Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ dioxin ở biên hòa, đồng nai và đánh giá khả năng phân hủy của một số chủng phân lập

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHẠM QUANG HUY NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI SINH VẬT TRONG MẪU ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Ở BIÊN HÒA, ĐỒNG NAI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA MỘT SỐ CHỦNG PHÂN LẬP LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2021 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHẠM QUANG HUY NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI SINH VẬT TRONG MẪU ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Ở BIÊN HÒA, ĐỒNG NAI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA MỘT SỐ CHỦNG PHÂN LẬP Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà Viện Công nghệ sinh học TS Nguyễn Kim Thoa Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2021 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Đặng Thị Cẩm Hà TS Nguyễn Kim Thoa, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt sở vật chất động viên tơi lúc khó khăn để tơi thực hồn thành luận án Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn tập thể cán Phịng Cơng nghệ sinh học tái tạo mơi trường tận tình giúp đỡ tơi q trình thực luận án Tơi xin chân thành cảm ơn hỗ trợ kinh phí từ đề tài độc lập cấp nhà nước: “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nhằm tìm kiếm gen, enzyme có khả phân hủy dioxin” PGS TS Đặng Thị Cẩm Hà chủ nhiệm Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào tạo, Viện Cơng nghệ sinh học tận tình hướng dẫn tơi hồn thành thủ tục suốt q trình học tập làm nghiên cứu sinh Viện Cuối cùng, xin gửi tới người thân gia đình bạn bè biết ơn, đặc biệt bố mẹ dành cho tơi tình u thương sâu sắc tạo điều kiện tốt để tơi học tập hồn thành tốt nội dung luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày……tháng……năm 2021 NCS Phạm Quang Huy i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu, kết nêu luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Các thông tin trích dẫn luận án ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày……tháng……năm 2021 Tác giả NCS Phạm Quang Huy ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin 1.1.1 Đặc điểm ảnh hưởng chất diệt cỏ/dioxin tới môi trường người 1.1.2 Ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sân bay Biên Hòa Đà Nẵng 1.1.3 Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin đất ô nhiễm 1.2 Đa dạng VSV gene chức đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin 12 1.2.1 Đa dạng VSV hiếu khí ni cấy đất ô nhiễm 12 1.2.2 Đa dạng vi khuẩn kị khí ni cấy đất ô nhiễm dioxin 13 1.2.3 Đa dạng gene chức mã hóa cho enzyme tham gia phân hủy chất diệt cỏ/dioxin 18 1.3 Sử dụng công cụ metagenomic nghiên cứu đa dạng VSV ô nhiễm POPs 19 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu 27 iii 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.1.2 Các hóa chất thiết bị máy móc 29 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 30 2.1.4 Sơ đồ thí nghiệm 30 2.2 Phương pháp nghiên cứu 32 2.2.1 Thu thập bảo quản mẫu đất để nghiên cứu metagenome 32 2.2.2 Phân tích thành phần giới nồng độ dioxin mẫu nghiên cứu 32 2.2.3 Phân lập, phân loại VSV từ nguồn đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin 32 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính laccase laccase-like 33 2.2.5 Đánh giá phân hủy 2,3,7,8-TCDD đất ô nhiễm hỗn hợp VSV 34 2.2.6 Phương pháp tách chiết DNA metagenome 35 2.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng độ tinh DNA metagenome 35 2.2.8 Phân tích trình tự DNA metagenome C BHR 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39 3.1 Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin tổ hợp vi khuẩn, xạ khuẩn quy mơ phịng thí nghiệm 40 3.1.1 Vi khuẩn từ đất nhiễm dioxin phân lập được, định danh khả phân hủy dioxin tổ hợp chủng vi khuẩn có tiềm 40 3.1.2 Xạ khuẩn từ đất nhiễm dioxin phân lập, định danh khả phân hủy dioxin tổ hợp chủng xạ khuẩn tiềm 42 3.2 Đa dạng VSV gene chức từ trình tự DNA metagenome C BHR 46 3.2.1 Thu nhận DNA metagenome từ mẫu C BHR 46 iv 3.2.2 Trình tự, contig gene chức từ metagenome mẫu C BHR 47 3.2.3 Đa dạng VSV metagenome C BHR 49 3.2.4 Mối liên hệ số chi vi khuẩn với tổng độ độc đặc tính lý hóa đất 69 3.2.5 Đa dạng gene chức tham gia phân hủy xenobiotic metagenome C BHR 70 3.2.6 Nhóm gene mã hóa enzyme tham gia phân hủy, chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin 72 3.2.7 Gene tham gia vào phân hủy chuyển hóa xenobiotic từ metagenome phát 76 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 79 4.1 Đa dạng VSV gene chức từ trình tự DNA metagenome C BHR thu 79 4.2 Đa dạng gene chức tham gia phân hủy xenobiotic metagenome C BHR (một đường phân hủy khống hóa dioxin) 92 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 95 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 97 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 98 TÀI LIỆU THAM KHẢO 105 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Hiệu suất phân hủy dioxin đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tổ hợp chủng vi khuẩn 42 Bảng 3.2 Hiệu suất phân hủy dioxin đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin chủng XKBHA22 45 Bảng 3.3 Hiệu suất phân hủy dioxin đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tổ hợp chủng xạ khuẩn 45 Bảng 3.4 Trình tự read chất lượng cao 47 Bảng 3.5 Lắp ráp de novo trình tự DNA metagenome C, BHR 48 Bảng 3.6 Phân bố gene từ trình tự DNA metagenome C, BHR 48 Bảng 3.7 Đa dạng mức độ phân loại metagenome C BHR 52 Bảng 3.8 Một số chi có đại diện chứng minh có khả phân huỷ chất diệt cỏ/ dioxin 57 Bảng 3.9 Đa dạng nấm sợi nấm đảm metegenome C BHR 66 Bảng 3.10 Số lượng trình tự tương đồng cao với gene chức tập liệu chuẩn hóa 71 Bảng 3.11 Số lượng trình tự liên quan đặc thù tới đường phân 2,4D polychlorinated biphenyl (PCB) dựa sở liệu KEEG 72 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học PCDD, PCDF PCB Hình 1.2 Cơ chế tạo 2,3,7,8-TCDD trình tổng hợp 2,4,5-T Hình 1.3: Các đường chuyển hóa, phân hủy, khống hóa hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin chất trao đổi chất phương pháp sinh học Hình 1.4 Nghiên cứu theo hướng -Omics sinh học 20 Hình 1.5 Các bước thực phân tích metagenomic 22 Hình 2.1 Mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (ký hiệu C) 27 Hình 2.2 Mặt cắt dọc lơ xử lý 28 Hình 2.3 Mẫu đất lô xử lý công nghệ phân hủy sinh học (ký hiệu BHR) 28 Hình 2.4 Sơ đồ thực nghiên cứu 31 Hình 2.5 Quy trình phân tích liệu DNA metagenome hệ thống MG RAST 37 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn BHBi1, BHBi4, BHBi5, BHBi7 BHO9 từ mẫu làm giàu môi trường MSM chứa dịch chiết đất 40 Hình 3.2 Hình thái tế bào chủng vi khuẩn kính hiển vi điện tử quét 41 Hình 3.3 Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn 41 Hình 3.4 Khả phân hủy chất diệt cỏ/dioxin đất tổ hợp vi khuẩn A: Đối chứng (khơng có VSV); B: Tổ hợp chủng vi khuẩn 42 Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc chủng xạ khuẩn sinh trưởng chúng môi trường Gause M chứa DCĐ 43 vii Hình 3.6 Cây phát sinh chủng lồi chủng xạ khuẩn XKBH921 43 Hình 3.7 Khả sinh tổng hợp laccase- like chủng xạ khuẩn 44 Hình 3.8 Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin đất tổ hợp xạ khuẩn 45 Hình 3.9 Điện di đồ DNA mẫu nghiên cứu gel agarose 47 Hình 3.10 Đa dạng mức độ khác metagenome C (vịng ngồi) BHR (vịng trong) sở liệu RefSeq 51 Hình 3.11 Đa dạng vi khuẩn mức độ ngành metagenome C BHR 52 Hình 3.12 Đa dạng vi khuẩn mức độ lớp metagenome C BHR 53 Hình 3.13 Đa dạng vi khuẩn mức độ metagenome C BHR 54 Hình 3.14 Đa dạng vi khuẩn mức độ họ metagenome C BHR 55 Hình 3.15 Đa dạng vi khuẩn mức độ chi metagenome C BHR 56 Hình 3.16 Đa dạng vi khuẩn cổ mức độ ngành metagenome C BHR 63 Hình 3.17 Đa dạng vi khuẩn cổ mức độ lớp metagenome C BHR 63 Hình 3.18 Đa dạng vi khuẩn cổ mức độ chi metagenome C BHR 63 Hình 3.19 Đa dạng vi khuẩn cổ sinh metan metagenome C BHR 65 Hình 3.20 Đa dạng vi khuẩn cổ ưa mặn metagenome C BHR 65 Hình 3.21 Các chi vi khuẩn có tỷ lệ chiếm ưu chênh lệch metagenome mẫu C BHR 70 Hình 3.22 Tương quan gene liên quan đến chuyển hóa xenobiotic metagenome C BHR 71 viii PHỤ LỤC II: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 2.1 Đặc tính thổ nhưỡng hai khu vực lấy mẫu Điều kiện thổ nhưỡng giúp bổ sung, củng cố giải thích rõ kết đa dạng VSV phân tích metagenome Các tiêu gồm: pH, nhiệt độ, độ ẩm, độ mùn, hàm lượng nitơ, cacbon tổng số, asen đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin xác định Số liệu sau phân tích thống kê Bảng 3.1 Độ ẩm mẫu thấp (