Luận văn thạc sĩ xác định một số trình tự ADN mã vạch và nhân giống cây râu mèo (orthosiphon aristatus (blume) MIQ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP CHU SỸ CƯỜNG XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ ADN MÃ VẠCH VÀ NHÂN GIỐNG CÂY RÂU MÈO (ORTHOSIPHON ARISTATUS (BLUME) MIQ) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN VĂN VIỆT Hà Nội, 2020 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi, hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Văn Việt Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa cơng bố hình thức Luận văn sử dụng thông tin, số liệu từ báo nguồn tài liệu tác giả khác có trích dẫn thích nguồn gốc đầy đủ Nếu có gian lận tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Học viên Chu Sỹ Cường ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp trang bị kiến thức cho tơi suốt q trình học tập Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Việt tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu đề tài hồn chỉnh Luận văn Thạc sĩ Tơi xin cảm ơn thầy cô cán Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp ln sát cánh hỗ trợ động viên vật chất tinh thần suốt trình học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 06 năm 2020 Học viên Chu Sỹ Cường iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Râu mèo 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật học Râu mèo 1.1.3 Đặc điểm sinh thái Râu mèo 1.1.4 Giá trị dược liệu, công dụng 1.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào 1.2.1 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật.8 1.2.2 Các bước tiến hành phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật.9 1.3 Thành tựu nuôi cấy mô tế bào dược liệu Cây Râu mèo 10 1.3.1.Nghiên cứu nước 11 1.3.2 Thế giới 13 1.4 Tổng quan mã vạch ADN 15 1.4.1 Giới thiệu mã vạch ADN (DNA barcode) 15 1.4.2 Một số mã vạch ADN thường sử dụng 18 1.4.3 Tình hình nghiên cứu mã vạch ADN thực vật 23 Chương MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Mục tiêu tổng quát 28 2.2 Mục tiêu cụ thể 28 2.3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 28 2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 28 iv 2.3.2 Hóa chất 28 2.3.3 Dụng cụ - máy móc 29 2.4 Nội dung phương pháp nghiên cứu .30 2.4.1 Nội dung nghiên cứu 30 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu 30 2.4.3 Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá 36 2.4.4 Phương pháp theo dõi 37 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 37 2.5 Địa điểm thời gian bố trí thí nghiệm .37 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .38 3.1 Xác định số trình tự ADN mã vạch Râu mèo .38 3.1.1 Kết tách chiết ADN tổng số 38 3.1.2 Kết nhân đoạn ADN mã vạch 39 3.1.3 Phân tích trình tự đoạn mã vạch ADN với đoạn mồi khác .43 3.1.4 So sánh hiệu giám định lồi ba trình tự ADN mã vạch ITS, psbA - trnH,và rbcL .53 3.2 Kết nhân giống Râu mèo kỹ thuật nuôi cấy in vitro 54 3.2.1 Kết tạo mẫu in vitro Râu mèo 54 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BAP, Kinetin NAA đến nhân nhanh chồi .57 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chất lượng Râu mèo 61 3.2.5 Nghiên chứu ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống sinh trưởng 64 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ BIỂU v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Các chữ TT viết tắt α-NAA ADN ATP BAP BME BOLD Bp CBOL CITES 10 cpDNA 11 CT 12 CTAB 13 ĐC 14 dNTP 15 EDTA 16 IBA vi TT Các chữ viết tắt 17 IGS 18 Kb 19 KIN 10 MS 21 mtDNA 22 NAD(P) H 23 NCBI 24 ORF 25 PCR 26 RNA 27 rRNA 29 SDS 30 Ta 31 TAE 32 tRNA 33 UV vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự thông tin cặp mồi đặc hiệu 29 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 32 Bảng 2.3 Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR 33 Bảng 3.1 Bảng so sánh kết giám định loài Râu mèo đoạn trình tự ITS, psbA - trnH rbcL 53 Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu tái sinh chồi 55 Bảng 3.3 Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi 58 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ 60 Bảng 3.5 Ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến khả sống .62 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thành phần ruột bầu đến khả sống 65 Phụ biểu 03 Tỷ lệ mẫu bật chồi ở cơng thức thí nghiệm với thời gian khác CT * Maubatchoi Crosstabulation CT1 CT2 CT CT3 CT4 CT5 Total Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (0.0%) have expected count less than The minimum expected count is 28.89 Phụ biểu 05 Tỷ lệ chồi hữu hiệu ở công thức thí nghiệm khác CT * Choihuuhieu Crosstabulation RM1 RM2 RM3 RM4 RM5 CT RM6 RM7 RM8 RM9 DC Total Phụ biểu 06 Kết quả kiểm tra tỷ lệ chồi hữu hiệu Chi-Square Tests Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (0.0%) have expected count less than The minimum expected count is 39.23 Phụ biểu 07 Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng chất ĐHST đến số chồi TB/mẫu nhanh ANOVA Hesonhannhanh Between Groups Within Groups Total Phụ biểu 08 Tỷ lệ rễ ở cơng thức thí nghiệm với nồng độ NAA khác CT * Tylerare Crosstabulation R0 R1 CT R2 R3 R4 Total Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (0.0%) have expected count less than The minimum expected count is 32.07 Phụ biểu 10 Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng nồng độ NAA đến số rễ TB/ chồi ANOVA SoreTB Between Groups Within Groups Total Phụ biểu 11 Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng nồng độ NAA đến chiều dài rễ TB ANOVA ChieudaireTB Between Groups Within Groups Total Phụ biểu 12 Tỷ lệ số sống sau huấn luyện ở thời gian khác CT * tylecaysong Crosstabulation T0 T1 CT T2 T3 Total Phụ biểu 13 Kết quả kiểm tra tỷ lệ số sống sau huấn luyện ở thời gian khác Chi-Square Tests Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (0.0%) have expected count less than The minimum expected count is 24.86 Phụ biểu 14 Tỷ lệ số sống sau bầu ngày CT * tylecaysong Crosstabulation T0 T1 CT T2 T3 Total Phụ biểu 15 Kết quả kiểm t Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (0.0%) have expected count less than The minimum expected count is 27.60 Phụ biểu 16 Tỷ lệ số sống ở công thức thành phần ruột bầu khác CT * tylecaysong Crosstabulation RB2 RB2 CT RB3 RB4 RB5 Total Phụ biểu 17 Kết quả kiểm tra tỷ lệ số sống ở cơng thức thí nghiệm thành phần ruột bầu khác Chi-Square Tests Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases a cells (0.0%) have expected count less than The minimum expected count is 20.86 Phụ biểu 18 Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng thành phần ruột bầu đến độ vượt chiều cao TB ANOVA ChieucaocayTB Between Groups Within Groups Total ... nghiên cứu xác định mã vạch ADN cho Râu mèo Vì vậy, việc nghiên cứu xác định số thị mã vạch ADN cho giống Râu mèo cần thiết Việc xác định số thị mã vạch ADN cho giống Râu mèo sẽ cung cấp sở... liệu ADN mã vạch cho loài Râu mèo nhằm xác định loài phục vụ bảo tồn phát triển dược liệu, tiến hành nghiên cứu: ? ?Xác định số trình tự ADN mã vạch nhân giống Râu mèo (Orthosiphon aristatus (Blume.)... cứu xác định số đoạn trình tự ADN mã vạch phục vụ giám định loài Râu mèo - Tách chiết ADN tổng số từ mẫu Râu mèo - Nhân đoạn gen ITS, psbA - trnH, rcbL phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu - Xác