có triển vọng nghiên cứu 50 2.2.5 Nghiên cứu hồn thiện quy trình kỹ thuật ni trồng chủng nấm sị lai, nấm chân dài có triển vọng 52 2.3 Phương pháp chuẩn bị mơi trường điều kiện thí nghiệm 55 2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 56 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 58 2.6 Địa điểm thời gian thí nghiệm 58 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59 3.1 Thu thập, lai tạo tuyển chọn chủng nấm sò 59 3.1.1 Thu thập, đánh giá nguồn gen nấm sị thương phẩm có nước nhập nội 59 3.1.2 Kết lai tạo nấm sò từ nguồn bố mẹ số chủng nấm thương phẩm nhập nội có đặc tính ưu việt nuôi trồng Việt Nam 61 3.1.3 Kết Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng nấm sò lai tạo 65 3.2 Thu thập, tuyển chọn chủng nấm chân dài nhập nội 75 3.2.1 Thu thập, đánh giá nguồn gen nấm chân dài Clitocybe maxima (Gantn.ex Mey.Fr.) nhập nội 75 3.2.2 Một số đặc điểm sinh học chủng nấm chân dài (Bi), (Bi0) nhập nội 78 3.3 Đánh giá khác biệt di truyền nhận diện chủng nấm sò lai, nấm sò nhập nội nấm chân dài thị RAPD - PCR 84 3.3.1 Đánh giá khác biệt di truyền nhận diện chủng nấm sò lai, nấm sò nhập nội thị phân tử RAPD - PCR 84 3.3.2 Đánh giá khác biệt di truyền nhận diện chủng nấm chân dài nhập nội thị phân tử 96 iv 3.4 Nghiên cứu quy trình cơng nghệ nhân giống nấm dịch thể cấp 1, cấp trung gian (cấp 2) nấm sò lai (P7) nấm chân dài (Bi) có triển vọng 103 3.4.1 Kết nghiên cứu công nghệ nhân giống cấp nấm chân dài, nấm sò lai dạng dịch thể 103 3.4.2 Kết nghiên cứu nhân giống nấm sò lai nấm chân dài dạng dịch thể cấp trung gian (cấp 2) 110 3.5 Kết nghiên cứu hoàn thiện quy trình kỹ thuật ni trồng chủng nấm sị lai P7, nấm chân dài Bi 118 3.5.1 Hồn thiện quy trình kỹ thuật ni trồng nấm sị lai P7 nấm chân dài Bi chất tổng hợp giống nấm chất hạt (công nghệ cũ) 118 3.5.2 Hồn thiện quy trình kỹ thuật ni trồng nấm sị lai P7 nấm chân dài Bi chất tổng hợp giống nấm môi trường dịch thể (công nghệ mới) 128 3.6 Tóm tắt quy trình cơng nghệ nhân giống, ni trồng số chủng nấm có triển vọng 134 3.7.1 Quy trình cơng nghệ nhân giống nấm sò lai P7 dạng dịch thể 134 3.6.2 Quy trình cơng nghệ nhân giống nấm chân dài Bi dạng dịch thể 135 3.6.3 Quy trình cơng nghệ ni trồng nấm sị lai P7 chất tổng hợp 136 3.6.4 Quy trình cơng nghệ ni trồng nấm chân dài Bi chất tổng hợp 138 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 140 Kết luận 140 Kiến nghị 141 CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 142 TÀI LIỆU THAM KHẢO 143 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng việt CT Công thức CNM Cao nấm men [CO2 ] Nồng độ CO2 CTAB Cetyltrimethyl Ammonium Bromide ĐC Đối chứng ĐK Đường kính dNTPs Deroxyribonucleotide Triphotphates EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid KLC Khuẩn lạc cầu PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng nhân gen) PGA Potato glucose agar PĐ/C Phương pháp ủ nguyên liệu đối chứng ppm Part per milion PTN Phương pháp ủ nguyên liệu thí nghiệm PSK Polysaccharide krestin RAPD Random Amplified Polymorphism DNA (dùng đoạn ngẫu nhiên Oligonucleotid DNA PCR) SK Sinh khối T Thời gian TB Trung bình TE Tris EDTA THT Thời gian hình thành TXH Thời gian xuất UV Ultra violet ray V/N/M Lít khơng khí/lít mơi trường/phút FPLC Fast protein liquid chromatography LSD0,05 Kiểm tra sai khác giá trị trung bình có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% CV% Hệ số biến thiên vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân tích dinh dưỡng lồi nấm ăn khác Bảng 1.2 Hàm lượng chất khống (mg/100g) số lồi nấm ăn khác Bảng 1.3 Các chất kháng dinh dưỡng (mg/g) loài nấm ăn khác Bảng 1.4 Hoạt tính enzyme thủy phân ngoại bào (mm) loài nấm ăn khác Bảng 1.5 Hàm lượng chất khô (g/100g lượng chất tươi), thành phần gần (g/100g lượng chất khô) lượng (kcal/kg lượng chất tươi) 11 Bảng 1.6 Tỷ lệ axit amin thiết yếu (% tổng số axit amin) protein nấm nuôi trồng 12 Bảng 1.7 Tỷ lệ axit béo chủ yếu (% tổng số axit béo) 13 Bảng 1.8 Hàm lượng đường hòa tan polyol (g/100g chất khô) 14 Bảng 1.9 Tỷ trọng chất xơ tổng số (TDF, % chất khô) thành phần monosaccharide tổng lượng chất xơ (% polysaccharide tổng số) nấm sò nâu Pleurotus sajor-caju 15 Bảng 1.10 Hàm lượng số ngun tố khống (mg/100g chất khơ) số lồi nấm tự nhiên 15 Bảng 1.11 Sự biến đổi chất khống nấm Clitocybe nebularis (mg/100g chất khô) 15 Bảng 1.12 Hàm lượng provitamin ergosterol (mg/100g chất khô) tocopherol (μg/100g chất khơ)hịa tan chất béo 16 Bảng 1.13 Hàm lượng vitamin tan nước nấm sị Pleurotus ostreatus ni trồng (mg hay μg/100gchất khô) 16 Bảng 1.14 Kết phân tích chủng nấm sò lai trắng Pl1 17 Bảng 1.15 Kết phân tích hàm lượng số thành phần dinh dưỡng nấm chân dài Bi (Tính theo chất khơ tuyệt đối) 17 Bảng 2.1 Nguồn giống nấm sò, nấm chân dài 42 Bảng 2.2 Danh sách mồi RAPD sử dụng nghiên cứu chủng nấm sò, nấm chân dài 43 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái hệ sợi, thê suất giống nấm sò thương phẩm, nhập nội 59 Bảng 3.2 Danh sách dòng đơn bội chủng nấm sò khác 61 Bảng 3.3 Danh sách lai tạo 63 vii Bảng 3.4 Sự sinh trưởng, phát triển nấm sò lai pha sợi 65 Bảng 3.5 Đặc điểm hình thành thể chủng nấm sò lai 67 Bảng 3.6 Năng suất thu hái số chủng nấm sò lai 69 Bảng 3.7 Nguồn vật liệu nấm sò đánh giá nuôi trồng 70 Bảng 3.8 Tốc độ sinh trưởng, phát triển hệ sợi chủng nấm sị giá thể ni trồng 70 Bảng 3.9 Đặc điểm hình thái hệ sợi, tỷ lệ nhiễm chủng nấm sị giá thể ni trồng 72 Bảng 3.10 Đặc điểm hình thành thể chủng nấm sò 73 Bảng 3.11 Năng suất thu hái số chủng nấm sị lai, nhập nội qua ni trồng thử nghiệm 74 Bảng 3.12 Phân tích chất lượng chủng nấm sò lai P7 với chủng đối chứng Pl1 75 Bảng 3.13 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển chủng nấm chân dài 76 Bảng 3.14 Đặc điểm cấu thành suất giống nấm chân dài 77 Bảng 3.15 Đánh giá suất chất lượng nấm chân dài 77 Bảng 3.16 Ảnh hưởng hàm lượng KH2PO4 môi trường đến sinh trưởng hệ sợi nấm chân dài 80 Bảng 3.17 Ảnh hưởng trình khử trùng đến pH môi trường 81 Bảng 3.18 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển sợi nấm chân dài 82 Bảng 3.26 Bảng tổng hợp số băng xuất mồi, loại băng số băng cá biệt có mặt mẫu nấm nghiên cứu 93 Bảng 3.27 Hệ số tương đồng di truyền 10 mẫu nấm nghiên cứu 94 Bảng 3.28 Bảng tổng hợp số băng xuất mồi, loại băng số băng cá biệt có mặt mẫu nấm nghiên cứu 101 Bảng 3.29 Hệ số tương đồng di truyền mẫu nấm nghiên cứu 102 Bảng 3.30 Sự sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm chân dài, nấm sò lai môi trường dịch thể 105 Bảng 3.31 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm sò lai giống nấm chân dài cấp 107 Bảng 3.32 Ảnh hưởng thời gian nuôi đến sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm chân dài, nấm sò lai 108 viii ... trình ― Nghiên cứu chọn tạo, hồn thiện quy trình kỹ thuật ni trồng nấm sò (Pleurotus sp.) nấm chân dài (Clitocybe sp.) tập thể tác giả đồng ý cho phép nghiên cứu sinh sử dụng bảo vệ luận án tiến. .. 110 3.5 Kết nghiên cứu hồn thiện quy trình kỹ thuật ni trồng chủng nấm sị lai P7, nấm chân dài Bi 118 3.5.1 Hồn thiện quy trình kỹ thuật ni trồng nấm sò lai P7 nấm chân dài Bi chất... (cấp 2) nấm sị lai nấm chân dài có triển vọng nghiên cứu 3.5 Nghiên cứu hoàn thiện quy trình kỹ thuật ni trồng chủng nấm sị lai, nấm chân dài có triển vọng Phạm vi nghiên cứu đề tài 4.1 Nấm sò -