Trong nghiên cứu này, promoter OsSWEET13 đã được phân lập từ DNA tổng số của giống lúa BT7. Kết quả cho thấy trình tự DNA phân lập được dài 640 bp, giống lần lượt 99,38% và 92,3% so với OsSWEET13 của lúa Japonica Nipponbare (AP014968.1) và Indica Shuhui498 (CP018168.1), chứa trình tự bám cho protein độc TAL (transcription activator-like) PthXo2(A) của Xoo. Mời các bạn tham khảo!
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ gRNA CHỈNH SỬA PROMTER OsSWEET13 LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA BẮC THƠM Phùng Thị Thu Hương1, Trần Thị Thanh Huyền2, Phạm Phương Ngọc3, Cao Lệ Quyên1, Phạm Xuân Hội1, Nguyễn Duy Phương1* TÓM TẮT Bệnh bạc vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây bệnh hại nghiêm trọng lúa Giống lúa Bắc thơm (BT7) giống chủ lực tỉnh phía Bắc lại mẫn cảm với bệnh bạc OsSWEET13 thuộc họ gen OsSWEET mã hóa protein vận chuyển saccrose, có liên quan đến chế xâm nhiễm vi khuẩn bạc thực vật Trong nghiên cứu này, promoter OsSWEET13 phân lập từ DNA tổng số giống lúa BT7 Kết cho thấy trình tự DNA phân lập dài 640 bp, giống 99,38 92,3 so với OsSWEET13 lúa Japonica Nipponbare (AP014968.1) Indica Shuhui498 (CP018168.1), chứa trình tự bám cho protein độc TAL (transcription activator-like) PthXo2(A) Xoo Dựa trình tự DNA phân lập được, hai cấu trúc gRNA thiết kế với mục đích chỉnh sửa vị trí bám đặc hiệu PthXo2(A) promoter OsSWEET13 bất hoạt hoàn tồn gen OsSWEET13 cơng nghệ CRISPR/CAS9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9), hướng tới mục tiêu tạo giống lúa BT7 suất cao có khả kháng bệnh bạc tương lai Từ khóa: Chỉnh sửa gen, bạc lá, CRISPR/CAS9, OsSWEET13, TAL effector, Xanthomonas oryzae ĐẶT VẤN ĐỀ Bạc lúa bệnh hại phổ biến khắp vùng trồng lúa giới, gây thiệt hại suất hàng năm trung bình 10 - 20 , chí số vùng thiệt hại lên đến 50 - 70 [17] Bệnh bạc xảy đặc biệt nghiêm trọng quốc gia trồng lúa khu vực châu Á, có Việt Nam Bắc thơm giống chủ lực Việt Nam, canh tác phổ biển hầu hết tỉnh khu vực phía Bắc Tuy nhiên, giống Bắc thơm lại mẫn cảm với bệnh bạc Chính vậy, việc nghiên cứu cải tiến khả kháng bệnh bạc cho giống Bắc thơm giúp ổn định sản xuất lúa gạo, đảm bảo an ninh lương thực quốc gia Bệnh bạc lúa gây vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) Xoo tiết loạt yếu tố độc lực, bao gồm hợp chất polyme ngoại bào (extracellular polymeric substances), enzyme ngoại bào, hợp chất tạo Viện Di truyền Nông nghiệp Học viện Nông nghiệp Việt Nam Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội * Email: phuongnd.bio@gmail.com 20 phức với ion sắt (siderophore) protein tiết loại III…, qua gây bệnh cho chủ [14] Protein TAL (transcription activator-like) protein tiết loại III Xoo, có chức hoạt hóa biểu gen “nhiễm” (Succeptible gene) hệ gen tế bào chủ cách liên kết với trình tự đích đặc hiệu vùng promoter gen đích (effector binding element - EBE), từ thúc đẩy q trình lây nhiễm Xoo [3] Ba gen OsSWEET11, OsSWEET13 OsSWEET14 thuộc họ OsSWEET mã hóa cho protein vận chuyển đường chứng minh mục tiêu thường xuyên protein TAL [2, 5, 6, 11, 26] Trên vùng promoter OsSWEET11 OsSWEET13 có chứa số EBE nhận biết protein TAL PthXo1 PthXo2 nhiều chủng Xoo châu Á [26] Nhiều nghiên cứu chứng minh đột biến xuất vị trí EBE vùng promoter gen “nhiễm” giúp lúa chống lại xâm nhiễm chủng Xoo tương ứng [1, 7, 8, 13, 27] Nghiên cứu Zhou (2015) cho thấy OsSWEET13 đối tượng tiềm cho mục đích nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc [27] CRISPR/CAS9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9) cơng cụ chỉnh sửa gen sử dụng N«ng nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 11/2020 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ rộng rãi Dựa chế hoạt động CRISPR/CAS9 (quá trình sgRNA (single guide RNA) điều tiết endonuclease CAS9 cắt đặc hiệu DNA sợi đôi) chế sửa chữa đứt gãy DNA sợi đôi (Double-Strand Break-DSB) tế bào, nhà nghiên cứu hồn tồn chủ động với mục tiêu chỉnh sửa gen [4] Hơn nữa, chỉnh sửa gen dựa chế sửa chữa DSB thông qua đường ghép nối điểm cuối không tương đồng (Non-Homologous End Joining-NHEJ) tế bào tạo sản phẩm trồng khơng mang DNA ngoại lai Vì vậy, cơng nghệ CRISPR/CAS9 có tiềm ứng dụng lớn cho nghiên cứu cải tiến tính trạng trồng Trong nghiên cứu này, tiến hành phân lập phân tích đoạn trình tự promoter/gen OsSWEET13 lúa Bắc thơm (gọi tắt SW13BT) mẫn cảm với bệnh bạc nhằm thiết kế gRNA cho hệ thống chỉnh sửa promoter/gen SW13BT Kết thu tiền đề cho nghiên cứu tạo giống lúa Bắc thơm (BT7) có khả kháng bệnh bạc công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/CAS9 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Giống lúa BT7 Tổng cơng ty Giống trồng Thái Bình cung cấp; chủng vi khuẩn E coli DH5α mua từ Hãng Thermo Fisher Scientific (Mỹ) Các oligonucleotide dùng cho PCR nhân SW13-BT thiết kế dựa trình tự công bố GenBank (AP014968.1) đặt mua từ Hãng Sigma (Mỹ) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tách chiết DNA từ lúa DNA tổng số lúa tách chiết theo phương pháp Doyle Doyle (1990) [9], sử dụng dung dịch CTAB 2 Mẫu lúa (100 mg) nghiền nitơ lỏng thành bột mịn, sau bổ sung 500 µl dung dịch CTAB 2 (có chứa ARNase 40 mg/ml) ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút để thu dịch 500 µl hỗn hợp phenol : chloroform : isoamyl (25 : 24 : 1) bổ sung vào dung dịch để kết tủa protein Hỗn hợp sau ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút để thu DNA tinh 2.2.2 Phân lập promoter SW13-BT Promoter gen SW13-BT phân lập từ DNA tổng số lúa kỹ thuật PCR [23], sử dụng hai mồi Sw13-Fw (5’CCGTATCAGGATTCAGGAATA-3’) Sw13-Rv (5’CCAGCCATTTTTGTGTGCTA-3’) Sản phẩm PCR tinh kit GenJET-TM Gel Extraction Hãng Thermo Fisher Scientific 2.2.3 Nhân dòng promoter SW13-BT Promoter SW13-BT nhân PCR nhân dòng kit pGEM-T Easy theo quy trình kèm Hãng Promega Vector tái tổ hợp biến nạp vào vi khuẩn E coli DH5α; thể biến nạp sàng lọc phương pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi T7/SP6 Plasmid tách chiết từ vi khuẩn E coli kit GenJET-TM Plasmid Miniprep Thermo Fisher Scientific Sản phẩm plasmid tái tổ hợp kiểm tra kỹ thuật PCR với cặp mồi Sw13-Fw/Sw13-Rv T7/SP6 phản ứng cắt giới hạn với enzyme EcoRI 2.2.4 Phân tích trình tự SW13-BT Trình tự DNA xác định thiết bị giải trình tự nucleotide tự động ABI3100 theo phương pháp Smith et al (1986) [25], sử dụng hai mồi T7 SP6 cho phản ứng PCR giải trình tự Kết giải trình tự xử lí phần mềm BioEdit 4.0 Trình tự DNA sau xử lí so sánh với sở liệu GenBank phân tích phần mềm Genetyx 4.0 2.2.5 Thiết kế trình tự gRNA đặc hiệu cho SW13-BT Trình tự gRNA đặc hiệu cho chỉnh sửa SW13-BT thiết kế phần CRISPR-P v2.0 (http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/) Cấu trúc bậc II gRNA phân tích phầm mềm Mfold 2.3 (http://unafold.rna.albany.edu/) Đoạn DNA tương đồng với gRNA hệ gen lúa xác định phần mềm CCTop (http://crispr.cos.uni-heidelberg.de) Trình tự hệ gen lúa tham chiếu từ sở liệu ngân hàng gen Ensembl Plants (http://plants.ensembl.org/) Đoạn gRNA đặc hiệu lựa chọn dựa vị trí SW13-BT, điểm đặc hiệu, hàm lượng GC, khả hình thành trì cấu trúc bậc II, số lượng vị trí đoạn DNA tương đồng xuất hệ gen lúa, vị trí số lượng nucleotide sai khác gRNA [16] KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân lập promoter/gen OsSWEET13 lỳa BT Nông nghiệp phát triển nông thôn - KỲ - TH¸NG 11/2020 21 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ Vi khuẩn Xoo nhận biết hoạt hóa biểu gen “nhiễm” hệ gen chủ thông qua vị trí EBE vùng promoter Các EBE thường nằm gần hộp TATA (TATA box) promoter gen đích khu vực cận biên promoter [1, 10, 12, 15, 21, 22] Trong nghiên cứu này, để phân tích đặc điểm trình tự promoter SW13-BT phục vụ mục đích thiết kế gRNA chỉnh sửa EBE và/hoặc bất hoạt gen SW13-BT, đoạn DNA nằm từ vị trí [-632] đến [+8] OsSWEET13 nhân phản ứng PCR với khuôn DNA tổng số tách chiết từ lúa non BT7, sử dụng cặp mồi Sw13-Fw/Sw13Rv giống lúa BT7 phân lập PCR từ DNA tổng số để phân tích trình tự nucleotide nhằm dự đốn vai trị OsSWEET13 tính mẫn cảm với bệnh bạc lúa BT7, đồng thời phục vụ nghiên cứu chỉnh sửa promoter/gen OsSWEET13 sau 3.2 Nhân dòng SW13-BT vào vector pGEM-T Sản phẩm PCR nhân trình tự SW13-BT từ DNA tổng số tinh ghép nối vào vector nhân dịng pGEM-T Vector tái tổ hợp sau kiểm tra phương pháp PCR cắt enzyme giới hạn (Hình A&B) Kết PCR thu sản phẩm khuếch đại có kích thước xấp xỉ 0,64 kb tương ứng với kích thước lí thuyết đoạn trình tự SW13-BT cần phân lập (640 bp) (Hình 1, giếng 2) Như vậy, bước đầu kết luận đoạn DNA mong muốn phân lập thành công từ DNA tổng số lúa BT7 Sản phẩm PCR tinh nhân dòng để phục vụ giải trình tự nucleotide cho nghiên cứu chức OsSWEET13 sau Hình Kiểm tra vector tái tổ hợp pGEM/SW13-BT Sản phẩm PCR cắt giới hạn điện di gel agarose 1 Hình Phân lập SW13-BT từ hệ gen lúa BT7 kĩ thuật PCR Giếng M: thang chuẩn DNA kb (iNtRon); giếng 1: đối chứng âm (không chứa DNA khuôn); giếng 2: sản phẩm PCR Vi khuẩn Xoo gây bệnh lúa nhờ nhóm tác nhân TAL thuộc hệ thống tiết loại III (T3S) hoạt động nhân tố phiên mã hoạt hóa gen “nhiễm” để thúc đẩy mơi trường thuận lợi cho vi khuẩn sinh trưởng chủ Thực nghiệm chứng minh gen thuộc họ gen vận chuyển đường SWEET gen “nhiễm” hỗ trợ trình xâm nhiễm vi khuẩn bạc lá, có OsSWEET13 EBE vùng promoter OsSWEET13 mục tiêu nhiều chủng Xoo châu Á mang PthXo2 [26] Trong nghiên cứu này, đoạn trình tự promoter phần mã hoá OsSWEET13 22 (A) PCR plasmid tái tổ hợp; giếng 1-2: PCR với cặp mồi Sw13-Fw/Sw13-Rv; giếng 3-4: PCR với cặp mồi T7/SP6; giếng 3: khuôn pGEM/SW13BT; giếng 4: đối chứng âm (khơng có DNA khn) (B) Cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp enzym cắt giới hạn; giếng 1: sản phẩm cắt giới hạn EcoRI; giếng 2: vector pGEM/SW13-BT nguyên bản; giếng M: thang chuẩn DNA 100 bp (Thermo Scientific) Kết điện di gel agarose 1 hình cho thấy sản phẩm PCR từ plasmid với cặp mồi Sw13Fw/Sw13-Rv đặc hiệu cho đoạn promoter/gen SW13BT cho băng DNA có kích thước khoảng 0,64 kb (Hình 2A, giếng 1) Tương tự, sản phẩm PCR với cặp mồi T7/SP6 (có khoảng cách 186 bp pGEM-T) đặc hiệu cho vector pGEM-T cho băng DNA có kích thước xấp xỉ 0,82 kb (Hình 2A, giếng 3) Các băng DNA có kích thước phù hợp với kích thước lí thuyết đoạn DNA cần nhân Bên cạnh đó, kết điện di sản phẩm cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp EcoRI (đoạn DNA chèn vào hai vị trí nhận bit ca EcoRI trờn vector pGEM-T) Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 11/2020 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ (Hình 2HìnhB, giếng 1) cho hai băng DNA có kích thước khoảng 3,0 kb tương ứng với khung vector pGEM-T 0,66 kb tương ứng với đoạn DNA chèn SW13-BT tính tốn lí thuyết (Hình 2B, giếng 1) Các kết thu cho phép khẳng định chắn việc nhân dịng thành cơng trình tự SW13-BT vào vector pGEM-T Nhiều nghiên cứu promoter trước thực phân lập nhân dòng đoạn DNA quan tâm vào vector nhân dòng trước đưa vào vector biểu nhằm phục vụ việc nghiên cứu chức [8, 18] Trong nghiên cứu này, đoạn DNA nằm từ vị trí [-632] đến [+8] OsSWEET13 nhân từ DNA tổng số giống lúa BT7 dịng hóa vào vector pGEM-T Sản phẩm nhân dòng nguồn nguyên liệu cho tồn thí nghiệm nghiên cứu đặc điểm chức OsSWEET13 sau 3.3 Phân tích trình tự SW13-BT Đoạn promoter/gen SW13-BT xác định trình tự nucleotide thiết bị giải trình tự nucleotide tự động phân tích phần mềm BioEdit Kết phân tích cho thấy đoạn DNA phân lập từ giống lúa BT7 có chiều dài 640 nucleotide, giống 99,38 92,3 so với trình tự tương ứng giống lúa Japonica Nipponbare (AP014968.1) giống lúa Indica Shuhui498 (CP018168.1) cơng bố GenBank (Hình 3) Trình tự phân lập bao gồm vùng promoter dài 441 bp đoạn dài 199 bp mang trình tự Exon I OsSWEET13 Đoạn SW13-BT phân lập chứa trình tự hộp TATA đặc trưng đặc biệt có chứa trình tự DNA (yếu tố điều hịa cis) tương đồng với trình tự EBE nhận biết protein TAL PthXo2 nhiều chủng vi khuẩn Xoo châu Á [20, 26] Tuy nhiên có sai khác trình tự EBE lúa BT7 so với hai giống lúa tham chiếu (24 Nu so với 25 Nu, thiếu Adenine vị trí thứ 8) (Bảng 1) Hình Phân tích trình tự SW13–BT7 Hộp TATA (TATA box) mã mở đầu (ATG) đóng khung Vị trí PthXo2(A)-EBE Exon I đánh dấu mũi tên Vị trí cắt PthXo2(A)-EBE Exon I đánh số từ 1-5 Nghiên cứu gần Oliva (2019) họ protein TAL PthXo2 bên cạnh thành viên phát đầu tiên, cịn có nhiều biến thể khác PthXo2(A), PthXo2B PthXo2C Theo đó, PthXo2(A) liên kết với trình tự EBE ATAAAAGCACCACAACTCCCTT (lúa IR24) ATATAAGCACCACAACTCCCTT (Zhengshan 97) Trong đó, hai biến thể PthXo2B PthXo2C dự đoán liên kết với EBE (TATAAAGCACCACAACTCCCTTC) promoter OsSWEET13 lúa Nipponbare, Kitaake [20] Kết phân tích trình tự cho thấy SW13-BT có chứa EBE liên kết với biến thể PthXo2(A) (gọi tắt PthXo2(A)-EBE) (Bảng 1) N«ng nghiƯp phát triển nông thôn - K - THáNG 11/2020 23 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ Bảng Trình tự EBE promoter Bắc thơm số giống lúa Giống lúa Vùng trình tự EBE TAL Bắc Thơm TATATAA GCACCACAACTCCCTTC PthXo2(A) Nipponbare TATATAAA GCACCACAACTCCCTTC PthXo2B, PthXo2C Shuhui498 TATATAAA GCACCACAACACCCTTC PthXo2B, PthXo2C IR24 TATATAAAAGCACCACAACTCCCTTC PthXo2(A) Zhengshan 97 TATATAA GCACCACAACTCCCTTC PthXo2(A) Kitaake TATATAAA GCACCACAACTCCCTTC PthXo2B, PthXo2C Ghi chú: Hộp TATA bôi đậm, SNP gạch chân [20] Như vậy, OsSWEET13 mục tiêu quan trọng trình xâm nhiễm vào tế bào lúa BT7 chủng vi khuẩn Xoo mang protein tiết PthXo2(A) Dựa liệu đầy đủ trình tự nucleotide promoter gen mục tiêu BT7, việc sử dụng công nghệ CRISPR/Cas9 gây đột biến vị trí PthXo2(A)-EBE ngăn chặn/giảm độc tính vi khuẩn Xoo giống lúa BT7 Ngoài ra, việc gây đột biến vùng Exon I để bất hoạt (knock-out) hoàn toàn OsSWEET13 hướng nghiên cứu để tạo giống lúa BT7 kháng bạc 3.4 Thiết kế cấu trúc gRNA chỉnh sửa SW13-BT công nghệ CRISPR/CAS9 Hai thành phần hệ thống CRISPR/Cas9 bao gồm (1) protein Cas9 có hoạt tính endonuclease (2) phân tử sgRNA (single guide RNA) có vai trị điều hướng phức hệ protein-RNA CRISPR/Cas9 tới vị trí DNA cần cắt Tính đặc hiệu phức hệ CRISPR/Cas9 định đoạn trình tự dài ~20 nucleotide (gRNA) phân tử sgRNA [4] Để gây đột biến chỉnh sửa SW13-BT hệ thống CRISPR/Cas9, trình tự gRNA thiết kế phần mềm CRISPR-P v2.0 Trình tự đích xác định nằm xung quanh vị trí PthXo2EBE gần mã mở đầu (ATG) Exon I (Hình 3, bảng 2) Điều kiện cần trình tự gRNA định bao gồm (i) đầu 3’ phải nối tiếp với trình tự bảo thủ PAM (NGG), (ii) có độ dài 19 – 22 Nu (iii) vị trí cắt DNA nằm trình tự đích Bằng phần mềm CRISPR-P v2.0, trình tự gRNA chỉnh sửa trình tự đích liên quan tới chế gây bệnh vi khuẩn Xoo vùng promoter OsSWEET13 lúa BT7 thiết kế Kết thu cho thấy 18 trình tự gRNA xác định đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn Trong đó, 11 trình tự gRNA có điểm cắt vị trí PthXo2(A)-EBE, trình tự gRNA có điểm cắt tác động đến Exon I (Bảng 2) Bảng Trình tự gRNA chỉnh sửa SW13-BT Tên gRNA-1 gRNA-2 gRNA-3 gRNA-4 gRNA-5 gRNA-6 gRNA-7 gRNA-8 24 Trình tự gRNA-PAM (5'-3’) Kích TBP CBP IBP DSL thước GC On score Đích tác động* AGAGGAATGAAGGGAGTTG-TGG 19 12 - 45 0,3391 AACTCTTGGAGAGGAATGA-AGG 19 - 40 0,0963 ACTCTTGGAGAGGAATGAA-GGG 19 - 45 0,0812 AAACTCTTGGAGAGGAATGA-AGG 20 - 40 0,0963 AACTCTTGGAGAGGAATGAA-GGG 20 - 40 0,0812 GGAGAGGAATGAAGGGAGTTG-TGG 21 - 50 0,3391 AAAACTCTTGGAGAGGAATGA-AGG 21 - 40 0,0963 AAACTCTTGGAGAGGAATGAA-GGG 21 - 40 0,0812 PthXo2(A)EBE PthXo2(A)EBE PthXo2(A)EBE PthXo2(A)EBE PthXo2(A)EBE PthXo2(A)EBE PthXo2(A)EBE PthXo2(A)EBE N«ng nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 11/2020 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ gRNA-9 gRNA-10 gRNA-11 gRNA-12 gRNA-13 gRNA-14 gRNA-15 gRNA-16 gRNA-17 gRNA-18 TGGAGAGGAATGAAGGGAGTTG-TGG 22 12 SL1 50 GAAAACTCTTGGAGAGGAATGA-AGG 22 11 - 40 AAAACTCTTGGAGAGGAATGAA-GGG 22 - 40 TTTAGCACACAAAAATGGC-TGG CCCTTTTAGCACACAAAAA-TGG CCCCTTTTAGCACACAAAAA-TGG CTTTTAGCACACAAAAATGGC-TGG CCCCCTTTTAGCACACAAAAA-TGG CCTTTTAGCACACAAAAATGGC-TGG CCCCCCTTTTAGCACACAAAAA-TGG 19 19 20 21 21 22 22 7 7 7 7 7 7 0 0 0 - 35 35 40 35 45 35 50 PthXo2(A)EBE PthXo2(A)0,0963 EBE PthXo2(A)0,0812 EBE 0,3391 0,2999 0,1298 0,1933 0,3765 0,1539 0,3004 0,1539 Exon I Exon I Exon I Exon I Exon I Exon I Exon I Ghi chú: ( GC) tỉ lệ phần trăm GC; (TBP) tổng số cặp bazơ; (CBP) số cặp bazơ liên tục; (IBP) số cặp bazơ cấu trúc gRNA; (DSL) vòng loop bị phá vỡ cấu trúc; (SL1) Stem loop 1; (-) không ảnh hưởng đến cấu trúc vòng loop; (PthXo2) EBE promoter SW13-BT; (On score) Điểm dự đoán khả nhận biết vị trí đích (từ 0,00 – 1,00); (*) gRNA số có vị trí cắt PthXo2(A)-EBE Exon I Trình tự PAM in đậm Hình Cấu trúc bậc II gRNA-6 Mơ hình cấu trúc bậc II dự đốn phần mềm Mfold 2.3 mang vùng gRNA (CRISPR RNA) cấu trúc vòng loop: Stem loop RAR (repeat and anti-repeat region), Stem loop Stem loop Để đảm bảo khả trì hoạt tính tính đặc hiệu phức hệ CRISPR/CAS9 nhân tế bào, gRNA phải có hàm lượng GC trình tự gRNA từ 30-80 , có khả hình thành cấu trúc bậc II ổn định (duy trì cầu trúc vịng loop RAR repeat and anti-repeat, SL2 - stem loop SL3 stem loop 3), tổng số cặp bazơ (TBP - total base pairs) < 13, số cặp bazơ liên tục (CBP - consecutive base pairs) < 8, số cặp bazơ bên cấu trúc gRNA (IBP-internal base pairs) < [16] Kết phân tích phần mềm CRISPR-P v2.0 Mfold 2.3 cho thấy có 15/18 gRNA đảm bảo việc hình thành phức hệ CRISPR/CAS9 ổn định có hoạt tính nhân tế bào thực vật (Bảng 2, Hình 4); gRNA có điểm On-score (điểm đánh giá khả hoạt động) mức cao (0,2 - 0,5) 12 gRNA có điểm On-score mức thấp (< 0,2) Đối với đích tác động PthXo2(A)EBE, ba trình tự gRNA-1, gRNA-6 gRNA-9 có điểm On-score (0,3391) có vị trí cắt (1 PthXo2(A)-EBE) (Bảng 2) Tuy nhiên, gRNA-6 có Guanine đầu 5’- yếu tố giúp cấu trúc biểu RNA điều khiển promoter U6 hoạt động hiệu Đối với đích tác động vùng mã mở đầu Exon I, trình tự gRNA-14 gRNA-15 có điểm On-score cao (0,1933 0,3765) tương ứng với vị trí cắt (4Exon I 5Exon I) (Bảng 2) lựa chọn để tiếp tục phân tích Hạn chế lớn hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/CAS9 so với hệ thống chỉnh sửa gen khác (TALEN, ZFN ) tính đặc hiệu gRNA, gRNA nhận biết ~20 nucleotide Cas9 hoạt động dù trình tự DNA đích có vài nucleotide sai khác so với gRNA [4] Nhằm giảm thiểu khả nhận biết sai vị trí (off-target) phức hệ CAS9-gRNA, trình tự gRNA tiếp tục phân tích phần mềm CCTop (http://crispr.cos.uni-heidelberg.de) để tìm đoạn DNA tương đồng với gRNA có hệ gen lúa (http://plants.ensembl.org/) Kết phân tích cho thấy gRNA-6, gRNA-14 v gRNA-15 u cú mt Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 11/2020 25 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ số trình tự DNA tương đồng hệ gen lúa (Bảng Các trình tự DNA tương đồng với gRNA hệ gen lúa Trong tất trình tự tương đồng với gRNA-6 gRNA-15 nằm cách xa vùng mã hóa (Exon) gen chức (Bảng 3); gRNA-14 có trình tự tương đồng nằm Exon gen mã hóa protein nên có khả gây ảnh hưởng đến hoạt động chức tế bào xảy đột biến sai vị trí mong muốn (off-target) Bảng Các trình tự DNA tương đồng với gRNA hệ gen lúa Vị Khoảng cách đến Tên Trình tự DNA tương đồng Mã số gen đích trí Exon gần gRNA-6 AGGGAGGAA[TGAAGGGATTTG] I 492 ENSORLG00000002227 GGAGGGGAA[TGGAGGGACTTG] I 68716 ENSORLG00000025158 GAAGAGGAA[AGAAGGGAGGTG] 67958 ENSORLG00000016115 gRNA- ATTCTTTT[AGCAAACAAAAA] 1902 EPlOSAG00000044882 TGCCATTT[AGCAAACAAAAA] E Os07g0239600 14 CCTGTTTT[AGCACACAAAAG] I 118 Os12g0636000 CTTCTTAT[AGCACACAAAAT] 4839 Os03g0248600 gRNA- CTTTTTTCA[ATCAAAAATGGC] 15608 Os06g0260250 15 CATTTTGCA[AACAAAAACGGC] 1350 EPlOSAG00000035043 TTTTTAATA[CACAAAAATGGT] 232 Os03g0264075 Ghi chú: Chữ ngoặc [] thể trình tự tương đồng với vùng lõi (12 nu) gRNA; chữ in đậm thể vị trí sai khác so với vị trí Nu tương ứng gRNA Như vậy, tổng hợp kết phân tích dự đốn dụng cơng nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 cấu trúc tính đặc hiệu xác định gRNA chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá” (2017-2020), sử dụng cho nghiên cứu gây đột biến chỉnh thuộc Chương trình Cơng nghệ sinh học Nông sửa SW13-BT theo chế ghép nối điểm cuối không nghiệp - Thủy sản Bộ Nông nghiệp PTNT tương đồng (Non-homologous end joining) [19, 24] Chúng xin trân trọng cảm ơn hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 [4], bao gồm gRNA-6 chỉnh sửa PthXo2(A)-EBE gRNA-15 gây đột biến bất hoạt hoàn toàn OsSWEET13 BT7 Kết nghiên cứu sở cho nghiên cứu chức OsSWEET13 sau này, đồng thời phục vụ mục tiêu tạo dịng lúa BT7 kháng bệnh bạc cơng nghệ chỉnh sửa gen KẾT LUẬN Promoter/gen SW13-BT liên quan đến trình xâm nhiễm vi khuẩn bạc Xoo giống lúa BT7 phân lập giải trình tự đầy đủ Vùng trình tự phân lập chứa PthXo2(A)-EBE phần Exon I chọn để thiết kế cấu trúc gRNA phục vụ nghiên cứu chỉnh sửa promoter/gen SW13-BT công nghệ CRISPR/CAS9 Kết nghiên cứu góp phần làm phong phú liệu ngân hàng gen lúa Việt Nam đồng thời đặt móng cho định hướng tăng cường khả kháng bệnh bạc giống lúa chủ lực BT7 công nghệ chỉnh sửa hệ gen LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu hỗ trợ kinh phí từ đề tài “Ứng 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO Antony G., Zhou J., Huang S., Li T., Liu B., White F., Yang B (2010) Rice xa13 recessive resistance to bacterial blight is defeated by induction of the disease susceptibility gene Os11N3 Plant Cell, 22(11):3864-76 Blanvillain-Baufumé S., Reschke M., Solé M., Auguy F., Doucoure H., Szurek B., Meynard D., Portefaix M., Cunnac S., Guiderdoni E., Boch J., Koebnik R (2017) Targeted promoter editing for rice resistance to Xanthomonas oryzae pv oryzae reveals differential activities for SWEET14-inducing TAL effectors Plant Biotechnol J., 15(3):306-317 Boch J., Bonas U (2010) Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function Annu Rev Phytopathol., 48:419-36 Bortesi L., Fischer R (2015) The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond Biotechnol Adv., 33(1):41-52 Chen L Q., Hou B H., Lalonde S., Takanaga H., Hartung M., Qu X Q., Guo W J., Kim J G., Underwood W., Chaudhuri B., Chermak D., Antony Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 11/2020 KHOA HC CÔNG NGHỆ G., White F., Somerville S., Mudgett M B and Frommer W (2010) Sugar transporters for intercellular exchange and nutrition of pathogens Nature, 468: 527-532 Chen L Q., Qu X Q., Hou B H., Sosso D., Osorio S., Fernie A R., Frommer W B (2012) Sucrose efflux mediated by SWEET proteins as a key step for phloem transport Science, 335(6065):207-11 Cheng Q., Mao W., Xie W., Liu Q., Cao J., Yuan M., Zhang Q., Li X and Wang S (2017) Characterization of a disease susceptibility locus for exploring an efficient way to improve rice resistance against bacterial blight Sci China Life Sci., 60(3): 298-306 Chu Z., Yuan M., Yao J., Ge X., Yuan B., Xu C., Li X., Fu B., Li Z., Bennetzen J L., Zhang Q., Wang S (2006) Promoter mutations of an essential gene for pollen development result in disease resistance in rice Genes Dev., 20(10):1250-5 Doyle J J and Doyle J L (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue Focus, 12: 13-15 10 Grau J., Wolf A., Reschke M., Bonas U., Posch S., Boch J (2013) Computational predictions provide insights into the biology of TAL effector target sites PLoS Comput Biol., 9(3):e1002962 11 Huang S., Antony G., Li T., Liu B., Obasa K., Yang B., White F F (2016) The broadly effective recessive resistance gene xa5 of rice is a virulence effector-dependent quantitative trait for bacterial blight Plant J., 86(2):186-94 12 Hummel AW., Doyle EL., Bogdanove AJ (2012) Addition of transcription activator-like effector binding sites to a pathogen strain-specific rice bacterial blight resistance gene makes it effective against additional strains and against bacterial leaf streak New Phytol., 195(4):883–893 13 Hutin M., Sabot F., Ghesquière A., Koebnik R., Szurek B (2015) A knowledge-based molecular screen uncovers a broad spectrum OsSWEET13 resistance allele to bacterial blight from wild rice Plant J., 84(4):694-703 14 Jha G., Ramanan R and Sonti R (2007) Functional Interplay Between Two Xanthomonas oryzae pv oryzae Secretion Systems in Modulating on Rice Molecular interactions: MPMI, 20: 31-40 Virulence plant-microbe 15 Kay S., Hahn S., Marois E., Wieduwild R., Bonas U (2009) Detailed analysis of the DNA recognition motifs of the Xanthomonas type III effectors AvrBs3 and AvrBs3Deltarep16 Plant J., 59(6):859–871 16 Liang G., Zhang H., Lou D., Yu D (2016) Selection of highly efficient scrRNAs for CRISPR/Cas9-based plant genome editing Sci Rep., 6:21451 17 Mew T W (1987) Current Status and Future Prospects of Research on Bacterial Blight of Rice Annual Review of Phytopathology, 25(1): 359382 18 Nakashima K., Jan A., Todaka D., Maruyama K., Goto S., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2014) Comparative functional analysis of six drought responsive promoters in transgenic rice Planta, 239(1):47-60 19 Nekrasov V., Staskawicz B., Weigel D., Jones J.D., Kamoun S (2013) Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNAguided endonuclease Nat Biotechnol., 31(8):691693 20 Oliva R., Ji C., Atienza-Grande G., HuguetTapia J C And Perez-Quintero A (2019) Broadspectrum resistance to bacterial blight in rice using genome editing 37(11): 1344-1350 21 Römer P., Recht S., Lahaye T (2009) A single plant resistance gene promoter engineered to recognize multiple TAL effectors from disparate pathogens Proc Natl Acad Sci USA., 106(48):20526–20531 22 Römer P., Strauss T., Hahn S., Scholze H., Morbitzer R., Grau J., Bonas U., Lahaye T ( 2009) Recognition of AvrBs3-like proteins is mediated by specific binding to promoters of matching pepper Bs3 alleles Plant Physiol 150(4):1697–1712 23 Sambrook J., Russel D W (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY 24 Shen B., Zhang W., Zhang J., Zhou J., Wang J., Chen L., Wang L., Hodgkins A., Iyer V., Huang X., Skarnes W C (2014) Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 11/2020 27 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ effects Nat Methods, 11(4):399-402 25 Smith L M., Sanders J Z., Kaiser R J., Hughes P., Dodd C., Connell C R., Heiner C., Kent S B., Hood L E (1986) Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis Nature, 321(6071):674-679 26 Streubel J., Pesce C., Hutin M., Koebnik R., Boch J., Szurek B (2013) Five phylogenetically close rice SWEET genes confer TAL effector- mediated susceptibility to Xanthomonas oryzae pv oryzae New Phytol., 200:808-81 27 Zhou J., Peng Z., Long J., Sosso D., Liu B., Eom J.-S., Huang S., Liu S., Cruz C., Frommer W., White F and Yang B (2015) Gene targeting by the TAL effector PthXo2 reveals cryptic resistance gene for bacterial blight of rice The Plant journal : for cell and molecular biology 82 DESIGNING gRNA FOR EDITING PROMOTER OsSWEET13 RELATED TO BACTERIAL LEAF BLIGHT DISEASE IN BT7 RICE VARIETY Phung Thi Thu Huong, Tran Thi Thanh Huyen, Pham Phuong Ngoc, Cao Le Quyen, Pham Xuan Hoi, Nguyen Duy Phuong* Summary Bacteria leaf blight (BLB) caused by Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) is one of the most serious diseases in rice Bac thom (BT7) rice variety is a major rice cultivars in the Northern region of Vietnam, but it is susceptible to BLB OsSWEET13 is a member of the OsSWEET family - which encodes the saccrose transport protein, it is involved in the infection mechanism of BLB in plants In this study, the OsSWEET13 promoter was isolated from the total DNA of BT7 rice variety The results showed that the isolated DNA sequence has size of 640 bp, with the similarity of 99.38 and 92.3 for the published sequence of OsSWEET13 (AP014968.1) and (CP018168.1) respectively, contains a effector binding element (EBE) that reconized by PthXo2 - the type III secretory transcription activator-like (TAL) proteins of the Xoo Based on the isolated DNA sequence, two gRNAs (guide RNA) was designed to edit the EBE sequence on the OsSWEET13 promoter and knockouting the OsSWEET14 gene using CRISPR/CAS9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9) system aims to generate high-yielding rice varieties resistant to BLB in future Keywords: Bacterial leaf blight, CRISPR/CAS9, OsSWEET13, TAL effector, Xanthomonas oryzae, Gene editing Người phản biện: PGS.TS Lã Tuấn Nghĩa Ngày nhận bài: 16/6/2020 Ngày thông qua phản biện: 16/7/2020 Ngày duyệt đăng: 23/7/2020 28 Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 11/2020 ... dòng lúa BT7 kháng bệnh bạc công nghệ chỉnh sửa gen KẾT LUẬN Promoter/gen SW13-BT liên quan đến trình xâm nhiễm vi khuẩn bạc Xoo giống lúa BT7 phân lập giải trình tự đầy đủ Vùng trình tự phân lập. .. PthXo2(A)-EBE, trình tự gRNA có điểm cắt tác động đến Exon I (Bảng 2) Bảng Trình tự gRNA chỉnh sửa SW13-BT Tên gRNA- 1 gRNA- 2 gRNA- 3 gRNA- 4 gRNA- 5 gRNA- 6 gRNA- 7 gRNA- 8 24 Trình tự gRNA- PAM (5'-3’) Kích... này, tiến hành phân lập phân tích đoạn trình tự promoter/gen OsSWEET13 lúa Bắc thơm (gọi tắt SW13BT) mẫn cảm với bệnh bạc nhằm thiết kế gRNA cho hệ thống chỉnh sửa promoter/gen SW13BT Kết thu tiền