Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống dây thìa canh (gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP ĐÀO THỊ THÚY HẰNG XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU ADN MÃ VẠCH VÀ NHÂN GIỐNG DÂY THÌA CANH (GYMNEMA SYLVESTRE) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 842 02 01 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN VĂN VIỆT Hà Nội, 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tôi, hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Văn Việt Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa cơng bố hình thức Luận văn sử dụng thông tin, số liệu từ báo nguồn tài liệu tác giả khác có trích dẫn thích nguồn gốc đầy đủ Nếu có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Học viên Đào Thị Thúy Hằng ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp trang bị kiến thức cho tơi suốt q trình học tập Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Việt tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu đề tài hoàn chỉnh Luận văn Thạc sĩ Tôi xin cảm ơn cán Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp ln sát cánh hỗ trợ động viên vật chất tinh thần suốt trình học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 11 tháng 11 năm 2018 Học viên Đào Thị Thúy Hằng iii M CL C LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii M C L C .iii DANH M C CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH M C BẢNG .vi DANH M C BIỂU ĐỒ .vii DANH M C H NH viii ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Chi Gymnema .3 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố chi Gymnema .3 1.1.2 Các loài thuộc chi Gymnema 1.1.3 Các loài thuộc chi Gymnema Việt Nam 1.2 Giới thiệu chung Dây thìa canh 1.2.1 Nguồn gốc, phân loại 1.2.2 Đặc điểm thực vật học Dây thìa canh 1.3 Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào 1.3.1 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật.8 1.3.2 Các bước tiến hành phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.4 Thành tựu nuôi cấy mơ tế bào dược liệu Dây thìa canh .10 1.4.1 Nghiên cứu nước 10 1.4.2 Thế giới 12 1.5 Tổng quan mã vạch ADN 12 1.5.1 Giới thiệu mã vạch ADN (DNA barcode) 12 1.5.2 Một số locus sử dụng làm thị mã vạch ADN thực vật .14 1.5.3 Tình hình nghiên cứu mã vạch ADN thực vật 18 Chƣơng M C TIÊU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Mục tiêu tổng quát 22 2.2 Mục tiêu cụ thể 22 2.3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 22 iv 2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.3.2 Hóa chất 22 2.3.3 Dụng cụ - máy móc 23 2.4 Nội dung phương pháp nghiên cứu .24 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.4.3 Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá 31 2.4.4 Phương pháp theo dõi .32 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu .32 2.5 Địa điểm thời gian bố trí thí nghiệm 32 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .33 3.1 Xây dựng sở liệu ADN mã vạch Dây thìa canh 33 3.1.1 ết tách chiết D t ng số 33 3.1.2 Kết PCR đoạn mã vạch ADN .34 3.1.3 Phân tích trình tự đoạn mã vạch ADN với đoạn mồi khác 37 3.2 Kết nhân giống Dây thìa canh phương pháp ni cấy in vitro 41 3.2.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% tỷ lệ tạo mẫu tái sinh chồi 41 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả nhân nhanh chồi 43 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ B P đến nhân nhanh chồi 45 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BAP, Kinetin NAA đến nhân nhanh chồi 47 3.2.5 Ảnh hưởng hàm lượng sucrose đến khả rễ 50 3.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ IB đến khả rễ 51 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PH L C MS BAP KIN IBA -NAA CT ĐC ĐHST WPM CS TB vi DANH M C BẢNG Bảng 1.1 Vị trí phân loại chi Gymnema Bảng 2.1 Trình tự thơng tin cặp mồi đặc hiệu 23 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 2.3 Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR 26 Bảng 2.4 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến kết tạo mẫu 28 Bảng 2.5 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi .29 Bảng 2.6 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến nhân nhanh chồi .29 Bảng 2.7 Ảnh hưởng nồng độ BAP, Kinetin α-NAA đến nhân nhanh chồi30 Bảng 2.8 Ảnh hưởng hàm lượng sucrose đến khả rễ 30 Bảng 2.9 Ảnh hưởng tổ hợp nồng độ IBA NAA đến khả rễ 31 Bảng 3.1 Đánh giá ba vùng ADN đề xuất 36 Bảng 3.2 Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu tái sinh chồi 41 Bảng 3.3 Kết ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả nhân nhanh chồi .43 Bảng 3.4 Kết ảnh hưởng nồng độ BAP đến nhân nhanh chồi 45 Bảng 3.5 Kết ảnh hưởng nồng độ BAP, Kinetin NAA đến nhân nhanh chồi .48 Bảng 3.6 Kết ảnh hưởng hàm lượng sucrose đến khả rễ 50 Bảng 3.7 Kết ảnh hưởng nồng độ IBA NAA đến khả rễ .52 vii DANH M C BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến tỷ lệ tạo mẫu tái sinh chồi 42 Biểu đồ 3.2 a Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến tỷ lệ tạo cụm chồi 44 Biểu đồ 3.2 b Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi44 Biểu đồ 3.3 a Ảnh hưởng nồng độ BAP đến tỷ lệ tạo cụm chồi 46 Biểu đồ 3.3 b Ảnh hưởng nồng độ BAP đến nhân nhanh chồi 46 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng nồng độ BAP, Kinetin NAA đến nhân nhanh chồi 48 Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng hàm lượng sucrose đến khả rễ 51 Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng nồng độ IAA NAA đến khả rễ .52 viii DANHM CH NH Hình 1.1 Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Sehunlt Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng số mẫu Dây thìa canh 33 Hình 3.2 Kết nhân đoạn gen psbA-trnH từ mẫu Dây thìa canh thu dùng mồi P10 34 Hình 3.3 Kết nhân đoạn gen trnL từ mẫu Dây thìa canh thu dùng mồi p11 35 Hình 3.4 Kết nhân đoạn gen ITS1 từ mẫu Dây thìa canh dùng mồi p12 35 Hình 3.5 Vị trí nucleotide sai khác so sánh vùng psbA-trnH .38 Hình 3.6 Vị trí nucleotide sai khác so sánh vùng trnL 39 Hình 3.7 Vị trí nucleotide sai khác so sánh vùng ITS1 40 Hình 3.8 Mẫu tái sinh chồi mơi trường dinh dưỡng MS 42 Hình 3.9 Một số hình ảnh Dây thìa canh thí nghiệm 46 Hình 3.10 Một số hình ảnh Dây thìa canh giai đoạn nhanh nhanh chồi 49 Hình 3.11 Dây thìa canh hồn chỉnh 53 ĐẶT VẤN ĐỀ Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) đánh giá dược liệu quan trọng chiến lược phát triển thảo dược Việt Nam Thành phần hóa học có hoạt tính sinh học dây thìa canh axit gymnemic, hoạt chất thuộc nhóm saponin triterpenoid Ngồi ra, Dây thìa canh chứa thành phần khác flavone, anthraquinone, hentriacontane, pentatriacontane, α β-chlorophylls, phytin, resins, d-quercitol, axít tartaric, axit formic, axit butyric, lupeol Axit gymnemic có tác dụng kích thích sản sinh tế bào beta tuyến tụy, giúp thể tái thiết lập khả cân đường huyết tự nhiên; ức chế hấp thu đường ruột; ức chế gan tân tạo glucose vào máu, đồng thời kích thích enzyme chịu trách nhiệm tiêu thụ, sử dụng đường mô Lá dây thìa canh sử dụng rộng rãi điều trị đái tháo đường thuốc lợi tiểu khắp giới, đặc biệt Ấn Độ, Việt Nam số nước khác Một số hợp chất hoạt tính sinh học phân lập từ thảo dược để chữa bệnh tiểu đường Ngồi sử dụng chống đầy khó tiêu, táo bón, vàng da, bệnh trĩ, bệnh tim, hen suyễn, viêm phế quản Hiện nhu cầu người nguồn dược liệu ngày tăng, nhiên loài tự nhiên bị giảm số lượng chất lượng khai thác mức, điều kiện ngày bất lợi môi trường tự nhiên, nên việc nghiên cứu nhân giống bảo tồn cần thiết, cấp bách việc lưu giữ nguồn gen quý Mã vạch ADN đoạn ADN ngắn, nằm hệ gen (nhân, lục lạp ty thể) đặc trưng lồi sinh vật Do việc xác định lồi mã vạch ADN có độ xác cao Phương pháp trở thành công cụ hữu hiệu cho nhà khoa học việc phân loại, đánh giá đa dạng di truyền quan hệ di truyền loài 52 Bảng 3.7 Kết ảnh hƣởng nồng ộ IBA NAA CTTN IBA ĐC RT1 RT2 RT3 RT4 RT5 RT6 RT7 Ghi chú: Chữ khác bảng thống kê α = 0,05 phép phân tích SPSS 100 90 80 70 60 50 40 30 19,68 20 10 ĐCRT1RT2RT3RT4 Biểu 3.6 Ảnh hƣởng nồng 53 Kết thu (bảng 3.7 biểu đồ 3.6) cho thấy, mẫu cấy cơng thức mơi trường rễ, chồi in vitro cấy mơi trường khống MS khơng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng (R 0), tỷ lệ rễ thấp đạt 19,68 %, số rễ trung bình đạt 0,4 rễ/cây, chiều dài trung rễ 0,63 cm, rễ màu trắng nhạt, mảnh Các cơng thức mơi trường có sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật với liều lượng khác (0,2 - 0,6 mg/l) IBA (RT 1RT3) cho tỷ lệ rễ cao RT đạt 96,54%, số rễ trung bình đạt 3,56 rễ/cây chiều dài rễ trung bình đạt 3,9 cm Cơng thức mơi trường bổ sung (0,2 - 0,6 mg/l) NAA (RT4 - RT6) có tỷ lệ chồi rễ đạt 61,35 đến 90,01%, với số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình/rễ cao 2,26 rễ; 3,13 cm (RT 6) Thí nghiệm bổ sung đồng thời IBA NAA (RT 7) cho tỷ lệ rễ đạt 88,52%, với số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình/rễ 2,11 rễ; 2,87 cm Như vậy, chọn công thức môi trường RT môi trường MS bổ sung 0,6 mg/l IBA phù hợp cho ni cấy rễ tạo hồn chỉnh Dây thìa canh Kết xử lý thống kê cho thấy khác có ý nghĩa Tạo rễ môi trường khác Tạo rễ môi trường RT3 Hình 3.11 Dây thìa canh hồn chỉnh 54 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ Kết luận Đã xác định trình tự nucleotide đoạn gen trnH- PsbA, trnL ITS1 sản phẩm PCR có kích thước tương ứng 565bp, 567bp 767bp sai khác 01 cặp nucleotide đoạn gen so với trình tự gen trnH-PsbA, trnL ITS1 loài thuộc chi Gymnema, với mã số NCBI là: MF064898.1, KE953920.1 MG730191.1 Nghiên cứu nhân giống in vitro Dây thìa canh đạt số kết sau: Khử trùng mẫu cành Dây thìa canh khử trùng kép dung dịch HgCl2 0,1% phút Nuôi cấy mơi trường khống MS bổ sung 0,2 mg/l BAP, 30 g/l sucrose, 6,5 g/l agar đạt tỷ lệ mẫu 72,15%, tỷ lệ tái sinh 68,25% Nhân nhanh chồi Dây thìa canh mơi trường khống MS bổ sung 1,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l Kinetin, 0,1 mg/l NAA, 100 ml/l nước dừa, 100 g/l khoai tây, 6,5 g/l agar, 30 g/l sucrose, cho tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi 96,66%, số chồi trung bình mẫu 3,45 chồi, chiều cao chồi 4,23 cm, chồi cao, mập, màu xanh đậm Kích thích rễ tạo hồn chỉnh mơi trường khống MS bổ sung 0,6 mg/l IBA, 100 ml/l nước dừa, 100 g/l khoai tây, 20 g/l sucrose, 6,5 g/l agar Tỷ lệ rễ đạt 96,54%, số rễ trung bình đạt 3,56 rễ/cây với chiều dài rễ 3,90 cm Kiến nghị - Đăng kí trình tự đoạn mã vạch nghiên cứu ngân hàng gen quốc tế NCBI 55 - Tiếp tục nghiên cứu thiết kế cặp mồi thích hợp cho việc nhân gen để tiến hành giải trình nucleotide xác định đoạn ADN đặc trưng gen cịn lại từ mẫu ADN dây thìa canh - Tiếp tục nghiên cứu với nhiều thang nồng độ chất điều hòa sinh trưởng để nhân nhanh chồi rễ tạo hoàn chỉnh để đưa công thức phù hợp cho hệ số nhân nhanh chồi rễ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Thế Bách (2007), ghiên cứu phân loại Họ Thiên Lý Việt am, Lu án Tiến sỹ Sinh học, Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Võ Văn Chi (2007), Sách tra cứu tên cỏ Việt am, NXB Khoa học thuật Hà Nội, tr.283-284 Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt am (Tập 2), NXB Trẻ, tr 671-703 Hà Văn Huân (2015), Nghiên cứu ứng dụng thị phân tử ADN (mã vạch DNA) phân tích đa dạng di truyền giám định sinh vật Việt Nam, Ngân hàng liệu DNA Việt Nam Huỳnh Văn Kéo, Ngô Viết Nhơn (2006), Nghiên cứu bảo tồn nguồn gen thực vật vườn quốc gia Bạch Mã Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, 1(2): 127-129 Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2003), Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật phục hồi loài gỗ quý Giá tỵ, Những vấn đề sống khoa học sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, 25-26/7/2003, NXB Khoa học Kỹ thuật, 352-357 Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2003), Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật phục hồi loài đặc sản Trầm hương Những vấn đề sống khoa học sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, 2526/7/2003, NXB Khoa học Kỹ thuật, 358-361 Lưu Trường Sinh, Hoàng Văn Lương (2005), Nghiên cứu hồn thiện quy trình nhân nhanh Trinh nữ hoàng cung phương pháp in vitro Những vấn đề sống khoa học sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, Hà Nội 3/11/2005, NXB Khoa học Kỹ thuật, 722-724 10 Nguyễn Quang Thạch (2000) Giáo trình sinh lý thực vật Nxb Nông nghiệp Hà Nội 57 11 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2000) Bài giảng môn học công nghệ sinh học thực vật - Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội 12 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình Công nghệ sinh học nông nghiệp, NXb Nông Nghiệp Hà Nội 13 Đinh Thị Thu Thủy (2014), Đánh giá tác dụng hạ glucose máu dịch chiết loài chi Gymnema R.Br Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội 14 Phạm Hà Thanh Tùng (2012), Nghiên cứu tính đa dạng thực vật thành phần hoá học loài chi Gymnema R.Br Việt nam, Luận văn thạc sĩ dược học, Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội 15 Nguyễn Văn Uyển (1993) uôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng Nxb Nông nghiệp, tr 23-44 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 16 Baskaran et al (1990), “Antidiabetic effect of a leaf extract from Gymnema sylvestre in non-insulin dependent diabetes mellitus patients”, Journal of Ethnopharmacology 30(3), pp 295-300 17 Balaraju K, Agastian P, Preetamraj JP, Arokiyaraj S, Ignaciumthu S (2008), Micropropagation of Vitex agnuscatus (Verbenaceae) - Avaluable medicinal plant In vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 44(5): 436-411 18 Baharum, S.N (2012), “Application of 16s rDNA and cytochrome b ribosomal markers in studies of lineage and fish populations structure of aquatic species”, Molecular biology reports, 39 (5), pp 5225-5232 19 Brown, B, Emberson R.M, and Paterson A.M (1999), “Mitochondrial COI and II provide useful markers for Wiseana (Lepidoptera: Hepialidae) species identification”, Bulletin of Entomological Research, 89 (04), pp 287-293 20 Casiraghi, M, Labra M, Ferri E, Galimberti A, and De Mattia F (2010), “DNA barcoding: theoretical aspects and practical applications” 21 Chase, M.W, Cowan R.S, et al (2007),“A proposal for a standardised protocol to barcode all land plants”, Taxon, 56 (2), pp 295-299 58 22 Chen, S, Yao H, et al (2010), “Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species”, PloS one, (1), pp e8613 23 Chiou, S.-J, Yen J.-H, Fang C.-L, Chen H.-L, and Lin T.-Y (2007), “Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers”, Planta medica, 73 (13), pp 1421-1426 24 Chase M W, Nicolas S, Mike W, James M D, Rao P K., Nadia H., and Vincent S (2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462): 1889 - 1895 25 Fazekas, A.J., Burgess K.S., et al (2008), “Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well”, PLoS One, (7), pp e2802 26 Ford, C.S, Ayres K.L, et al (2009), “Selection of candidate coding DNA barcoding regions for use on land plants”, Botanical Journal of the Linnean Society, 159 (1), pp 1-11 27 Group, C.P.W, Hollingsworth P.M, et al (2009), “A DNA barcode for land plants”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 106 (31), pp 12794-12797 28 Havens K, Guerrant E, Maunder M (1999), Strategies for survival: Ex situ Plant conservation Report of a research symposium held at the Chicago Botanic Garden, BG Journal, 3(3) 29 Hebert, P.D, Cywinska A, and Ball S.L (2003), “Biological identifications through DNA barcodes”, Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 270 (1512), pp 313-321 30 Hebert, P.D, Penton E.H, Burns J.M, Janzen D.H, and Hallwachs W (2004), “Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101 (41), pp 14812-14817 31 Hebert, P.D, Ratnasingham S, and De Waard J.R (2003), “Barcoding animal life:cytochrome c oxidase subunit divergences among closely related 59 species”, Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 270 (Suppl 1), pp S96-S99 32 Hollingsworth, M.L, Andra Clark A, et al (2009), “Selecting barcoding loci for plants: evaluation of seven candidate loci with species- level sampling in three divergent groups of land plants”, Molecular Ecology Resources, (2), pp 439457 33 Hollingsworth, P.M (2011), “Refining the DNA barcode for land plants”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 108 (49), pp 19451-19452 34 Hollingsworth, P.M, Graham S.W, and Little D.P (2011), “Choosing and using a plant DNA barcode”, PloS one, (5), pp e19254 35 Joshi M, Dhar U (2003), In vitro propagation of Saussurea obvallata Edgew An endangered ethnoreligious medicinal herb of Himalaya, Plant Cell Rep, 21(10): 933-939 36 K Grover et al (2002), “Medicinal plants of India with anti-diabetic potential”, Journal of Ethnopharmacology 81, pp 81-100 37 Kapoor LD (1990), “Handbook of Ayurvedic Medicinal Plants”, Boca Raton, F.L, CRC Press, pp 200-201 38 Lee H, Yi D, Kim J, and Kim K, Development of plant DNA barcoding markers from the variable noncoding regions of chloroplast genome in Abstract presented at the second international barcode of life conference Academia Sinica, Taipei, Taiwan 2007 39 Logacheva M, Penin A, Samigullin T, Vallejo-Roman C, and Antonov A (2007), “Phylogeny of flowering plants by the chloroplast genome sequences: in search of a “lucky gene””, Biochemistry (Moscow), 72 (12), pp 1324-1330 40 N Shigematsu et al (2001), “Effect of administration with the extract of Gymnema sylvestre R.Br leaves on lipid metabolism in rats”, Biol Pharm Bull 24(6), 713-717 41 Nerea Larranaga and José L Hormaza (2015), “DNA barcoding of perennial fruit tree species of agronomic interest in the genus Annona ( Annonaceae) 60 42 Park SU, Kim YK, Lee SY (2009), Improved in vitro plant regeneration and micropropagation of Rehmannia glutinosa L Journal of Medicial Plants Research, 3(1): 031-034 43 Pereira AM, Amui SF, Bertoni BW, Moraes RM, Franca SC (2003), Micropropagation of Anemopaegma arvense: Conservation of an endangered madicinal plant, Plant Med, 69(6): 571-573 44 Schoch, C.L, Seifert K.A, et al (2012), “Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 109 (16), pp 6241- 6246 45 Scharaschklin T, Doyle J.A.( 2005), Phylogeny and historical biogeography of Anaxagorea (Annonaceae) using morphology and noncoding chloroplast sequence data Syst Bot 30: 712–735 46 Shaw J, Lickey E.B, Schilling E E, Small R.L (2007), “Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (94): 275288 47 Takhtajan (2009), "Flowering Plants", Springer Verlag 48 Taberlet P, Eric C, Franỗois P, Ludovic G, Christian M, Alice V, Thierry V, Gérard C, Christian B, and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3): 14 49 Van den Berg C, Higgins W E, Dressler R L, Whitten W M, Soto Arenas M A, Culham A, Chase M W (2000), “A phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (ITS) of ribosomal DNA”, Lindleyana 15: 96114 50 Van DeWiel C C M, Van Der Schoot J, Van Valkenburg J L, Duistermaat C H, Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from noninvasive relatives”, Molecular Ecology Resources 9: 1086-1091 61 51 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, 99: 1530 – 1540 52 Wu Z Y & P H Raven (1995), “Flora of China Vol 16 (Gentianaceae through Boraginaceae)”, Science Press, Beijing, and Missouri Botanical Garden Press, St Louis pp.479 53 Wang W, Wu Y, Yan Y, Ermakova M, Kerstetter R (2010), “DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology 10: 205 54 Wu F, Mueller L A, Crouzillat D, Petiard V, TanksleyS.D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Genetics, 174: 1407-1420 55 Yu, J, Xue J.H, and Zhou S.L (2011), “New universal matK primers for DNA barcoding angiosperms”, Journal of Systematics and Evolution, 49 (3), pp 176-181 56 Yao H, Song J, Liu C, Luo K, Han J (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE, 5: 13102 57 Yong H L, Jinlan R, Shilin C, Jingyuan S, Kun L, Dong L and Hui Y (2010), “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research, 4(24): 2706-2709 TÀI LIỆU TIẾNG PHÁP 58 Lecomte Henri, Humbert Henri, Gagnepain F (1914), Flore g n rale de l'IndoChine, Tome quatri me, scl piadac es marantac es, Masson et Cie, Paris TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN 59 List the plant (2010), „ Vertionl1: publish on the internet http://www.theplantlish.org/" PH L C Phụ lục Thành ph n môi trƣờng MS Dung dịch mẹ 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Dung dịch mẹ 20 21 22 23 24 25 26 27 28 ... liệu ADN mã vạch cho loài Dây thìa canh nhằm xác định lồi phục vụ bảo tồn phát triển dược liệu, tiến hành nghiên cứu: Xây dựng sở liệu ADN mã vạch nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) phương. .. dạng sinh học 22 Chƣơng M C TIÊU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu tổng quát Xây dựng sở liệu ADN mã vạch nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) phương pháp nuôi cấy in vitro... phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Xây dựng sở liệu ADN mã vạch lồi Dây thìa canh Tách chiết ADN tổng số từ mẫu Dây thìa canh Nhân đoạn gen trnL, ITS1, PsbA-trnH phương pháp