Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn bản địa việt nam bằng kĩ thuật in vitro TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC Hà Nội, 2021 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Công nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học 1: TS Bùi Xuân Nguyên Người hướng dẫn khoa học 2: TS Nguyễn Việt Linh Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Viện Cơng nghệ sinh học NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI Nguyễn Thị Nhung, Nguyễn Thị Hồng, Nguyễn Tiến Đạt, Nguyễn Hồng Thịnh, Tamas Somfai, Kazuhiro Kikuchi, Ngơ Thị Kim Cúc, Nguyễn Thanh Sơn, Đồng Văn Quyền, Chu Hoàng Hà, Bùi Xuân Nguyên, Nguyễn Việt Linh Ảnh hưởng môi trường nuôi đến phát triển phôi lợn nhân vơ tính Tạp chí sinh học, 2018, 40(2se):101-105 Nguyen Thi Nhung, Dong Van Quyen, Chu Hoang Ha, Tamas Somfai, Kazuhiro Kikuchi, Ngo Thi Kim Cuc, Nguyen Thi Hong, Bui Xuan Nguyen, Barbara Beck-Woerner, Nguyen Viet Linh Effect of donor cell type on the development of pig embryos produced by somatic cell nuclear transfer Journal of Biotechnology 17(2): 1-5, 2019 Nhung Thi Nguyen, Nguyen Xuan Bui, Viet Linh Nguyen, Van Khanh Nguyen, Kazuhiro Kikuchi, Hiep Thi N Nguyen, Hong Thi Nguyen, Hoang Thinh Nguyen, Quyen Van Dong, Hoang Ha Chu, Ngo Thi Kim Cuc, Tamas Somfai Optimization of in vitro embryo production and zygote vitrification for the indigenous Vietnamese Ban pig: the effects of different in vitro oocyte maturation systems Anim Science Journal 2020;91:e13412 Nguyen Viet Linh, Thi Hiep Nguyen, Nguyen Thi Nhung, Nguyen Thi Hong, Nguyen Tien Dat, Nguyen Hoang Thinh, Nguyen Khanh Van, Tamas Somfai, Kazuhiro Kikuchi Optimization of the in vitro fertilization protocol for frozen epididymal sperm with low penetration ability in a native Vietnamese pig Anim Science Journal 2018 Aug;89(8):10791084 -3, Issue-1, Jan-Feb, 2019 ISSN: 2456-8635 Huỳnh Thị Hường, Nguyễn Thị Nhung, Nguyễn Hoàng Thịnh, Nguyễn Việt Linh Ảnh hưởng giới tính dịng tế bào cấy lên phát triển phơi lợn Bản nhân vơ tính Tạp chí hội chăn nuôi Việt Nam Số 256 tháng năm 2020 MỞ ĐẦU Phát triển công nghệ sinh học sinh sản với bùng nổ thành tựu cấy chuyển phôi, thụ tinh ống nghiệm, nhân vơ tính, bảo quản lạnh tế bào sinh sản phôi, giao thoa công nghệ sinh sản liệu pháp công nghệ di truyền tế bào sinh sản mở tiềm ứng dụng to lớn lĩnh vực cải tiến suất vật nuôi, đảm bảo an ninh lương thực, bảo tồn khai thác đa dạng sinh học (ĐDSH), cân sinh thái phát triển công nghệ y dược đại Lợn đối tượng quan trọng cơng nghệ sinh học Ngồi mục đích cung cấp thực phẩm cho người, lợn cịn nhân tố hệ thống bảo tồn đa dạng sinh học có triển vọng lớn ứng dụng y học Lợn loài động vật có kích thước quan nội tạng tương đồng với quan người, có hệ gen, trình sinh lý học, thể chất hệ miễn dịch gần giống với người, đối tượng khả thi lựa chọn cho hướng nghiên cứu cấy ghép tạng khác loài (xenotransplantation) Do khả tồn cá thể không mang virus Porcine Endogenous Retrovirus (PERVs), giống lợn Bản đánh giá đối tượng tiềm quan trọng công nghệ cấy ghép mơ tạng khác lồi nguồn gen q cần bảo tồn phát triển Vì chúng tơi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu nuôi thành thục trứng tạo phôi lợn Bản địa Việt Nam kỹ thuật in vitro” Mục tiêu: Nghiên cứu tiến hành mơ hình lợn Bản với mục tiêu: (1) Xác định tiềm khai thác trứng buồng trứng lợn Bản; (2) Xác định điều kiện nuôi thành thục trứng lợn Bản; (3) Thiết lập thành công hệ thống tạo phôi lợn Bản thụ tinh ống nghiệm (TTON) nhân vơ tính (NBVT) Dựa nội dung nghiên cứu: (1) Nghiên cứu đặc điểm hình thái buồng trứng tiềm khai thác trứng lợn Bản theo mùa; (2) Nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản phương pháp chuẩn hóa mơi trường ni; (3) Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình tạo phơi lợn Bản TTON thơng qua mơi trường thụ tinh, điều kiện thụ tinh nuôi phôi; (4) Nghiên cứu tạo phơi lợn Bản NBVT khác lồi Tính luận án: (1) Luận án cung cấp thông tin ảnh hưởng mùa vụ, môi trường nuôi thành thục trứng, môi trường chế độ thụ tinh, nuôi phôi bảo quản lạnh phôi TTON, tạo phôi NBVT cấy nhân khác giống làm sở thiết lập thành công hệ thống tạo phơi lợn Bản có hiệu cao, phát triển nhằm mục đích bảo tồn đa dạng sinh học (2) Là nghiên cứu Việt Nam sử dụng hệ thống Piezo để tạo phôi NBVT đối tượng lợn CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Cấu tạo buồng trứng, thành thục trứng, trình thụ tinh phát triển phơi in vivo lợn 1.1.1 Cấu tạo buồng trứng thành thục in vivo trứng lợn Buồng trứng phận quan sinh dục cái, có chức tạo tế bào trứng (giao tử -noãn bào) Miền vỏ buồng trứng chứa nang giai đoạn phát triển khác gồm nang nguyên thủy, nang sơ cấp, nang thứ cấp nang trứng thành thục Nang trứng đơn vị cấu trúc buồng trứng, có chức trì trình phát triển trứng (oogenesis), bảo đảm khả thụ tinh hình thành phơi 1.1.2 Sự thụ tinh phát triển phôi lợn in vivo 1.1.2.1 Các giai đoạn thụ tinh Cũng lồi khác, q trình thụ tinh lợn gồm giai đoạn: Hoạt hóa tinh, tinh trùng gắn vào màng zona trứng, phản ứng acrosome, tinh trùng xuyên qua màng zona, tinh trùng vào tế bào chất trứng liên kết với trứng, trứng kích hoạt phản ứng vỏ trứng xảy 1.1.2.2 Các giai đoạn phát triển phôi lợn Khoảng 30 sau thụ tinh trứng phân chia thành tế bào, tiếp tục q trình phân chia nhanh chóng đề tạo phơi 4, tế bào Phơi dâu hình thành vào ngày 3-4 sau thụ tinh Phôi tiếp tục phân chia tạo thành phôi nang bắt đầu làm tổ tử cung 1.1.3 Ảnh hưởng mùa vụ đến hoạt động sinh sản lợn Lợn loài động vật đa thai, việc khai thác trứng lợn thực suốt năm, yếu tố mùa vụ có ảnh hưởng đáng kể tới chất lượng buồng trứng, từ ảnh hưởng tới số lượng chất lượng trứng 1.2 Tình hình nghiên cứu tạo phơi lợn in vitro 1.2.1 Nuôi thành thục trứng lợn in vitro, ảnh hưởng nguồn nguyên liệu trứng điều kiện ni thành thục Kết thí nghiệm ni thành thục trứng thu từ nang có kích thước khác cho thấy chất lượng trạng thái nang có ảnh hưởng lớn tới thành thục trứng Môi trường nuôi trứng lợn thành thục thông thường bao gồm môi trường (môi trường Hank với L-glutamine Hespes) bổ sung huyết (fetal calf serum: FCS) dịch nang trứng (follicular fluid: FF) thành phần khác gonadotropin, nhân tố tăng trưởng Hormone (LH, FSH), Dibutyryl-cAMP (dbc-AMP) Kết hợp hài hòa thành thục tế bào chất thành thục nhân trứng trình ni in vitro yếu có ảnh hưởng quan trọng lên chất lượng thụ tinh phát triển phôi 1.2.2 Tạo phôi lợn thụ tinh ống nghiệm, ảnh hưởng chất lượng tinh trùng, chế độ thụ tinh, nuôi bảo quản phôi TTON bị chi phối nhiểu yếu tố ảnh hưởng, từ phương pháp bảo quản hoạt hóa tinh, tác động mơi trường ni thành thục trứng, chế độ thụ tinh đến môi trường nuôi phôi phương pháp bảo quản phôi 1.2.2.1 Bảo quản hoạt hóa tinh Nghiên cứu sử dụng tinh lợn đông lạnh để tạo phôi TTONđược Nagai cs thực thành công lần vào năm 1988 Nghiên cứu nhóm tác giả Nagai (1988) Kikuchi (1998) cho thấy tinh trùng thu từ mào tinh hồn có khả khả chịu lạnh cao so với tinh trùng thu sau xuất tinh, đông lạnh sử dụng để thụ tinh với trứng thành thục 1.2.2.2 Môi trường thụ tinh, nuôi phôi yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinh Hai loại môi trường sử dụng phổ biến môi trường Tyrode’s albumin lactate pyruvate (TALP) môi trường Fertilization Medium for Porcine oocytes (Pig-FM) Bổ sung 10 mg/mL BSA mmol/L caffein, dịch nang trứng (pFF) vào môi trường nuôi trứng môi trường thụ tinh làm tăng đáng kể tỷ lệ tinh trùng xâm nhập, tỷ lệ phân chia phát triển phôi Các môi trường Porcine Zygote Medium-3 (PZM-3) PZM-5 cho có hiệu tạo phơi cao bắt đầu sử dụng nhiều năm gần Trở ngại lớn ảnh hưởng tới hiệu tạo phôi tạo phôi lợn in vitro tượng thụ tinh đa tinh trùng (polyspermic) Tỷ lệ phôi đa tinh trùng lợn dao động từ 13% đến 90% Tế bào cận nỗn có vai trị quan trọng, ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinh đơn tinh trùng Hiệu TTON cao điều kiện tế bào trứng cịn lớp tế bào cận nỗn thụ tinh với nồng độ 0.5 × 105 tinh trùng/ml 1.2.2.3 Đông lạnh phôi lợn thụ tinh ống nghiệm Nghiên cứu đông lạnh phôi lợn tiến hành từ sớm, nhiên việc bảo quản phôi gặp nhiều khó khăn phơi lợn nhạy cảm với thay đổi nhiệt độ Các phương pháp đông lạnh nhanh với thể tích tối thiểu (minimum volume cooling: MVC), phương pháp thả trực tiếp phôi vào nito lỏng (microdrop), lên bề mặt kim loại làm lạnh nito lỏng (Solid Surface Vitrification- SSV), phương pháp Hollow Fiber Vitrification (HFV) áp dụng để đông lạnh phôi lợn giai đoạn phôi nang 1.2.3 Tạo phơi lợn kỹ thuật nhân vơ tính 1.2.3.1 Kỹ thuật nhân vơ tính, q trình methyl hóa tái lập trình phơi nhân NBVT kĩ thuật tạo cá thể mà khơng qua sinh sản hữu tính Cơ thể sống tạo nhờ kỹ thuật NBVT theo phương pháp cừu Dolly sinh ngày tháng năm 1996 Viện Nghiên cứu Roslin Yếu tố kỹ thuật ảnh hưởng quan trọng đến hiệu NBVT Các kỹ thuật NBVT phổ biến kỹ thuật kinh điển sử dụng kính hiển vi vi phẫu thuật để loại cấy nhân kim vi tiêm, kỹ thuật loại cấy nhân kết hợp kính hiển vi vi phẫu thuật có gắn hệ thống piezo kỹ thuật handmade cloning 1.2.3.2 Nhân vơ tính khác lồi NBVT khác lồi kỹ thuật tạo phôi nhân cấy nhân tế bào cho nhân loài vào trứng loại nhân loài khác (Interspecies somatic cell nuclear transfer –iSCNT) NBVT khác loài xem giải pháp tiềm để tái tạo, bảo tồn loài động vật quý có nguy bị tuyệt chủng Wells cs, 1998 công bố nhân thành cơng cá thể bị đảo Enderby (là cá thể cịn sống sót giống giá súc q bậc giới) 1.2.3.3 Nhân vơ tính lợn Các nhóm nghiên cứu Onishi Polejaeva thông báo thành công việc tạo lợn nhân vào năm 2000 Tuy nhiên, hiệu NBVT lợn thấp Tỷ lệ lợn sinh dao động khoảng 1-3% tổng số phôi cấy Chất lượng trứng, mùa vụ, yếu tố mơi trường photoperiod, nhiệt độ ảnh hưởng lên chất lượng trứng qua lên hiệu NBVT Nghiên cứu Kurome cs, 2013 cho thấy tiến hành cấy phôi NBVT, tỷ lệ đậu thai đạt cao vào mùa đông (5,3%) thấp vào mùa hạ Hiệu suất NBVT cao nhất, đạt 4.1% lợn sinh sau cấy phôi thông báo thời gian gần 1.3 Nghiên cứu tạo phôi in vitro lợn Bản 1.3.1 Một số đặc điểm hình thái sinh sản lợn Bản Lợn Bản xem đối tượng lý tưởng cơng nghệ ghép mơ tạng khác lồi (xenotransplantation) có đặc điểm kích thước, hệ gen tương đồng với người Ngoài lợn Bản giống lợn có số lượng virus PERV thấp, chúng có tiềm to lớn nghiên cứu ứng dụng y-sinh đặc biệt cấy tạng khác loài Hiện nay, quần thể lợn Bản có khoảng 30.000 – 32.000 bị lai tạp nhiều, phân bố khắp huyện vùng núi cao tỉnh Hịa Bình, chủ yếu tập trung Đà Bắc, Cao Phong, Lạc Sơn, Mai Châu, Tân Lạc 1.3.2 Nghiên cứu nuôi thành thục trứng tạo phơi lợn Bản Việt Nam Các thí nghiệm nuôi thành thục trứng tạo phôi in vitro lợn Bản triển khai lần khuôn khổ dự án hợp tác khoa học Việt-Nhật (JSPS-VAST, 2005-2007) Năm 2008, Ước cs thông báo kết nghiên cứu sản xuất phôi lợn mini nội địa tổ hợp công nghệ TTON NBVT Các tác giả tiến hành thành cơng thí nghiệm thử nghiệm tạo phôi NBVT cấy nhân tế bào sinh dưỡng lợn Bản vào tế bào trứng lợn Landras, với tỷ lệ hợp trứng tế bào đạt 70% tỷ lệ phôi nang đạt 12% CHƯƠNG 2- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.6 2.2.7 2.2.8 2.2.9 2.2.10 2.2.11 2.2.12 2.2.13 2.2.14 2.2.15 2.16 2.2.17 2.2.18 2.2.19 2.2.20 2.2.21 2.2.22 Phân loại tháng theo mùa Phương pháp thu, bảo quản buồng trứng Phương pháp đo kích thước trọng lượng buồng trứng Phương pháp phân chia nhóm nang Phương pháp thu trứng Phương pháp phân loại chất lượng trứng Phương pháp đo kích thước trứng lợn Phương pháp ni trứng Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi Phương pháp đông lạnh tinh từ mào tinh Phương pháp kiểm tra chất lượng tinh trước sau đông lạnh Phương pháp thụ tinh ống nghiệm Phương pháp đánh giá trạng thái thụ tinh Phương pháp đông lạnh phôi Phương pháp thu, nuôi tế bào sinh dưỡng lợn Phương pháp nhân nuôi tế bào Phương pháp đông lạnh tế bào Phương pháp nhân vơ tính Phương pháp ni phơi Phương pháp nhuộm Hoechst Phương pháp nhuộm Orcein Phương pháp phân tích xử lý số liệu SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU Khảo sát kích thước nang bề mặt Khảo sát kích thước khối lượng BT Khảo sát chất lượng trứng sau thu Tiềm khai thác trứng theo mùa NỘI DUNG Tỷ lệ thành thục trứng theo mùa Chọn lọc môi trường nuôi thành thục trứng tối ưu NỘI DUNG MT thụ tinh (TALP, Pig), NĐ tinh Trứng sau nuôi thành thục (ND2) (1x10 , 1x10 TT/ml) TTON Thu bảo quản lạnh tinh lợn Bản Chọn lọc môi trường nuôi trứng tối ưu (TCM-199, POM) Chế độ thụ tinh tối ưu Trạng thái TB cận nỗn (để ngun, tách phần, bỏ hồn tồn ) NĐ cafein (2 mM, mM) thời gian thụ tinh (3 giờ, giờ) MT nuôi % phôi phôi nang, số (NCSU-37, TB/phôi PZM-3) Ngân hàng phôi NỘI DUNG Hệ thống nuôi trứng, TTON nuôi phôi tối ưu Đông lạnh phôi Loại tế bào cấy nhân Hệ thống tạo phôi lợn Bản NBVT Ngân hàng tế bào lợn Bản NBVT Môi trường nuôi phôi (NCSU-37, PZM-3) Nuôi thành thục trứng lợn Landrace NỘI DUNG CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm hình thái buồng trứng tiềm khai thác trứng lợn Bản theo mùa Phần nội dung thực với nghiên cứu bản: Khảo sát ảnh hưởng mùa xuân, hạ, thu, đông lên kích thước khối lượng buồng trứng lợn Bản Khảo sát ảnh hưởng mùa lên tiềm khai thác trứng theo tỷ lệ trứng loại A,B,C thu được/BT Khảo sát ảnh hưởng mùa lên kích thước trứng loại A, B sau thu Thí nghiệm tiến hành cá thể lợn Bản có độ tuổi, chế độ chăm sóc ni dưỡng, có khối lượng từ 20-25 kg 3.1.1 Đặc điểm hình thái, kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa Bảng 3.1 Kích thước khối lượng buồng trứng lợn Bản theo mùa Số Mùa xuân Mùa hạ Mùa Thu Mùa đông BT(n) ( TB±SEM) ( TB±SEM) ( TB±SEM) ( TB±SEM) Chiều dài 10 (17±0,8)a (15±1)b (15,2±0,6)b (17,4±0,8)a (mm) Chiều rộng 10 (12,2±0,3)a (10,9±0,7)b (11,3±0,4)b (11,9±0,5)a (mm) Chiều dầy 10 (8,1±0,4)a (6,3±0,3)b (7±0,3)b (8±0,5)a (mm) Khối lượng 10 (2,4±0,1)a (2.0±0,2)b (2,1±0,2)b (2,3±0,2)ab (g) Thí nghiệm lặp lại lần, lần thu buồng trứng từ lợn cái.Số liệu với thích khác (a,b) hàng sai khác có ý nghĩa thống kê (P