Tài liệu Một số vấn đề về di truyền học (tổng hợp & sử dụng) pdf

Một số vấn đề về di truyền học (tổng hợp & sử dụng) Một số vấn đề về di truyền học (tổng hợp & sử dụng) V.1.5. Tổng hợp hóa học và sử dụng các đoạn oligonucleotit Các đoạn ADN có trình tự xác định kích thước ngắn được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu khác nhau của di truyền học phân tử, chẳng hạn như sử dụng làm mồi trong các phản ứng PCR, hay dùng làm mẫu dò trong các phương pháp lai phân tử. Các đoạn trình tự này thường được tổng hợp theo phương pháp hóa học và được gọi là các đoạn oligonucleotit. Phương pháp hóa học được sử dụng phổ biến nhất được tiến hành trên bề mặt cứng sử dụng máy tự động. Tiền chất để tạo nên các nucleotit lần lượt gắn với đoạn oligonucleotit theo trật tự nhất định được gọi là các hợp chất phosphoamidine (xem hình minh họa ). Phản ứng kéo dài chuỗi oligonucleotit diễn ra bằng việc gắn thêm tiền chất nucleotit mới vào phía đầu 5’, như vậy ngược chiều với phản ứng kéo dài chuỗi ADN sử dụng enzym ADN polymerase. Phương pháp tổng hợp hóa học có hiệu quả và độ chính xác cao khi tiến hành tổng hợp các phân tử ADN mạch đơn có độ dài tới 30 nucleotit. Với các thiết bị tổng hợp oligonucleotit hiện nay, một người nghiên cứu có thể dễ dàng tổng hợp bất cứ một trình tự ADN ngắn nào đơn giản bằng cách gõ và nhập trình tự nucleotit mong muốn vào phần mềm máy tính điều khiển máy tổng hợp tự động. Tuy vậy, khi phân tử ADN được tổng hợp có kích thước lớn thì độ chính xác của trình tự và độ đồng đều của sản phẩm tạo thành giảm đi do các lỗi cố hữu mang tính kỹ thuật. Thực tế, các phân tử ADN có trình tự dài hơn 100 nucleotit khó có thể được tổng hợp bằng các phương pháp hóa học mà đảm bảo được số lượng và chất lượng mong muốn. Các đoạn oligonucleotit kích thước ngắn ngoài các ứng dụng làm mồi phản ứng PCR hay làm mẫu dò như được nêu ở trên, còn có thể được sử dụng cho nhiều mục đích khác trong nghiên cứu di truyền học phân tử. Chẳng hạn như các đoạn oligonucleotit kết cặp sai với một đoạn ADN được tách dòng có thể được dùng để tạo ra một đột biến định vị trí. Phương pháp này, gọi là phương pháp gây đột biến định vị trí, được thực hiện như sau: một trình tự nucleotit nhất định được tiến hành lai với một phân đoạn ADN, ở đây đoạn oligonucleotit được sử dụng làm mồi còn phân đoạn ADN đích được dùng làm khuôn. Trong đoạn ADN sợi kép hình thành sẽ có một vị trí kết cặp sai, và theo nguyên tắc PCR, các phân đoạn ADN được tạo ra trong các phản ứng về sau đều mang đột biến tại vị trí kết cặp sai. Các đoạn oligonucleotit cũng có thể được sử dụng theo cách tương tự như vậy để tạo nên một điểm cắt giới hạn mới trong một phân tử ADN, để rồi sau đó điểm cắt giới hạn này được sử dụng để cài đoạn ADN đích vào giữa một trình tự mã hóa và một trình tự không mã hóa, hoặc sau một trình tự promoter hay vị trí gắn của ribosom, v.v Như vậy, rõ ràng trong các nghiên cứu di truyền học phân tử, việc các đoạn oligonucleotit có thể được tổng hợp theo một trình tự bất kỳ có nhiều ý nghĩa ứng dụng quan trọng trong việc xác định và khuếch đại các đoạn ADN đặc hiệu, để giải mã trình tự ADN, cũng như trong các nghiên cứu tạo đột biến điểm xác định vị trí, hay sử dụng cho công nghệ ADN tái tổ hợp. V.1.6. Phản ứng PCR Ngoài các kỹ thuật tách dòng và khuếch đại gen sử dụng các loại tế bào chủ, một phương pháp khuếch đại gen có hiệu quả cao giờ đây đã trở thành một kỹ thuật phổ biến trong hầu hết các nghiên cứu di truyền học phân tử là kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp PCR (polymerase chain reaction). Đây là một kỹ thuật hóa sinh invitro thuần túy. Kỹ thuật PCR sử dụng enzym ADN polymerase để tổng hợp nên các phân tử ADN mới từ trình tự của phân tử ADN làm khuôn với tiền chất là các deoxyribonucleotit. Các enzym ADN polymerase tổng hợp ADN theo chiều 5’® 3’ và có thể xúc tác gắn nucleotit tiếp theo vào phía đầu 3’ của một trình tự oligonucleotit có sẵn. Nghĩa là, nếu ta có một đoạn trình tự oligonucleotit đã gắn vào một mạch ADN làm khuôn có trình tự bổ sung với trình tự của đoạn oligonucleotit, thì enzym ADN polymerase có thể sử dụng đoạn oligonucleotit đó làm đoạn mồi và tiếp tục kéo dài chuỗi ADN về phía đầu 3’ dựa trên trình tự của mạch ADN làm khuôn. Vậy, bằng cách nào người ta có thể sử dụng phản ứng PCR và enzym ADN polymerase để khuếch đại một đoạn trình tự ADN đặc hiệu ? Người ta sẽ tổng hợp và sử dụng hai đoạn oligonuleotit. Đoạn thứ nhất có trình tự bổ sung với đầu 5’ của một mạch phân đoạn ADN cần khuếch đại (đoạn này gọi là mồi xuôi), còn đoạn trình tự thứ hai bổ sung với đầu 5’ của mạch đối diện (mồi ngược). Phân tử ADN làm khuôn sẽ được làm biến tính (bởi nhiệt) và các mồi xuôi và môi ngược sẽ gắn vào trình tự bổ sung ở hai đầu đoạn ADN cần khuếch đại. Với sự có mặt của các cơ chất là các deoxyribonucleotit, enzym ADN polymerase sẽ tổng hợp và kéo dài một mạch phân tử ADN bắt đầu từ hai đoạn mồi. Trong chu kỳ tiếp theo, phân tử ADN lại được gây biến tính và quá trình tổng hợp ADN được lặp lại với cùng cặp mồi. Kết quả của chu kỳ thứ hai tạo ra 4 bản sao của phân đoạn gen mong muốn. Theo cơ chế đó, chu kỳ biến tính và tổng hợp ADN diễn ra lặp đi lặp lại sẽ làm khuếch đại phân đoạn ADN nằm giữa 2 trình tự mồi theo cấp số nhân (số bản sao tương ứng qua các chu kỳ sẽ lần lượt là 2, 4, 8, 16, 32, 64, v.v.). Như vậy, chỉ cần từ [...].. .một bản sao ADN duy nhất có mặt trong một lượng mẫu nhỏ, chúng ta có thể thu được một lượng lớn bản sao xuất phát từ bản sao đầu tiên Xét về một khía cạnh nào đó, kỹ thuật tách dòng ADN và PCR đều được dùng để khuếch đại một phân đoạn ADN đặc thù lên một số lượng lớn Nhưng điểm khác biệt là ở chỗ, trong kỹ thuật tách dòng, chúng ta thường sử dụng một hóa chất chọn lọc hay một thiết bị... ADN hệ gen được dùng để tạo nên một thư viện các đoạn ADN ngắn nhằm giải mã trình tự ngẫu nhiên, thì chính ADN hệ gen đó đồng thời được dùng để tạo nên các đoạn ADN tái tổ hợp mang các đoạn có kích thước lớn, thường có kích thước 3 - 100 kb Giả sử chúng ta có một mẫu ADN từ một NST người Một phần của mẫu này được dùng để tạo nên các phân đoạn có kích thước 1 kb, trong khi một phần khác được dùng để tạo... để có thể khẳng định sự chính xác là 100% Một tỉ lệ khoảng 3/4 số gen có thể được xác định bằng phương pháp này, nhưng cũng có rất nhiều gen bị bỏ sót; và thậm chí chi tiết hơn trong một gen, một số trình tự exon cũng có thể bị bỏ sót Một hạn chế đáng kể nữa của các chương trình tìm gen hiện nay là đôi khi không xác định được đầy đủ các promoter Ví dụ như một promoter lõi điển hình ở động vật đa bào... chỉ chiếm 0,0004% của mỗi NST Kết quả là để có thể xác định được trình tự đầy đủ của một NST, người ta cần tạo ra một số lượng lớn các dữ liệu trình tự từ nhiều phân đoạn ADN ngắn (hình A) Các phân đoạn ADN nhỏ được tạo ra từ 23 NST của hệ gen người, rồi sau đó được cắt ngắn thành một thư viện các đoạn ADN nhỏ bằng một kỹ thuật ”kim áp lực” Thông thường, có 2 hoặc 3 thư viện hệ gen chứa các đoạn trình... Tuy vậy, với việc sử dụng hệ thống một trăm máy giải mã trình tự tự động gồm 384 cột sẽ cho phép phân tích 10 lần một nhiễm sắc thể người chi tiết trong vòng 3 tuần Phương pháp này vì vậy vẫn nhanh hơn nhiều phương pháp phân lập từng phần đã biết trong NST, rồi sau đó giải mã trình tự một tập hợp đã biết của các đoạn ADN được đặt so le Vì vậy, bản chất của công nghệ cốt lõi được sử dụng để thúc đẩy... nucleotit tương ứng (ví dụ như G) nằm trên phân tử ADN Các phân đoạn khác biệt về chiều dài như vậy có thể phân tách được nhờ sử dụng kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamid Chẳng hạn khi chạy hỗn hợp các phân tử ADN tận cùng đầu G ta sẽ thu được thang các băng điện di tương ứng với các phân đoạn, trong đó mỗi băng tương ứng với một phân đoạn có chiều dài phản ánh vị trí của nucleotit G trên phân tử ADN... khác nhau, một mang các đoạn cài kích thước ngắn, còn thư viện kia là các đoạn cài kích thước lớn (hình A) Tiếp theo, người ta sử dụng các đoạn mồi “đa năng” (có tính chọn lọc thấp) có thể gắn vào phần đoạn nối giữa plasmit và hai vùng biên của đoạn ADN cài kích thước lớn Mỗi một phản ứng giải mã trình tự cho phép tạo ra thông tin về trình tự của một đoạn kích thước khoảng 600 bp ở hai đầu của một đoạn... của một đoạn cài bất kỳ Một bản ghi nhớ sẽ ghi chép lại các trình tự ở hai đầu của cùng một phân đoạn kích thước lớn Việc dùng phần mềm sau đó cho thấy một trình tự được tìm thấy ở contig A, còn trình tự kia được tìm thấy ở contig B Nếu contig A và B cùng có các trình tự có mặt trong một phân đoạn kích thước khoảng 5 kb thì có thể giả thiết chúng cùng xuất xứ từ một vùng của một NST Trong khi đó hầu... người ta phải sử dụng một loạt” các công cụ tin sinh học để xác định được các gen và thành phần di truyền của các hệ gen phức tạp Các chương trình máy tính đã được lập trình để có thể xác định được các vùng có tiềm năng mã hóa protein dựa trên một số tiêu chí nhất định, bao gồm sự xuất hiện của các ORF được chặn bởi các vị trí cắt ở hai đầu và gần kề một trình tự khởi đầu phiên mã (promoter) Tuy vậy,... nhiên) Các khuẩn lạc mang các véctơ tơ tái tổ hợp mang đoạn ADN cài ngẫu nhiên được phân lập, xử lý và giải mã trình tự Để chắc chắn rằng mọi nucleotit trong hệ gen vi khuẩn đều có mặt trong các dòng vi khuẩn của thư viện hệ gen, tổng cộng có khoảng 30.000 40.000 dòng tái tổ hợp khác nhau được sử dụng và giải mã trình tự Từ đó, tạo ra khoảng 20 Mb dữ liệu thô về hệ gen (các phản ứng tạo ra trình tự có . Một số vấn đề về di truyền học (tổng hợp & sử dụng) Một số vấn đề về di truyền học (tổng hợp & sử dụng) V.1.5. Tổng hợp hóa học và sử dụng. một kỹ thuật phổ biến trong hầu hết các nghiên cứu di truyền học phân tử là kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp PCR (polymerase chain reaction). Đây là một