Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Xác định thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens

Mục tiêu nghiên cứu của Luận văn nhằm thu nhận và đánh giá sơ bộ cấu trúc của polysaccharide sulfate từ hải sâm S. horrens, làm cơ sở để tiến hành các nghiên cứu về hoạt tính sinh học, đánh giá mối liên hệ giữa hoạt tính và cấu trúc, từ đó định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng PS từ loài hải sâm này tại Việt Nam. Mời các bạn cùng tham khảo!

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Dương Khánh Minh

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE

TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Nha Trang - 2020

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Dương Khánh Minh

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE

TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS

Chuyên ngành: Hóa Phân Tích

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng

dẫn của TS Phạm Đức Thịnh, cùng sự giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu

công tác tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang; Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên

Khánh Hòa, ngày tháng năm

Tác giả

Dương Khánh Minh

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Đức Thịnh - Phó Viện trưởng, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm, kiến thức quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang và Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học và luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Học viện Khoa học và Công nghệ đã tận tình giảng dạy, truyền đạt, trang bị cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập

Và cuối cùng tôi xin dành lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn đồng hành, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Luận văn này được hỗ trợ kinh phí từ đề tài mã số 106.02-2019.34 Tôi xin chân thành cám ơn

Khánh Hòa, ngày tháng năm

Học viên

Kí hiệu Tiếng Anh Tên đầy đủ

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

GC-FID Gas Chromatography – Flame

Ionization Detector

Sắc kí khí – đầu dò ion hóa ngọn lửa

NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân

(CHTHN)

13C-NMR Carbon-13 NMR Spectroscopy Phổ CHTHN carbon 13

1H-NMR Proton NMR Spectroscopy Phổ CHTHN proton

EtOH Ethanol

TCA Triclorua acetic acid

TFA Triflorua acetic acid

Cetavlon Hexadecyl trimethyl ammonium

bromide DEAE –

Macro prep Diethylaminoethyl - Macro prep

Bảng 1.1 Hàm lượng protein và lipid trong hải sâm tại một số vùng biển trên

thế giới 9

Bảng 1.2 Thành phần monosaccharide và nhóm sulfate của FCS từ một số

loài hải sâm 14

Bảng 1.3 Các dạng sulfate hóa của các đơn vị phân nhánh của FCS từ các

loài hải sâm khác nhau 20

Bảng 2.1 Các đỉnh phổ, vùng phổ đặc trưng của fucoidan xuất hiện trên

Hình 1.1 Hình thái chung bên ngoài c ủa hải sâm 8

Hình 1.2 H ải sâm Stichopus horrens,Selenka,1867 .11

Hình 1.3 C ấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Stichopus horrens .15

Hình 1.4 C ấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Stichopus japonicus, Kariya

và cộng sự .16

Hình 1.5 C ấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Stichopus japonicus, Long Yu

và cộng sự 16

Hình 1.6 C ấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Isostichopus badionotus 17

Hình 1.7 C ấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Ludwigothurea grisea … 18

Hình 1.8 C ấu trúc của fucosylate chondroitin sulfate 19

Hình 1.9 C ấu trúc của một đơn vị trong chuỗi fucosylated chondroitin

sulfate…… 19

Hình 1.10 C ấu trúc đặc trưng của fucosylated chondroitin sulfate ở một số loài hải sâm được nghiên cứu của nhiều tác giả (a) β-D-glucuronic acid, (GlcA) (b) N-acetyl- β-D-galactosamine, (GalNAc) (c) mạch nhánh fucose, α-L-fucose… 21

Hình 2.1 Nguyên li ệu hải sâm Stichopus horrens 29

Hình 2.2 Quy trình chi ết tách thu polysaccharide sulfate dạng thô từ hải sâm Stichopus horrens 33

Hình 2.3 Quy trình tinh s ạch polysaccharide sulfate bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi anion trên nhựa DEAE Macro-prep 35

Hình 3.1 Tách phân đoạn PS từ hải sâm Stichopus horrens bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 47

Hình 3.2 S ắc ký đồ IC thu được của dung dịch chuẩn của các đường đơn 50

Hình 3.3 S ắc ký đồ IC của thành phần đường đơn phân đoạn F1 51

Hình 3.4 S ắc ký đồ IC của thành phần đường đơn phân đoạn F2 51

sâm Stichopus horrens 54

Hình 3.6 Ph ổ 1 H-NMR các phân đoạn F1 (A) và F2 (B) của PS ở hải sâm Stichopus horrens 57

Hình 3.7 C ấu trúc của phân đoạn F1 (FCS1) của PS ở hải sâm Stichopus horrens 58

Hình 3.8.Ph ổ 13 C-NMR phân đoạn F2 của PS ở hải sâm Stichopus horrens.59

Hình 3.9 C ấu trúc của phân đoạn F2 (FS2) của PS ở hải sâm Stichopus horrens 59

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 4

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI: 4

2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI: 5

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU: 6

3.1 Đối tượng nghiên cứu: 6

3.2 Phạm vi nghiên cứu: 6

4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 6

5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 6

5.1 Ý nghĩa khoa học: 6

5.2 Ý nghĩa thực tiễn: 6

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 7

1.1 GIỚI THIỆU VỀ HẢI SÂM 7

1.1.1 Giới thiệu chung về hải sâm 7

1.1.2 Hải sâm Stichopus horrens 10

1.1.2.1 Phân loại 10

1.1.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh sản 11

1.1.2.3 Phân bố và môi trường sống 12

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM 12

1.2.1 Thành phần hóa học của polysaccharide sulfate từ hải sâm 12

1.2.2 Thành phần đa dạng trong cấu trúc của polysaccharide sulfate từ hải sâm 15

1.2.2.1 Các nghiên cứu về thành phần Fucan sulfate 15

1.2.2.2 Các nghiên cứu về thành phần Fucosylate chondroitin sulfate 18 1.2.3 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của polysaccharide sulfate hải sâm 22

1.2.3.1 Hoạt tính chống đông tụ máu và hình thành huyết khối của FCS 22

1.2.3.2 Hoạt tính gây ức chế sự tổn thương mô 23

1.2.3.3 Hoạt tính kháng sự xâm nhập của vi sinh vật ngoại lai 23

1.2.3.4 Hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào 24

1.2.3.5 Hoạt tính kháng ung thư và kháng viêm 24

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, HƯỚNG PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI 25

CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 29

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 29

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 29

2.1.2 Thiết bị - Dụng cụ - Hóa chất 30

2.1.2.1 Thiết bị 30

2.1.2.2 Dụng cụ 30

2.1.2.3 Hóa chất 30

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.2.1 Phương pháp chiết tách và phân đoạn polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens 31

2.2.1.1 Phương pháp chiết tách 31

2.2.1.2 Phương pháp tách phân đoạn 34

2.2.2 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của polysaccharide sulfate 36

2.2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng tổng carbohydrate 36

2.2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng sulfate 36

2.2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng uronic acid 36

2.2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein 37

2.2.2.5 Phương pháp xác định thành phần đường đơn monosaccharide 37

2.2.3 Các phương pháp phân tích phổ về cấu trúc của polysaccharide sulfate 38

2.2.3.1 Phương pháp phổ hồng ngoại IR 38

2.2.3.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 40

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 TÁCH CHIẾT POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE DẠNG THÔ 42

3.1.1 Tách chiết polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens 42

3.1.2 Thành phần hóa học của polysaccharide sulfate dạng thô từ hải sâm Stichopus horrens 44

3.2 QUÁ TRÌNH TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN ĐOẠN THU ĐƯỢC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS 46

3.2.1 Tách phân đoạn polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens 46

3.2.2 Thành phần hóa học các phân đoạn thu được của polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens 48

3.3 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE CÓ NGUỒN GỐC TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS 53

3.3.1 Phổ hồng ngoại IR 53

3.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 55

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

4.1 KẾT LUẬN 61

4.2 KIẾN NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC 75

MỞ ĐẦU

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI:

Trong cuộc sống hiện nay, sức khỏe là một trong những mối quan tâm hàng đầu; do đó, nhiều người có xu hướng lựa chọn sử dụng các thực phẩm có nguồn gốc hữu cơ Bên cạnh đó, các loại thực phẩm chức năng (TPCN) - là những thực phẩm không chỉ chứa các chất dinh dưỡng mà còn chứa nhiều chất

có hoạt tính sinh học như chống oxy hóa, kháng viêm,… được chiết tách, phân lập từ các loài thực vật, động vật (như Curcumin được chiết xuất từ củ nghệ tươi, Resveratrol có trong nho và quả mọng, polysaccharide từ các loài sinh vật biển,…) cũng ngày càng được nhiều người quan tâm, sử dụng nhằm hỗ trợ tăng sức đề kháng, giảm bớt các nguy cơ gây bệnh

Sinh vật biển là một trong những đối tượng tiềm năng để thu nhận các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Nhiều sản phẩm từ các hợp chất thu nhận từ sinh vật biển đã được thương mại hóa như Seavie hải sâm (gồm acid amin, nguyên tố vi lượng, hoạt chất holothurin B từ hải sâm…), fucoidan từ rong nâu, Các loài động vật, thực vật biển rất giàu carbohydrate và chủ yếu ở dạng polysaccharide sulfate (PS) [1] Các nghiên cứu về PS từ sinh vật biển đã chứng minh hợp chất này sở hữu một phổ rộng về các hoạt tính sinh học có lợi như: chống tạo mạch, kháng u, chống đông máu, kháng viêm, chống tăng huyết

áp, chống huyết khối, qua đó cho thấy tiềm năng ứng dụng cao của hợp chất này trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, dược phẩm

và mỹ phẩm [2, 3] Trong số các sinh vật biển, hải sâm là một trong những loài

có giá trị kinh tế cao, không chỉ là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng với các vitamin và khoáng chất, nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra ở hải sâm còn có nhiều hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học như peptide, acid béo, nortriterpene/triterpene glycoside và đặc biệt là PS [4, 5, 6] PS từ hải sâm sở hữu nhiều hoạt tính sinh học quý như chống đông tụ máu, kháng viêm, kháng

u, chống oxy hóa, chống ung thư… đã được chứng minh Về mặt cấu trúc, các polysaccharide sulfate từ hải sâm có thành phần hóa học và cấu trúc rất đa dạng, phức tạp đặc biệt là cấu tạo của các mạch nhánh [7], từ đó dẫn đến sự khác nhau

về hoạt tính sinh học ở các polysaccharide sulfate từ các loài hải sâm

Các polysaccharide sulfate ở hải sâm thuộc 2 nhóm chính là Fucosylated Chondroitin Sulfate (FCS), là một polymer có mạch nhánh, cấu trúc được tạo nên bởi các đơn vị lặp của disaccharide (1→3)-β-D-GalNAc-(1→4)-β-D-Gluc-(1→n), có cấu trúc khác so với các PS được phân lập từ các động vật không xương sống và động vật có xương sống khác, hay từ các loài tảo biển; nhóm thứ hai có thành phần chủ yếu là các gốc đường fucose và các nhóm sulfate, được gọi là Fucan Sulfate (FS) [8], FS từ mỗi loài hải sâm có sự khác biệt chủ yếu về mật độ và vị trí của các nhóm sulfate trong gốc đường fucose [9]

Hiện nay, ở Việt Nam các nghiên cứu về những hợp chất có hoạt tính sinh học từ hải sâm cũng đã và đang được tiến hành tại Viện Hóa sinh Biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), tuy nhiên, chủ yếu tập trung vào hợp chất tryterpene glycoside Đối với hợp chất PS, cho đến nay mới chỉ

có công bố chính thức về hợp chất này từ 3 loài Holothuria spinifera, Stichopus

variegatus và Holothuria atra trong số gần 70 loài hải sâm đã được xác định trong vùng biển Việt Nam Trong số các loài hải sâm tại Việt Nam, Stichopus

horrens là một trong số các loài có trữ lượng tự nhiên lớn, phân bố tại nhiều vùng biển bao gồm cả Nha Trang và đây là lợi thế về nguồn nguyên liệu để tiến hành nghiên cứu về PS Do đó, trong phạm vi nghiên cứu này, tôi tiến hành

thực hiện đề tài “Xác định thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của

polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens” nhằm thu nhận, nghiên

cứu các đặc điểm cơ bản về cấu trúc của PS ở loài Stichopus horrens tại vùng

biển Nha Trang, từ đó định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng PS từ loài hải sâm này, cũng như làm cơ sở để tiến hành những nghiên cứu về PS từ những loài hải sâm khác tại Việt Nam

2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI:

Thu nhận và đánh giá sơ bộ cấu trúc của polysaccharide sulfate từ hải

sâm S horrens, làm cơ sở để tiến hành các nghiên cứu về hoạt tính sinh học,

đánh giá mối liên hệ giữa hoạt tính và cấu trúc, từ đó định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng PS từ loài hải sâm này tại Việt Nam

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU:

3.1 Đối tượng nghiên cứu:

Polysaccharide sulfate chiết tách từ hải sâm S horrens

3.2 Phạm vi nghiên cứu:

Hải sâm S horrens thu ở vùng biển Nha trang, Khánh Hòa vào tháng

12/2019

4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

- Chiết tách và thu nhận polysaccharide sulfate (PS) từ hải sâm S

horrens.

- Tinh chế PS bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion trên nhựa DEAE prep

Macro Xác định thành phần hóa học cơ bản của các phân đoạn PS ở hải sâm

S horrens (tổng carbohydrate, hàm lượng sulfate, hàm lượng uronic acid, hàm lượng protein, thành phần đường đơn)

- Xác định một số đặc điểm cấu trúc của các phân đoạn PS ở loài hải sâm

Kết quả nghiên cứu được dùng làm cơ sở để tiến hành các nghiên cứu

sâu hơn về cấu trúc và hoạt tính sinh học của PS chiết tách từ loài hải sâm S

horrens, từ đó định hướng ứng dụng hợp chất này vào lĩnh vực y dược hay làm thực phẩm chức năng sử dụng cho con người

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ HẢI SÂM

1.1.1 Giới thiệu chung về hải sâm

Hải sâm là nhóm sinh vật biển, rất phong phú và đa dạng các loài, sinh sống ở tầng đáy, thuộc ngành da gai (Echinodermata), lớp hải sâm

(Holothuroidea) Tên thông dụng của hải sâm là dưa chuột biển, ngoài ra còn

có các tên thường gọi như đỉa biển, hải thử, sa tốn Hải sâm có vai trò quan trọng trong hệ sinh thái [10] Về hình thái, hải sâm thường có kích thước lớn màu nâu đậm, cơ thể thon dài dạng hình trụ, rỗng hoặc đặc bên trong tùy thuộc vào loài, tạo nên hình dạng đối xứng 2 bên, cấu tạo bên ngoài gồm miệng nằm

ở mặt bụng, quanh miệng có 20 xúc tu, hậu môn nằm cuối thân Mặt lưng có

2-3 hàng gai thịt lớn, dạng hình nón khá dài, chạy dọc theo hai đường biên lưng của cơ thể Những chiếc gai thịt dài, cũng xuất hiện ở mặt bên và phần rìa bụng Một số loài phẳng phần lưng hoặc bụng, một số loài đã phát triển kênh hô hấp Chân bám được sắp xếp dọc theo các vòng của phần bụng Chân ống hình trụ, nhỏ và dài, cuối chân có đĩa bám (Hình 1.1) [11] Một đặc điểm khác của hải sâm là có số lượng lớn khung xương cacbonat (ossicle), có nguồn gốc từ phôi [12] Hải sâm thường ăn các xác chết của động vật, sinh vật phù du và các chất hữu cơ dưới biển Phần lớn chúng sử dụng các loại chất nền dưới đáy biển trong suốt quá trình trưởng thành Hải sâm thường bắt mồi - là những loài trôi lơ lửng trong sóng - bằng cách sử dụng các xúc tu [13] Hải sâm sinh sản bằng cách phóng tinh trùng và trứng vào nước biển, sau đó trứng được thụ tinh, và phát triển ngoài cơ thể con cái Tuyến sinh dục nằm ở phần trước của lưng, trong quá trình sinh sản, con đực và con cái nâng nửa thân trước lên, con đực thụ tinh, sau đó con cái sinh sản Trứng và tinh trùng được tạo ra theo cách này được thụ tinh trong biển và bắt đầu phát triển Số lượng trứng của một con cái khoảng 500.000 đến 10 triệu quả và nở trong 2 ngày ở nhiệt độ nước 20 °C

Hải sâm được tìm thấy ở hầu hết các môi trường đáy biển, nhưng đa dạng nhất là ở các rạn san hô nhiệt đới Chúng phân bố dọc theo thềm lục địa, từ vùng triều đến vùng biển khơi sâu và được tìm thấy ở hầu hết các loại nền đáy Hiện nay, trên thế giới ghi nhận khoảng 1400 loài hải sâm thuộc 6 bộ, 25 họ [14] Ở Việt Nam, khoảng 70 loài đã được xác định, trong đó Khánh Hòa và Côn Đảo là một trong những khu vực có số lượng lớn các loài có giá trị kinh tế

cao như các loài trong họ Holothuriidae (Holothuria, Stichopus), Cucumaridae (Colochirus, Cucumaria) và Sinaptidae (Protankyra) [15]

Hải sâm đã được sử dụng từ rất lâu làm một thực phẩm hay một vị thuốc trong đông y, do có giá trị dinh dưỡng cao cùng khả năng chữa một số bệnh như thấp khớp, cao huyết áp, hen suyễn,…[16, 17] Một số hợp chất dinh dưỡng

ở hải sâm như protein (các axit amin), chất béo (lipid), axit béo, hàm lượng khoáng (Ca, Mg, Fe, Zn), Vitamin A, Vitamin B1 (thiamine), Vitamin B2 (riboflavin), Vitamin B3 (niacin) và các nguyên tố vi lượng, [18, 19] Dạng thể keo (colagen) chiếm 40 ÷ 60 % tổng số protein chứa trong mô của hải sâm Với phần lớn là dạng keo này nên protein trong hải sâm rất dễ tiêu hóa, thường phù hợp để tăng cường sức khỏe, tránh suy nhược cơ thể, đặc biệt là đối với người cao tuổi Hàm lượng lipid trong hải sâm thấp nhưng lại chứa các hợp chất đặc biệt như phospholipid, monoglyceride, diglyceride, triglyceride, acid

Hình 1.1 Hình thái chung bên ngoài c ủa hải sâm [13]

béo no và không no (34 loại acid béo), trong đó acid béo không bão hòa chiếm

ưu thế và các acid béo có nhiều nối đôi chiếm từ 43,1-75,0% gồm: linoleic,

arachidoric, eicosatrrienic, eicosapentaenoic, là các acid béo không thể thay thế

có hoạt tính sinh học cao, là tiền chất của prostaglandin một loại dược phẩm

quý.Chất hexosamines có nhiều trong hải sâm, trong đó glucosamine trong hải

sâm với hàm lượng trong mô cơ là 0,11 ÷ 0,12 % (trọng lượng khô) có tác dụng

kháng vi khuẩn, kìm hãm sự phát triển của khối u ác tính sẽ mở ra triển vọng

điều trị bệnh ung thư trong tương lai [20] Chất holothurinosides là các saponin

pentasaccharide không có sự sulfate hóa được chiết từ hải sâm có hoạt tính

chống oxy hóa tế bào và chống sự phát triển của tế bào, vì vậy cũng được sử

dụng để hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư, cũng như quá trình điều trị

bệnh ung thư trong tương lai gần [20] Ngoài ra, còn chứa nhiều loại axit amin

thiết yếu có tỉ lệ lớn như glycine, glutamic acid, aspartic acid, alanine, và

arginine [18, 19, 21] Hàm lượng trung bình của protein và lipid ở hải sâm từ

các vùng biển trên thế giới được thể hiện trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Hàm lượng protein và lipid trong hải sâm tại

một số vùng biển trên thế giới [21]

Trong mô cơ của một số loài hải sâm chứa nhiều thành phần khoáng vi

lượng như sắt (Fe), magie (Mg), selen (Se), kẽm (Zn)… và một số nguyên tố

vi lượng quý hiếm như Se, là một trong những khoáng chất vi lượng thiết yếu,

có thể ngăn chặn những rối loạn chuyển hóa, làm chậm quá trình lão hóa và

phòng chống một số bệnh mãn tính; là chất giải độc, vô hiệu hóa các kim loại nặng, đi vào cơ thể qua đường ăn uống như chì và thủy ngân, để thải ra nước tiểu [22, 23]

Trong số các hợp chất có giá trị ở hải sâm phải kể đến các polysaccharide sulfate (PS) hay glycosaminoglycans (GAGs), với nhiều hoạt tính sinh học quý như: chống tạo mạch, kháng u, chống đông máu, kháng viêm, chống tăng huyết

áp, chống huyết khối,…[2, 3, 24]

1.1.2 Hải sâm Stichopus horrens

1.1.2.1 Phân loại

Họ Stichopodidae lần đầu tiên được đề xuất bởi Haeckel, với tên gọi

“Stichopodida”, để phù hợp với chi Stichopus và Thelenota Đặc điểm mà phân

chia họ này, với những họ khác là ở sự đặc biệt của 2 tuyến sinh dục.Hiện nay,

họ Stichopodidae bao gồm 9 chi và 35 loài phân bố khắp nơi Chi Stichopus và

Thelenota là 2 giống đầu tiên được phân loại vào trong họ này [22]

1.1.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh sản

S horrens có hình dạng cơ thể gần giống hình tứ giác ở mặt cắt ngang với bề mặt cứng và thô; có nếp nhăn ở phần giữa lưng Cơ thể nhiều gai lớn như trái sầu riêng Mặt lưng có 2-3 hàng gai thịt lớn dạng hình nón khá dài chạy dọc theo hai đường biên lưng cơ thể Chủ yếu có màu nâu sẫm và vàng nhạt, với từng đốm nâu trắng li ti dọc thân Khoang miệng có một vài gai nhỏ Chân của hải sâm bị giới hạn trong 3 phần với phần giữa gồm nhiều hàng chân dạng sợi nhưng mật độ lại ít hơn, nền màu trắng kem với những đốm nâu chạy dọc phần bụng với 20 xúc tu hình tấm khiên Ở phần lưng, có nhiều các trâm hình tròn và trâm que hình chữ C Những mảng hình tròn ở phần lưng với 4 lỗ ở trung tâm, 9-12 lỗ ngoại biên xung quanh bề mặt trơn,4 cái gai với chiều cao trung bình tạo thành cột tháp nhọn hình chữ thập Các mẫu xương nhỏ ở vùng vây lưng bao gồm các hình vòng giống các trâm gai với các lỗ trên bề mặt tạo

ra hình như chữ C và dây, có một cái trâm tháp lớn gồm 4 cái gai hợp lại với nhau tạo thành một cái tháp gai nhọn ở trung tâm Trên bề mặt các phần trâm gai hình que đều thô và gồ ghề, đặc biệt ở hai đầu thu hẹp lại thành gai; ở trung tâm có các nhánh gai phức tạp, có lỗ Ở các trâm gai viền nhô đục lỗ có 6 tới

12 lỗ không đều; kích thước nhỏ hơn so với chân ống Chân ống có trâm lớn, tấm đa điểm và trâm tháp Trâm gai lớn có tấm trung tâm với đục lỗ; bề mặt thanh gồ ghề và được phủ bởi các gai nhỏ Trong các xúc tu, các tiểu xương

Hình 1.2 H ải sâm Stichopus horrens, Selenka, 1867

bao gồm các que có kích thước và độ dày khác nhau Tất cả các trâm gai có bề mặt thô và bảo phủ bởi các gai nhỏ; các trâm gai nhỏ thường hay thẳng, trong khi các trâm gai lớn hơn đều cong thành quai [25] Loài này thể hiện màu sắc

cơ thể đa dạng, trong các mẫu vật từ các nơi khác nhau.Trọng lượng trung bình của loài hải sâm này từ 200 đến 500 g, chiều dài khoảng 20 cm [26, 27] Các loài của lớp Holothuroidea là gonochoric và chỉ có một tuyến sinh dục Vòng đời: Phôi phát triển thành ấu trùng planktotrophic (auricularia) sau đó thành ấu trùng doliolaria rồi biến chất thành hải sâm chưa trưởng thành Ngoài ra, chúng cũng có thể sinh sản vô tính bằng cách phân hạch (các cá thể sống tự phân chia theo cách co thắt dần dần, sau một thời gian có thể tách ra thành hai cá thể riêng biệt)

1.1.2.3 Phân bố và môi trường sống

S horrens được tìm thấy nhiều ở các rạn san hô, bên dưới những tảng đá

bè lớn từ độ sâu từ 2 đến 20 m Ở những nơi khác, nó xuất hiện phổ biến trên các khu vực đá vụn và cát; ẩn dưới đá hoặc san hô chết, hoạt động nhiều vào ban đêm, ẩn nấp trong các kẽ hở vào ban ngày Mật độ quần thể của loài này không cao Chúng hay ngụy trang thêm lớp cát trên lưng, đồng thời để giữ mát cho cơ thể và tránh tia nắng mặt trời

Hải sâm S horrens phân bố phổ biến nhiều nơi trên thế giới như ở các nước

Nhật Bản, Australia, Ấn Độ, Malaysia, Trung Quốc và các vùng biển ở Đông Phi

Ở Việt Nam, phân bố chủ yếu ở các vùng biển Phú Quốc, Côn Đảo, Kiên Giang, Khánh Hòa , Phú Yên, Quảng Ninh, Hải Phòng, Vũng Tàu, [21]

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM

1.2.1 Thành phần hóa học của polysaccharide sulfate từ hải sâm

Các nghiên cứu về PS được chiết tách từ các loài hải sâm khác nhau trên thế giới chứng minh thành phần hóa học như hàm lượng carbohydrate, thành phần và tỉ lệ giữa các gốc đường đơn (monosaccharide), hàm lượng sulfate và các thành phần khác rất đa dạng Các điều kiện môi trường sống khác nhau giữa các loài hải sâm cũng là một yếu tố tạo nên sự đa dạng này Trong nghiên cứu

của Ustyuzhanina và cộng sự năm 2018, kết quả cho thấy thành phần hóa học của PS với tỉ lệ phần trăm về khối lượng khác nhau của hàm lượng sulfate 25,1%; hàm lượng uronic acid 4,7% và các thành phần đường đơn fucose là

23,2%, galactosamine là 3.1% của loài hải sâm S horrens [28] Tác giả Phạm Đức Thịnh và cộng sự, năm 2018 nghiên cứu về PS của loài hải sâm Stichopus

variegatus [29], cho các kết quả về thành phần hóa học như hàm lượng

carbohydrate là 45,8%, hàm lượng sulfate 32%, hàm lượng protein là 7,5%, bên cạnh đó kết quả thành phần đường đơn của PS thu nhận được rất đa dạng gồm fucose, galactose, glucuronic acid và N-acetyl-galactosamine với các tỷ lệ mol khác nhau Trong nghiên cứu của Li và cộng sự năm 2020 [30] về loài hải

sâm Stichopus chloronotus, kết quả phân tích thành phần hóa học thu được hàm

lượng tổng carbohydrate rất cao là 63,4%, cùng với hàm lượng sulfate 35,7%,

tỷ lệ mol giữa gốc đường đơn fucose và sulfate cao 1,0:1,3 Thành phần đường

đơn của PS thu nhận được từ loài hải sâm Cucumaria frondosa trong nghiên

cứu của Varsa Kale năm 2013 [31] vô cùng đa dạng gồm nhiều gốc đường đơn N-acetylneuraminic acid, mannose, N-acetylglucosamine , galactose, fucose, glucose với tỷ lệ mol khác nhau PS được chiết tách từ các loài hải sâm thuộc

2 nhóm chính là Fucosylated Chondroitin Sulfate (FCS) và Fucan Sulfate (FS) Thành phần đường đơn (monosaccharide) chủ yếu là các gốc đường fucose Thành phần đường đơn (monosaccharide) của FCS trong các nghiên cứu đã công bố bao gồm nhiều loại monosaccharide khác nhau, phổ biến nhất là D-glucuronic acid và D-glucosamine với tỉ lệ xấp xỉ nhau Sự khác biệt lớn đến

từ tỉ lệ của gốc fucose và nhóm thế sulfate, đây là hai thành phần thường chiếm

ưu thế, ngoài ra, sự khác biệt này không chỉ phụ thuộc vào các loài hải sâm khác nhau mà còn bị ảnh hưởng bởi phương pháp, kỹ thuật sử dụng để tiến hành chiết tách [7] Thành phần hóa học với các tỉ lệ monosaccharide và nhóm sulfate của FCS ở một số loài hải sâm được thể hiện ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Thành phần monosaccharide và nhóm sulfate của FCS

từ một số loài hải sâm [7]

Loài hải sâm Thành phần hóa học (tỉ lệ mol)

1:1,29:0,18:1,86

Ludwigothurea grisea

1:0,85:1,85:2,04 1:1,10:1,07:2,93

1.2.2 Thành phần đa dạng trong cấu trúc của polysaccharide sulfate

từ hải sâm

1.2.2.1 Các nghiên cứu về thành phần Fucan sulfate

Các công bố về Fucan sulfate ở các loài hải sâm khác nhau trên thế giới chỉ ra FS có cấu trúc rất đa dạng Thành phần Fucan sulfate (FS) ở các loài hải sâm có các cấu trúc đặc trưng riêng, điều này được chứng minh trong kết quả nghiên cứu về hợp chất này ở các loài hải sâm khác nhau trên thế giới Như

trong nghiên cứu của Ustyuzhanina và cộng sự năm 2018, FS ở loài hải sâm S

horrens sau khi chiết tách được tinh chế bằng kỹ thuật sắc kí trao đổi ion [28] Kết quả nghiên cứu về cấu trúc sau đó cho thấy, mạch của FS thu nhận được tạo nên bởi các đơn vị 3-α-L-fucopyranose 2-sulfate, nhóm sulfate liên kết tại

vị trí O-2 và O-4 của vòng fucosyl (hình 1.3)

Cùng nghiên cứu về chi Stichopus, Kariya và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu về FS thu nhận từ loài hải sâm Stichopus japonicus [20]; theo đó,

cấu tạo mạch của FS này được tạo nên bởi các gốc đường đơn Fuc(2OSO3-) và Fuc(2,4OSO3-) (hình 1.4)

Hình 1.3 C ấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Stichopus horrens [28]

Vào năm 2015, một cấu trúc mới dạng mạch nhánh của FS, thu nhận từ

loài hải sâm Acaudina molpadioides, đã được công bố trong nghiên cứu của

Long Yu và cộng sự [32] Cấu trúc này hoàn toàn khác so với cấu trúc của PS

của loài hải sâm Stichopus japonicus đã được công bố trước đó (Hình 1.5)

Cùng năm 2015, Wu và các cộng sự đã tiến hành thu nhận và nghiên cứu

cấu trúc của FS từ 4 loài hải sâm khác nhau gồm Pearsonothuria graeffei,

Holothuria vagabunda, Stichopus tremulu và Isostichopus badionotus [33]

Hình 1.4 C ấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Stichopus japonicus,

Kariya và cộng sự [20]

Hình 1.5 C ấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Acaudina molpadioides,

Long Yu và cộng sự [32]

Theo đó, cấu trúc mạch của FS từ loài Stichopus tremulus gồm chủ yếu là các

gốc tại vị trí O không có nhóm sulfate liên kết trên vòng fucose (non-O-sulfate fucose); trong khi đó, cấu trúc đa dạng hơn được công bố ở hai loài hải sâm là

Pearsonothuria graeffei với các gốc 2,4-disulfate, non-O-sulfate fucose và ở

loài Isostichopus badionotus chứa chủ yếu là các gốc non-O-sulfate fucose,

2-O-sulfate fucose và 2-4-O-disulfate fucose Một cấu trúc của FS từ hải sâm

Isostichopus badionotus - bao gồm các đơn vị lặp lại của tetrasaccharide, cũng được công bố trong nghiên cứu của Chen và cộng sự [16] (Hình 1.6)

Sự đa dạng về mặt cấu trúc còn được thể hiện ở kết quả nghiên cứu về

FS ở loài hải sâm Ludwigothurea grisea Như trong kết quả nghiên cứu của Silva và cộng sự, FS ở loài hải sâm Ludwigothurea grisea thu ở vùng biển

Brazil có cấu trúc mạch thẳng, được tạo nên bởi gốc đường đơn Fuc(2OSO3-) liên kết 1,3 với gốc Fuc(2,4OSO3-) [34] Tuy nhiên, vào năm 2014, trong nghiên cứu của Myron và cộng sự, cũng tiến hành trên đối tượng loài hải sâm này, cấu trúc FS thu nhận được có dạng mạch nhánh chứ không phải dạng mạch thẳng (hình 1.7) [7]

Hình 1.6 C ấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Isostichopus badionotus

[16]

Từ kết quả các nghiên cứu có thể thấy, cấu trúc của FS rất đa dạng và có

sự khác nhau giữa các họ hải sâm, thậm chí giữa các loài trong cùng một họ Kết quả này có thể do sự khác nhau về các điều kiện môi trường sống, thời gian

và địa điểm thu mẫu… gây ra Sự khác nhau về mặt cấu trúc có thể tạo nên sự

đa dạng về mặt hoạt tính của FS ở các loài hải sâm khác nhau

1.2.2.2 Các nghiên cứu về thành phần Fucosylate chondroitin sulfate

Fucosylate chondroitin sulfate (FCS) là một trong 2 dạng PS ở hải sâm

và nhận được nhiều quan tâm, do sở hữu hoạt tính sinh học phong phú và đa dạng [16, 35, 36]; cấu trúc FCS thu nhận từ nhiều loài hải sâm cũng đã được làm rõ

Theo các kết quả nghiên cứu đã công bố, đặc điểm cấu trúc chung của các polysaccharides dạng này bao gồm lõi chondroitin [→4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→]n và các nhánh fucosyl được gắn với O-3 của gốc glucuronyl (hình 1.8) Các FCS khác nhau về trọng lượng phân tử, mức độ phân nhánh và kiểu sulfate hóa của cả nhánh từ mạch khung đến nhánh từ gốc fucosyl [7, 16, 37, 38]

Hình 1.7 C ấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Ludwigothurea grisea [7]

Ngoài ra, nhóm FCS từ hải sâm có cấu trúc giống polysaccharide thu

nhận được khá phổ biến ở động vật có vú là chondroitin sulfate, nhưng khác

nhau ở vị trí C-3 của gốc uronic axit có tạo mạch nhánh bởi nhóm fucose sulfate

(Hình 1.9) [39, 40]; với đặc điểm cấu trúc của nhóm fucose sulfate mạch nhánh

này, nên tránh được sự phân hủy dưới tác động bởi enzyme chondroitin được

sinh ra bởi sinh vật biển; ngoài ra còn làm tăng mật độ điện tích để thích nghi

với điều kiện môi trường biển và đồng thời có hoạt tính sinh học rất cao

Hình 1.9 C ấu trúc của một đơn vị trong chuỗi

fucosylated chondroitin sulfate.[40]

Hình 1.8 C ấu trúc của fucosylate chondroitin sulfate

Các nghiên cứu về cấu trúc cho thấy, cấu tạo FCS gồm 3 thành phần chính là: uronic acid, sulfate và các gốc đường amin Cấu trúc mạch khung thì tương tự như chondroitin sulfate (CS) ở động vật có vú [39], các nhánh α-L-fucopyranose có thể gắn ở các vị trí khác nhau trên mạch chính(β-D-glucuronic acid hoặc β-D-galactosamine) [7] Ngoài ra, các nhánh fucose này có mô hình sulfate hóa, có thể phân biệt được so với mạch chondroitin sulfate và mô hình sulfate hóa của fucan nhìn chung thường ở vị trí C-2, 3 và 4; trong một số công

bố khác, trong cấu trúc của FCS xuất hiện kiểu liên kết glycosidic giữa các gốc fucose theo dạng liên kết (1→2, 1→3 hoặc 1→4) và liên kết glycosidic của các fucan này với mạch chính CS có thể ở vị trí C-3 của gốc glucuronic acid Quá trình sulfate hóa, hay vị trí liên kết của các nhóm sulfate, cùng với thành phần cấu tạo khác nhau của các nhánh, tạo nên cấu trúc hóa học đặc trưng của từng loài hải sâm (hình 1.10) [41] Sự hiện diện của các mạch nhánh khác nhau trên phân tử FCS cung cấp cho loài hải sâm (động vật không xương sống) khả năng điều chỉnh hệ thống sinh lý Mức độ hoạt động trong các hệ thống này không chỉ phụ thuộc vào quá trình fucosyl hóa, mà còn phụ thuộc vào các dạng sulfate hóa của các mạch nhánh khác nhau trong cấu trúc (Bảng 1.3)

Bảng 1.3 Các dạng sulfate hóa của các mạch nhánh khác nhau của FCS

từ các loài hải sâm [40]

Loài hải sâm Tỷ lệ (%) các đơn vị phân nhánh

Fuc0S Fuc3S Fuc4S Fuc2S4S Fuc3S4S

Việc chọn lựa phương pháp, kỹ thuật, cơ chế tách chiết thích hợp là rất quan trọng, điều này ảnh hưởng đến cấu trúc của PS thu nhận được từ hải sâm Ngoài ra, các điều kiện môi trường sống và vị trí thu nhận mẫu, mùa vụ khác nhau giữa các loài hải sâm cũng là yếu tố tạo nên sự đa dạng về thành phần cấu trúc của PS

Hình 1.10 C ấu trúc đặc trưng của fucosylated chondroitin sulfate

ở một số loài hải sâm được nghiên cứu của nhiều tác giả (a) β-D-glucuronic acid, (GlcA) (b) N-acetyl- β-D-galactosamine, (GalNAc) (c) mạch nhánh fucose, α-L-fucose.[7]

1.2.3 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của polysaccharide sulfate hải sâm

Sự phát triển của khoa học kỹ thuật và công nghệ mới giúp đẩy mạnh các nghiên cứu về những hợp chất có hoạt tính sinh học ở hải sâm như: polysaccharide sulfate (PS), collagen, sialic acid, saponin, [18, 19, 21, 45], trong đó PS hay glycosaminoglycans là hợp chất được nghiên cứu nhiều nhất,

vì các hoạt tính sinh học đa dạng của hợp chất này như: chống đông tụ, chống tắc nghẽn mạch máu, kháng viêm [24, 46], điều chỉnh sự hình thành mạch máu [47], ức chế sự di căn của tế bào ung thư [48, 49], kháng virus [50],… trong đó hoạt tính chống đông tụ là hoạt tính được đánh giá nhiều nhất khi nghiên cứu

về FCS từ các loài hải sâm

1.2.3.1 Hoạt tính chống đông tụ máu và hình thành huyết khối của FCS

Chondroitin sulfate (CS) không phải là tác nhân chống đông tụ máu, nhưng nhờ quá trình fucosyl hóa làm cho nó hoạt động và mức độ tùy thuộc vào dạng sulfate hóa trên nhánh fucosyl [51] Trong số các hoạt tính tiềm năng cho lĩnh vực y sinh, thì chống đông tụ máu của FCS được quan tâm nhiều nhất

Cơ chế hoạt động chống đông tụ máu và chống hình thành huyết khối của FCS chủ yếu tập trung vào vai trò làm chất xúc tác cho các chức năng ức chế thrombin của hai tác nhân antithrombin (AT) và heparin cofactor II (HCII), đối với FIIa và Xa [52] Trọng lượng phân tử và mật độ sulfat hóa trong cấu trúc của FCS đã được chứng minh là đóng một vai trò quan trọng trong hoạt động chống đông tụ máu và chống hình thành huyết khối [53, 54, 55] Từ nhiều kết quả nghiên cứu về hoạt tính này cho thấy, nếu FCS không fucosyl hóa thì sẽ không tham gia vào quá trình chống đông tụ máu, do đó việc loại bỏ mạch nhánh fucopyranosyl (Fucp) khỏi FCS được cho là yếu tố làm mất hoạt tính này [41, 56] Theo nhiều nghiên cứu, một đơn vị Fucp có dạng 2,4-O-disulfate

là quyết định hoạt tính chống đông tụ máu và chống hình thành huyết khối của FCS và hoạt tính mạnh hay yếu phụ thuộc vào số lượng các đơn vị này [57] Như số lượng đơn vị Fucp 2,4-O-disulfate trong cấu trúc FCS của bốn loài hải

sâm Isostichopus badionotus, Thelenota ananas, Stichopus japonicus và

Apostichopus japonicus cao hơn so với trong cấu trúc FCS của các loài hải sâm khác và FCS thu nhận ở 4 loài trên cũng thể hiện hoạt tính chống đông tụ máu mạnh hơn [27] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra hoạt tính này của FCS có tiềm năng được sử dụng thay thế Heparin làm 1 chất chống đông tụ sử dụng trong lĩnh vực y dược [16, 41, 49, 54, 56, 58, 59] Tuy nhiên, vẫn có nghiên cứu chỉ ra rằng, các cấu trúc khác nhau (các dạng sulfate hóa khác nhau) của các đơn vị α-L-Fucp phân nhánh không có tác động đến kết quả chống đông tụ máu [60]

1.2.3.2 Hoạt tính gây ức chế sự tổn thương mô

Nghiên cứu của Monteiro-Machado và cộng sự đã cho thấy, FCS từ loài

L grisea có thể thể hiện các đặc tính điều trị có tiềm năng chống lại độc tính

gây ra bởi nọc của loài rắn Bothrops jararacussu [61] Độc tính được gây ra từ

nọc của loài rắn này khi thêm vào trong mẫu mô cơ trong ống nghiệm; khi có mặt của FCS thì độc tính trên mẫu mô cơ đã được loại bỏ hoàn toàn Điều này, chứng minh cho vai trò của FCS, có thể ức chế hoạt động gây phù và ngăn chặn một phần sự giảm tổng số bạch cầu trong máu, khi được ủ trước với nọc độc thô FCS có vai trò là một chất ức chế độc tính và viêm, do nọc độc gây ra từ

loài rắn Bothrops jararacussu và có thể đối với các loại độc tố tương tự khác

gây ra

1.2.3.3 Hoạt tính kháng sự xâm nhập của vi sinh vật ngoại lai

Hoạt tính chống virus HIV của FCS từ loài hải sâm T.ananas đã được

nghiên cứu bởi Lian W., Huang N và cộng sự [62, 63] Các dữ liệu thể hiện trong nghiên cứu mở ra một hướng ứng dụng của FCS trong việc ngăn chặn một cách hiệu quả và có chọn lọc đối với virus HIV type 1 (HIV-1) Kết quả chỉ ra rằng, FCS này có thể liên kết với glycoprotein 120 (gp120) trên màng của virus HIV Dựa trên tất cả các nghiên cứu về hoạt tính này của FCS cho đến nay, các nhánh fucosyl sulfate được chỉ ra là các mô hình cấu trúc đóng vai trò chính cho hoạt động chống HIV-1 Ngoài ra, mối liên hệ giữa kích thước phân tử với hoạt tính chống virus HIV-1 cũng được nghiên cứu, theo đó những FCS có trọng lượng phân tử thấp thể hiện hoạt tính chống virus HIV-1 mạnh hơn [62] Kết quả từ nghiên cứu của Pomin và cộng sự cũng đề xuất cơ chế hoạt động kháng virus của các polysaccharides đã sulfate hóa [64]

1.2.3.4 Hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào

Sự tác động hay ảnh hưởng của FCS được tách chiết từ loài hải sâm L

grisea lên sự phát triển của tế bào như cơ chế phì đại cơn trơn mạch máu (SMC) trong nghiên cứu của Tapon-Bretaudière J và cộng sự [52] cho thấy khả năng

ức chế của FCS lên cơ chế này rất hiệu quả Ngoài ra, nghiên cứu còn chỉ ra rằng sự hiện diện của các nhóm sulfate liên kết tại nhánh fucose trên FCS, được chỉ ra là yếu tố quyết định thiết yếu tới hoạt động tăng sinh và di chuyển của tế bào Sự ảnh hưởng của FCS lên tế bào bị loại bỏ khi diễn ra quá trình defucosyl [52]

1.2.3.5 Hoạt tính kháng ung thư và kháng viêm

Như đã biết, heparin là chất có khả năng ức chế liên kết P- và L-selectin, với phối tử của chúng (sialyl LewisX), dẫn đến kết quả kháng u và chống viêm; FCS được tách chiết từ các loài hải sâm cũng thể hiện hoạt tính này [48] FCS

có tác dụng ức chế mạnh ảnh hưởng của cả liên kết P- và L-selectin, với sialylLewisX cố định, và gắn của tế bào ung thư biểu mô (LS180) với P- và L-selectin cố định Quá trình thể hiện khả năng ức chế của FCS xảy ra phụ thuộc vào liều lượng và cách thức Nghiên cứu của Borsig L và cộng sự [48] cho

thấy FCS được tách chiết từ loài hải sâm L grisea đã được chứng minh có liên

quan đến hoạt tính kháng khuẩn, cũng như hoạt động kháng u và chống viêm; ngoài ra FCS cũng cho thấy khả năng ức chế tế bào ung thư biểu mô tuyến MC-

38, xâm nhập vào phổi trong một mô hình nghiên cứu thực nghiệm về di căn ở chuột [48]; bên cạnh đó, các tác giả còn chứng minh hoạt tính kháng viêm qua hai mô hình kháng viêm khác nhau (viêm phúc mạc do thioglycollate và viêm

phổi do lipopolysaccharide); FCS chiết tách từ loài hải sâm L grisea còn cho

thấy khả năng ức chế sự tái tạo bạch cầu trung tính, cả hai hoạt tính ức chế đều phụ thuộc vào liều lượng [48] Nghiên cứu của Panagos và cộng sự cũng cho

thấy hoạt tính kháng khuẩn của FCS, được chiết tách từ loài hải sâm Holothuria

forskali, bằng cách sàng lọc các FCS có nguồn gốc từ các oligosaccharide thông qua kỹ thuật microarray [38] Trong nghiên cứu này, tác giả đã đề xuất cấu trúc của FCS, và sự liên quan của các dạng sulfate hóa của các đơn vị Fucp, trong việc điều chỉnh cấu trúc 3D tổng thể Hay trong nghiên cứu của Zhao và cộng

sự trong cả điều kiện in vivo và in vitro cho thấy, FCS có thể đồng thời làm giảm mức độ di căn bằng cách sử dụng tế bào B16F10 của khối u ác tính ở chuột và khuynh hướng hình thành huyết khối tắc mạch khi FCS được sử dụng

Sự hình thành fibrin bị ức chế chủ yếu bằng cách làm giảm sự tạo ra yếu tố hoạt hóa Xa Ngoài các hoạt động này, FCS còn có khả năng ngăn chặn sự kích hoạt của các đường dẫn tín hiệu p38MAPK và ERK1/2 được coi là những con đường trung tâm cho sự biểu hiện của ma trận liên quan đến sự di căn [65] Trong một

công bố khác của He M và cộng sự, FCS chiết tách từ loài hải sâm I badionotus

có thể ức chế sự phát triển của khối u bằng cách điều chỉnh giảm các biểu hiện của Hif-1α (yếu tố gây giảm oxy 1-alpha), heparanase và yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu [66]

Năm 2017, trong nghiên cứu của mình, tác giả Thịnh [67] đã tiến hành

khảo sát hoạt tính chống ung thư của các phân đoạn FCS từ 3 mẫu hải sâm S

variegatus, H spinifera, B Argus có hàm lượng sulfate cao trên hai dòng tế bào ung thư là tế bào ung thư phổi (LU-1) và tế bào ung thư gan (Hep-G2), chất đối chứng dương được sử dụng là DMSO (Dimethyl sulfoxide) Kết quả nghiên

cứu cho thấy, chỉ có 2 mẫu là phân đoạn F3 - H spinifera và F3 – B.argus thể hiện hoạt tính, trong đó mẫu F3 – B.argus ức chế được cả 02 dòng tế bào ung

thư thử nghiệm với tỷ lệ tương ứng là 78,22% (LU-1); 71,05% (Hep-G2) Đối

với phân đoạn F3 - H spinifera chỉ thể hiện hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), với tỷ lệ là 53,15% Hai phân đoạn F3 - H spinifera

và F3 – B.argus đều là phân đoạn của fucan sulfate Bên cạnh đó, phân đoạn

F3 - H spinifera còn thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đối với chủng sử dụng nghiên cứu

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, HƯỚNG PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về polysaccharide sulfate (PS)

từ nhiều loài hải sâm thu nhận từ các vùng khác nhau Hoạt tính sinh học của

PS được Berteau và Mulloy nghiên cứu đầu tiên ở động vật biển không xương sống [68] Sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật và các công nghệ, cùng

với nhiều thiết bị mới đã hỗ trợ và tạo cơ sở cho các nghiên cứu mới về PS từ các loài hải sâm Các nghiên cứu về cấu trúc và các hoạt tính sinh học của PS chiết tách từ các loài hải sâm đã công bố trước đây cho thấy, với cùng một loài hải sâm, nhưng sống ở các vùng biển khác nhau, đồng thời khi tiến hành thu mẫu ở các thời điểm mùa vụ, vị trí khác nhau cho các kết quả về đặc điểm cấu trúc và các hoạt tính sinh học khác nhau Alves và các cộng sự [69] đã công bố cấu trúc và hoạt tính sinh học của các polysaccharide sulfate từ loài nhím biển

và hai loài hải sâm Isostichopus badionotus và Ludwigothurea grisea Tổng kết

từ các nghiên cứu PS, từ động vật không xương sống ở biển, ở đây là các loài hải sâm, có cấu trúc đồng nhất, mạch thẳng và lặp lại với chỉ từ 1-, 3- hoặc 4- đơn vị đường đơn Tuy nhiên, mỗi loài đều có một cấu trúc fucan sulfate hóa riêng biệt với các cấu trúc khác nhau ở vị trí liên kết giữa các gốc fucose và mức độ liên kết, cũng như vị trí sulfate trên các gốc đường này Thành phần chủ yếu của PS từ hải sâm là L-fucose và các nhóm este sulfate, nhờ có đặc điểm cấu trúc như vậy, nên các PS này thể hiện là một trong những hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh nhất được phân lập từ các loài hải sâm Kariya và cộng

sự đã phân lập được hai loại fucan sulfate từ hải sâm Sichopus japonicus nghiên

cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính ức chế tế bào tủy xương [20] Nhóm tác giả Long Yu và cộng sự đã công bố các kết quả hoạt tính kháng ung thư dạ dày của

fucan sulfate được phân lập từ loài hải sâm Acaudina molpadioides [30] Chen

và các cộng sự đã công bố nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính kháng đông tụ

của fucan sulfate từ các loài hải sâm Isostichopus badionotus và Ludwigothurea

grisea [54] Trong nghiên cứu của Mohamed Ben Mansour cũng công bố về

cấu trúc và hoạt tính chống đông tụ của fucan sulfate từ hải sâm Holothuria

polii [70] Gần đây nhất, năm 2020 Li và cộng sự đã nghiên cứu về PS từ loài

hải sâm Stichopus chloronotus được thu nhận ở Trung Quốc, nghiên cứu chỉ ra

thành phần hóa học cơ bản, đặc điểm cấu trúc và đặc biệt là các hoạt tính sinh học quý như chống oxy hóa và khả năng ảnh hưởng một số đặc tính lên hệ miễn dịch [30]

Các PS phân lập từ các loài hải sâm sở hữu nhiều hoạt tính sinh học quý hiếm và có tiềm năng ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là y sinh và dược Hoạt tính sinh học của PS thể hiện dựa trên cơ sở cấu trúc của chúng

Việc phân tích cấu trúc của PS có ý nghĩa vô cùng quan trọng dựa vào đó có thể giải thích các hoạt tính sinh học cũng như cơ chế tác động, từ đó làm cơ sở

để ứng dụng hợp chất này vào thực tiễn PS từ nhiều loài sinh vật biển như mực, cua, bạch tuộc, cá mập,…[27]; hay từ các loài rong biển [71, 72],… đã được thu nhận và tiến hành nghiên cứu; công trình nghiên cứu PS từ hơn 20 loài rong nâu khác nhau về cấu trúc được phát triển thành các thực phẩm chức năng thương mại (fucoidan) [73]; còn với PS từ hải sâm được nghiên cứu cấu trúc với một số loài phân bố ở Việt Nam

Tại Việt Nam, với đường bờ biển dài 3260 km, giáp biển Đông, cùng với đặc điểm khí hậu nhiệt đới tạo nên sự đa dạng về nguồn lợi tài nguyên biển bao gồm một hệ sinh vật biển vô cùng phong phú và đa dạng [74] Đây là điều kiện

vô cùng thuận lợi về nguồn nguyên liệu để tiến hành các nghiên cứu nhằm tìm

ra các hợp chất thiên nhiên mới có hoạt tính sinh học Các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên biển đã bắt đầu từ những năm thuộc thập niên 60 của thế kỷ

20, tập trung vào một số nhóm hợp chất như protein, lipid, các nguyên tố đa lượng và vi lượng hay các nhóm chất độc tố, tuy nhiên chỉ thật sự được đẩy mạnh trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây với sự phối hợp của các nhà nghiên cứu ở nhiều lĩnh vực khác nhau Với sự phát triển về khoa học kỹ thuật và phương pháp, thiết bị nghiên cứu, các số lượng các công bố về hợp chất có hoạt tính sinh học từ nhiều đối tượng sinh vật biển khác nhau tại vùng biển Việt

Nam ngày càng tăng Có thể kể ra như tuyển tập cụm công trình “Khai thác sử

dụng hợp lý nguồn tài nguyên thiên nhiên sinh vật Biển Việt Nam nhằm tạo ra các sản phẩm có giá trị phục vụ cuộc sống”, với sự tham gia của các nhà khoa

học từ các Viện khác nhau thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (như Viện Hóa sinh biển, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Nghiên cứu

và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Tài nguyên Môi trường Biển Hải phòng), kết quả nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất thiên nhiên từ 5 đối tượng sinh vật biển chọn lọc (gồm: hải sâm

Holothuria vagabunda và Holothuria scabra, Cầu gai Diadema setosum, hải miên cành Haliclona sp và bọt biển xốp đen Icrinia echinata) đã được công

bố; các tác giả đã sử dụng các kỹ thuật khác nhau để chiết tách, tinh sạch và xác định được cấu trúc của khoảng 30 chất, trong đó có 4 chất mới lần đầu tiên

được phân lập từ thiên nhiên, kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học cũng cho thấy nhiều chất có hoạt tính chống ung thư và hoạt tính kháng sinh rất cao Tác giả Phạm Đức Thịnh và cộng sự năm 2018 nghiên cứu về PS từ loài hải sâm

Stichopus variegatus đã xác định được thành phần hóa học, đặc trưng cấu trúc

và đặc biệt là nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư của PS thu nhận được từ loài hải sâm này [75] Năm 2019, nhóm tác giả Phạm Đức Thịnh và các cộng

sự nghiên cứu về PS từ loài hải sâm Holothuria spinifera, kết quả của nghiên

cứu cũng xác định được một số thành phần hóa học cơ bản và đặc điểm cấu trúc của PS từ loài hải sâm này [76] Trong nghiên cứu thuộc phạm vi đề tài

luận văn thạc sĩ của tác giả Mai Ngô Thương Hoài năm 2019 “Nghiên cứu chiết

tách và phân tích đặc trưng cấu trúc của glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra”, kết quả bước đầu của nghiên cứu cũng xác định được thành

phần hóa học và đặc trưng cấu trúc của PS thu nhận từ hải sâm Holothuria atra

[77] Polysaccharide sulfate ở sinh vật biển cũng là nhóm hợp chất sở hữu nhiều hoạt tính sinh học quý hiếm, tuy nhiên hiện nay chỉ mới được nghiên cứu trên một số loài thực vật, chủ yếu là rong và một số loài hải sâm nhất định, vẫn chưa được quan tâm đặc biệt nhiều ở các động vật biển trong đó có hải sâm

Tóm lại, từ việc phân tích tổng quan tình hình nghiên cứu trên thế giới

và trong nước, đề tài: “Xác định thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc

của polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens” được đề xuất thực

hiện nhằm đóng góp thêm các nghiên cứu về polysaccharide sulfate từ hải sâm theo hướng nghiên cứu các hợp chất mới có hoạt tính sinh học, nhằm ứng dụng làm thực phẩm bổ dưỡng và thực phẩm bảo vệ sức khỏe từ nguồn tài nguyên biển

CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là hợp chất polysaccharide sulfate (PS)

chiết tách từ loài hải sâm S horrens

Quy trình thu mẫu: Mẫu hải sâm được thu ở vùng biển Nha Trang vào tháng 12 năm 2019 Hải sâm sau khi thu được giữ trong thùng chứa mẫu có đá khô, đậy nắp kín rồi chuyển về phòng thí nghiệm Mẫu hải sâm được tiến hành phân loại, để định danh xác nhận lại loài hải sâm bởi ThS Nguyễn Thị Mỹ Ngân, chuyên gia phân loại động vật biển không xương sống thuộc Viện Hải Dương Học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hình 2.1 Nguyên li ệu hải sâm Stichopus horrens

2.1.2 Thiết bị - Dụng cụ - Hóa chất

2.1.2.1 Thiết bị

• Máy đo quang Genesys 10S UV-Vis (Thermo Scientific, Mỹ)

• Hệ thống sắc kí trao đổi ion Dionex ICS-6000 (Thermo Scientific, Mỹ); cột phân tích trao đổi anion CarboPac MA1 (250mm x 4); cột bảo vệ CarboPac MA1 (50 mm x 4); đầu dò điện hóa (Electrochemical Detector-ED)

• Máy phân tích phổ 1H-NMR, 13C-NMR: AVANCE III – (Bruker, Thụy Sỹ)

• Thiết bị phân tích phổ hồng ngoại: TENSOR 27 – (Bruker, Đức)

• Cân phân tích CPA224S (Sartorius, Đức)

• Máy ly tâm siêu tốcCentrifuge 5424R (Eppendorf, Đức)

• Máy đo pH 7110 (WTW, Đức)

• Máy đông khô: LyoQuest Plus ECO 50 (Telstar, Tây Ban Nha)

• Máy sấy chân không: FRANCE – ETUVE

• Máy cô quay chân không: Heidolph-Laboratory 4003-digital

• Màng siêu lọc MWCO 10kDa, VIVAFLOW 200

• Máy xay đa năng QE-1000: xuất xứ Trung Quốc

• Hệ thống chiết phân đoạn với cột chiết DEAE-Macro Prep

(1,6 x 40 cm)

2.1.2.2 Dụng cụ

• Micropipet 100 µl, 1000 µl, 5000 µl (Sartorius, Đức), đầu tip

• Vial 5mL có nắp (Thermoscientific, Mỹ)

• Bơm kim tiêm, màng lọc xylanh 0.22 µm Nylon (Merck, Đức)

• Các dụng cụ dùng trong thí nghiệm như : pipet, cuvet thạch anh, bình định mức, ống đong, cốc thủy tinh có mỏ, ống nghiệm, bình cầu,…

2.1.2.3 Hóa chất

• Các hóa chất phân tích: L-Cystein, N-Acetyl-galactosamine, Glucuronic acid, D-Galactose, L-Fucose, D-Glucose, D-glucuronic acid (Sigma)

• Hóa chất pha đệm và các dung dịch thuốc thử: Phenol (TQ), Carbazole (Merck), CH3COONa (Merck), CH3COOH (Merck), NaBH4(Scharlau), NH4OH (Merck), Na2SO4 (Merck), K2SO4 (Merck), NaOH (Merck), TCA (Tricloacetic acid) (Merck), Gelatin (Sigma) , BaCl2(Merck), TFA (Trifluoroacetic acid) (Merck), EDTA (Merck), màng thẩm tách kích thước 10 KDa, hexadecyltrimethylamonium bromide (Merck)

• Các hóa chất sử dụng trong quá trình xử lý mẫu khác gồm: Enzyme Papain có xuất xứ Ấn Độ, hoạt độ 2000 UI/g; Ethanol 96%; Aceton (TQ-Trung Quốc); HCl (TQ); NaCl (TQ)

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp chiết tách và phân đoạn polysaccharide sulfate

từ hải sâm Stichopus horrens

2.2.1.1 Phương pháp chiết tách

Chiết xuất là quá trình tách chất hòa tan trong chất lỏng hay chất rắn bằng một chất lỏng khác Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu Chiết

là phương pháp được thực hiện nhằm mục đích điều chế hay phân tích Sản phẩm thu được của quá trình chiết là một dung dịch các chất hòa tan trong dung môi, được gọi là dịch chiết Có 3 quá trình xảy ra đồng thời trong chiết xuất là:

sự hòa tan của chất tan vào dung môi, sự khuếch tán của chất tan trong dung môi và sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật Trong chiết xuất hợp chất thiên nhiên sẽ xảy ra một số quá trình sau: khuếch tán, thẩm thấu, thẩm tích, Một số phương pháp chiết thường được sử dụng như chiết hồi lưu, chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn, phương pháp chiết có hỗ trợ của vi sóng, sóng siêu âm, chiết có sự hỗ trợ của enzyme …Trong đó, chiết sử dụng enzyme là phương pháp phổ biến nhất do có nhiều ưu điểm như dễ tiến hành, hiệu quả cao, thân thiện với môi trường và đặc biệt là không gây ảnh hưởng đến cấu trúc của chất cần nghiên cứu

Phương pháp chiết tách polysaccharide sulfate (PS) từ hải sâm thực hiện dựa theo phương pháp được mô tả trong nghiên cứu của Phạm Đức Thịnh và