Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ dioxin ở biên hòa, đồng nai và đánh giá khả năng phân hủy của một số chủng phân lập TT

viện hàn lâm khoa học công nghệ việt nam viƯn c«ng nghƯ sinh häc PHẠM QUANG HUY NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI SINH VẬT TRONG MẪU ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Ở BIÊN HÒA, ĐỒNG NAI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA MỘT SỐ CHỦNG PHÂN LẬP Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 42 01 07 tóm tắt luận án tiến sĩ sinh häc hµ néi - 2021 Cơng trình hồn thành Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đặng Thị Cẩm Hà Viện Công nghệ sinh học TS Nguyễn Kim Thoa Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án phiên thức Viện Cơng nghệ sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Công nghệ sinh học - Trang web Bộ GD&ĐT MỞ ĐẦU Gần 50 năm sau chiến tranh, 100 triệu lít thuốc diệt cỏ chứa 2,3,7,8tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD đồng phân dioxin độc với độ độc tương đương phun rải tồn lưu miền nam Việt Nam Hỗn hợp chất độc khu vực ô nhiễm khiến môi trường tự nhiên bị phá hủy, sức khỏe di truyền bệnh nhân phơi nhiễm bị ảnh hưởng qua nhiều hệ, hệ vi sinh vật (VSV) bị thay đổi mà chưa thể lượng giá Do đó, nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nói riêng ô nhiễm hợp chất hữu khó phân hủy (POPs) nói chung cần phải loại bỏ theo cơng ước Stockholm Trong 20 năm trở lại đây, số lượng nghiên cứu liên quan tới khả phân hủy chất diệt cỏ/dioxin VSV phân lập được, số lượng enzyme tham gia vào đường chuyển hóa đa dạng VSV không thông qua nuôi cấy (sử dụng phương pháp đa hình cấu hình sợi đơn (Single-Strand Conformation Polymorphism SSCP, điện di gel građient biến tính biến tính (denaturing gradient gel electrophoresis - DGGE, nhân gene theo thời gian thực (real time Polymerase Chain Reaction – RT PCR) tăng dần Quy mô thử nghiệm triển khai công nghệ xử lý khử độc phân hủy sinh học (Bioremediation) tăng dần từ pilot 0,5 m – 100 m3 sân bay Đà Nẵng tới quy mô trường 3.384 m3 sân bay Biên Hòa Qua cơng bố cập nhật, VSV có khả nuôi cấy chiếm tỷ lệ thấp từ 0,001 đến 0,1% cho thấy hạn chế phương pháp nghiên cứu truyền thống thực thập niên qua Do đó, việc áp dụng công cụ nghiên cứu đại trở nên cần thiết để bước hiểu rõ đa dạng chất cấu trúc quần xã VSV để từ cải tiến quy trình cơng nghệ có nhằm rút ngắn thời gian nâng cao hiệu suất xử lý ô nhiễm hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin tồn đọng Việt Nam loại chất hữu khó phân hủy (POPs) khác giới Giải trình tự phân tích ngun liệu di truyền cách tách DNA trực tiếp từ mẫu đất ô nhiễm không thông qua nuôi cấy hệ thống máy công cao hệ Hiseq Illumina phần mềm tin sinh chuyên dụng khắc phục hạn chế phương pháp nghiên cứu truyền thống Bởi kết thu cung cấp thơng tin chi tiết đa dạng VSV từ ngành, lớp, bộ, họ, chi loài hệ gene chức tồn đa dạng protein giả định đường chuyển hóa metagenome mẫu nghiên cứu Vì vậy, thời điểm sử dụng công cụ metagenomic với mẫu đất liên quan tới ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin cung cấp tranh đầy đủ chủng loài mối quan hệ quần xã vi sinh vật nhằm nâng cao hiệu suất xử lý khử độc công nghệ phân hủy sinh học không áp dụng ô nhiễm dioxin mà với POPs khác Với lý trên, luận án nghiên cứu sinh thực nghiên cứu Việt Nam sử dụng công cụ nghiên cứu đại với đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin sân bay Biên Hòa thuộc đối tượng đất đặc thù thành phần hóa học phức tạp để tách làm DNA đủ chất lượng đáp ứng yêu cầu nghiên cứu Mẫu khu vực chọn để nghiên cứu metagenome gồm: đất từ khu Tây Nam Biên Hịa bị nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin có độ độc trung bình 21.605 ng TEQ/kg đất xử lý làm sau 60 tháng khu chơn lấp Z1 có độ độc trung bình 13,2 ng TEQ/kg Tên luận án nghiên cứu sinh là: ”Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin Biên Hòa, Đồng Nai đánh giá khả phân hủy số chủng phân lập” Kết đa dạng đặc điểm cấu trúc quần xã khả phân hủy dioxin số đại diện trình bày luận án phần số liệu thu từ đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nhằm tìm kiếm gene, enzyme có khả phân hủy dioxin” PGS TS Đặng Thị Cẩm Hà chủ nhiệm nghiệm thu năm 2019 Mục tiêu - Đánh giá đa dạng VSV (i) mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (ii) mẫu đất xử lý làm công nghệ phân hủy sinh học lô “Chôn lấp tích cực” sau 60 tháng sân bay Biên Hịa, Đồng Nai, Việt Nam cơng cụ metagenomic; - Đánh giá khả phân hủy hiếu khí dioxin đất ô nhiễm nặng hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin tổ hợp vi khuẩn tổ hợp xạ khuẩn (XK) phân lập lựa chọn từ mẫu đất nghiên cứu Nội dung nghiên cứu - Thu thập, bảo quản, phân tích thành phần giới mẫu đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sân bay Biên Hòa; - Tách chiết, tinh DNA từ mẫu nghiên cứu xác định trình tự DNA máy giải trình tự cơng cao hệ Illumina Hiseq 2500; - Phân tích, đánh giá đa dạng VSV, đa dạng gene chức giả định từ liệu metagenome mẫu nghiên cứu; - Đánh giá khả phân hủy hiếu khí dioxin đất nhiễm nặng tổ hợp vi khuẩn xạ khuẩn phân lập từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin 3 Những đóng góp luận án - Đây cơng trình Việt Nam sử dụng công cụ metagenomic nghiên cứu đa dạng VSV đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin, đất xử lý khử độc sân bay quân Biên Hòa phát đa dạng quần xã vi khuẩn, vi khuẩn cổ ưa mặn, loại halogen với số lượng gene chức laccase laccase-like tham gia vào phân hủy hợp chất xenobiotic đa dạng nấm sợi, nấm men nấm đảm; - Bổ sung sở khoa học giải thích thành cơng cơng nghệ phân hủy sinh học thực sân bay Biên Hịa khả cải tiến qui trình công nghệ, nâng cao hiệu suất xử lý khử độc hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin có tổng độ độc cao số loại hình nhiễm POPs khác Bố cục luận án Luận án gồm 152 trang: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (23 trang, hình); Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (12 trang, hình); Chương 3: Kết nghiên cứu (40 trang, 11 bảng, 22 hình); Chương 4: Bàn luận kết nghiên cứu (16 trang); Kết luận kiến nghị (2 trang); Danh sách cơng trình cơng bố (1 trang); Tóm tắt luận án tiếng Anh (7 trang); Tài liệu tham khảo (12 trang với tài liệu tiếng Việt, 101 tài liệu tiếng Anh) CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Dioxin hợp chất tương tự thuộc nhóm chất hữu khó phân hủy (POP) phải loại bỏ hồn tồn độc tính khả tồn bền vững chúng môi trường; Lượng chất diệt cỏ/dioxin tồn lưu đất chiến tranh hóa học Mỹ gây lớn Điểm nóng Đà Nẵng (Khu bắc sân bay – 361.000 ppt, khu Pacer Ivy – 20.600 ppt,) Biên Hòa (Khu Z1 - 1.578 ppt, khu Tây nam – 110.000 ppt, khu Pacer Ivy – 11.400 ppt, khu Đông bắc – 1.300 ppt, khu Tây bắc – 477 ppt) Sự biến động VSV hiếu khí Đà Nẵng Biên Hịa số lượng đa dạng chủng loài dao động lớn Quần xã VSV hay cá thể VSV khiết phân lập phân hủy hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin chất đa vòng thơm chứa clo hay khơng, chứa khác điều kiện hiếu khí kị khí khơng bắt buộc kị khí hồn tồn với hiệu suất khác nhau; Ở sân bay quân Đà Nẵng sử dụng phương pháp khử hấp thu nhiệt lưu chứa để loại bỏ dioxin 45.000 m bùn đất nhiễm Biên Hịa thực chơn lấp 90.000 m đất ô nhiễm khu vực Z1 xử lý thành cơng 3.384 m3 đất ô nhiễm 10.000 ngTEQ/kg công nghệ phân hủy sinh học (bioremediation) tổng độ độc 13.2 ngTEQ/kg đất khơ Q trình phân hủy sinh học xảy theo đường chủ yếu ba đường oxy hóa cắt vòng, loại clo hợp chất hữu thơm mở vòng xúc tác enzyme ngoại bào hay chất xúc tác khơng có cấu trúc enzyme hoạt động enzyme cần oxy đường thứ tư loại khử clo chất hữu đa vịng thơm (Hình 1.1) Tất trình nêu thực tập đoàn vi sinh vật địa tầng đất lơ “Chơn lấp tích cực” Các sản phẩn tạo theo đường khác phong phú giai đoạn điều kiện môi trường biến động tạo hội cho quần xã vi sinh vật hoạt động phân hủy, chuyển hóa sản phẩm cuối đường trao đổi chất nói chất vào chu trình Krebs trước khống hóa tới axit hữu cơ, n ước, CO2 sinh khối vi sinh vật Hình 1.1: Các đường chuyển hóa, phân hủy, khống hóa hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin chất trao đổi chất phương pháp sinh học Nghiên cứu đa dạng VSV liên quan đến loại hình nhiễm chất diệt cỏ/dioxin khả phân hủy chúng VSV địa dừng phương pháp truyền thống sinh học phân tử (SSCP DGGE) Nghiên cứu đa dạng quần xã VSV hỗ trợ thiết bị giải trình tự cơng cao phần mềm chuyên dụng cải tiến liên tục giúp khắc phục nhược điểm kỹ thuật nuôi cấy đánh giá cấu trúc quần xã VSV môi trường ô nhiễm tạo sở hướng đích tới cơng nghệ khử độc, làm hỗn hợp nhiễm chất đa vịng thơm có chất diệt cỏ/dioxin; Sự phát triển phần mềm tin sinh chuyên dụng kết hợp với phát triển, ứng dụng cơng cụ metagenomic nói riêng cơng cụ omics nói chung (metagenomic, metatranscriptomics, proteomics metabolomics) giúp phát khai thác VSV vùng ô nhiễm trình xử lý; Nghiên cứu metagenome đa dạng hệ VSV kị khí mẫu làm giàu đất bùn nhiễm chất diệt cỏ/dioxin Biên Hịa bước đầu thực (bằng hệ thống Miseq) Do đa dạng hệ VSV hiếu khí lớn nhiều so với kị khí nên kết thu tạo nên tranh tổng thể VSV vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin hệ enzyme tham gia đường chuyển hóa giả định CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu - Đối tượng nghiên cứu: Đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (ký hiệu mẫu C) khu Tây Nam sân bay Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai (10°58'14.3"N 106°48'19.3"E) đất xử lý chất diệt cỏ/dioxin sau 60 tháng công nghệ phân hủy sinh học lơ Chơn lấp tích cực (Bioremediation – ký hiệu mẫu BHR) khu Z1 (Khu thực dự án “Xử lý ô nhiễm dioxin vùng nóng Việt Nam” Bộ Quốc phịng thực Đồng Nai (10°57'46.4"N 106°49'22.6"E)) thu thập, bảo quản đảm bảo chất lượng để nghiên cứu tách DNA metagenome phân lập vi sinh vật - Hóa chất nghiên cứu: Đồng loại độc đồng phân dioxin 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD) cung cấp Cơng ty BEBasic (Hà Lan) từ phịng cung cấp hóa chất isotop chuẩn, Vương Quốc Anh 2.2 Phương pháp nghiên cứu Thu thập bảo quản mẫu đất để nghiên cứu metagenome theo phương pháp lấy mẫu đa điểm (MIS) Phân tích thành phần giới nồng độ dioxin mẫu nghiên cứu Phịng Phân tích Dioxin Độc chất, Trung tâm Quan trắc môi trường, Tổng cục Mơi trường theo EPA 8280A Phịng Phân tích trung tâm (CAL) thuộc Viện Thổ nhưỡng nơng hóa (SFRI) Phân lập, phân loại VSV từ nguồn đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin Phương pháp xác định hoạt tính enzyme laccase, laccase-like Đánh giá phân hủy 2,3,7,8-TCDD đất ô nhiễm hỗn hợp VSV Phương pháp tách chiết DNA metagenome trực tiếp có cải tiến theo phương pháp Bourrain, Zhou, Islam tách chiết DNA sử dụng Kit thương mại chuyên dụng PowerSoil® DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc.) có cải tiến Soil DNA Isolation Kit (Norgen Biotek Corp.), E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-tek) ; ; Xác định hàm lượng, độ tinh mẫu DNA metagenome điện di gel agarose , đo độ hấp thụ DNA bước sóng 260 nm định lượng DNA nhuộm huỳnh quang (Bolger cs, 1997) Phân tích trình tự DNA metagenome mẫu C BHR sử dụng hệ thống Illumina Hiseq 2500 công ty Baseclear, Hà Lan hệ thống MG-RAST Để thu kết nghiên cứu phù hợp với mục tiêu đề ra, bước thí nghiệm luận án thực theo sơ đồ hình 2.1 Hình 2.1 Sơ đồ thực nghiên cứu CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Mức độ đa dạng VSV metagenome mẫu đại diện mô tả mức độ ngành, lớp, bộ, họ, chi lồi có liên quan trực tiếp đến phân hủy dioxin chất tương tự Các chi phát ngành vi khuẩn, vi khuẩn cổ sinh vật nhân thật có mặt đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin Do số liệu thu lớn nên nội dung luận án tập trung vào kết quan trọng Vi sinh vật từ hai mẫu đất nghiên cứu ni cấy chọn để trình bày phần đầu chương kết nghiên cứu để chứng minh vai trị nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn hiếu khí q trình xử lý khử độc đất ô nhiễm hỗn hợp chất diệt cỏ /dioxin chất trao đổi chất khác 3.1 Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin tổ hợp vi khuẩn, xạ khuẩn quy mơ phịng thí nghiệm 3.1.1 Vi khuẩn từ đất nhiễm dioxin phân lập được, định danh khả phân hủy dioxin tổ hợp chủng vi khuẩn có tiềm Để đánh giá khả xử lý khử độc VSV chất diệt cỏ/dioxin, nội dung nghiên cứu khả phân hủy thực độc lập trước sử dụng công cụ metagenomic đối chiếu lại với sở metagenome mẫu Từ đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (C) đất khu vực xử lý phân hủy sinh học (BHR), chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng tốt môi trường MSM chứa dịch chiết đất phân lập (Hình 3.1) Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn BHBi1, BHBi4, BHBi5, BHBi7 BHO9 từ mẫu làm giàu môi trường MSM chứa dịch chiết đất Các chủng vi khuẩn phân lập sử dụng nghiên cứu sinh trưởng tốt mơi trường muối khống chứa chất độc Dưới kính hiển vi điện tử qt có độ phóng đại từ 10.000 đến 50.000 lần, hình dáng kích thước tế bào khác xác định thể Hình 3.2 A B C D E Hình 3.2 Hình thái tế bào chủng vi khuẩn kính hiển vi điện tử quét A: BHBi1; B: BHBi4; C: BHBi5; D: BHBi7; E: BHO9 Năm chủng vi khuẩn định danh dựa vào trình tự gene 16S rRNA đặt tên tương ứng Methylobacterium sp BHBi1, Hydrocarboniphaga sp BHBi4, Agrobacterium sp BHBi5, Bosea sp BHBi7, Microbacterium sp BHO9 (Hình 3.3) Ba số chủng từ kết giải trình tự metagenome mẫu nghiên cứu phát thấy mức độ chi metagenome mẫu nghiên cứu Agrobacterium sp BHBi5, Microbacterium sp BHO9, Methylobacterium sp BHBi1 Chi Agrobacterium có đại diện xuất mẫu với tỷ lệ giảm dần Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium vitis, Agrobacterium rhizogenes Chi Methylobacterium có đại diện từ mẫu gồm M chloromethanicum, M extorquens, M nodulans, M populi, M radiotolerans, Methylobacterium sp 4-46 Hai chủng Hydrocarboniphaga sp BHBi4, Bosea sp BHBi7 khơng tìm thấy đại diện liệu phân tích metagenome mẫu Hình 3.3 Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn Khả phân hủy dioxin đất tổ hợp vi khuẩn phân tích đánh giá GC/MS Hỗn hợp chủng vi khuẩn phân hủy 59,1% tương đương 1756,78 ngTEQ/kg sau 30 ngày nuôi lắc 30 oC với độ độc ban đầu cao >4.000 ngTEQ/kg Nếu tính theo ngày hiệu suất phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD lên tới 84,58 ngTEQ/kg/ngày (Hình 3.4, Bảng 3.1) A B Hình 3.4 Khả phân hủy chất diệt cỏ/dioxin đất tổ hợp vi khuẩn A: Đối chứng (khơng có VSV); B: Tổ hợp chủng vi khuẩn Bảng 3.1 Hiệu suất phân hủy dioxin đất ô nhiễm tổ hợp chủng vi khuẩn Tổ hợp vi khuẩn Tổng độ độc (ngTEQ/kg đất khơ) Phân hủy (%) Khơng có vi khuẩn 4.294,12 Hỗn hợp chủng vi khuẩn 1.756,78 59,1 3.1.2 Xạ khuẩn từ đất nhiễm dioxin phân lập, định danh khả phân hủy dioxin tổ hợp chủng xạ khuẩn tiềm 12 Số lượng Contig 12.133 119.555 Tổng số (bp) 61.478.000 215.533.770 GC (%) 65,10 58,72 Kích thước Contig lớn 1.070.898 261.394 Kích thước Contig nhỏ 700 700 Kích thước trung bình Contig 5.067 1.802 N25 104.014 5.218 N50 28.891 2.114 N75 4.081 1.142 Số lượng lỗi Kích thước lỗi 74 Các contig xếp phân tích hệ thống máy chủ MG-RAST với mã số (MG-RAST ID) 4730381.3 (C) 4720115.3 (BHR) để nghiên cứu cấu trúc quần xã VSV nhóm gen chức tham gia vào q trình chuyển hóa tế bào (Bảng 3.6) Bảng 3.6 Phân bố gene từ trình tự DNA metagenome C, BHR Phân bố gene DNA metagenome C BHR Tổng số genes 59.225 218.327 Gene biết chức 36.247 93.222 Gene dự đoán GO 36.207 92.986 Số lượng gene CaZy 577 2.774 Gene chứa peptide tín hiệu 5.051 10.954 Khối lượng gene (gene/Mbp) 963 1.012 Tổng kích thước gene 49.330.702 145.153.973 Kích thước gene lớn 17.244 21.804 Kích thước gene nhỏ 65 70 Kích thước gene trung bình 832 664 3.2.3 Đa dạng VSV metagenome C BHR Trong tổng số 80.156 đoạn trình tự (OTU) mẫu C 268.768 OTU mẫu BHR dự đoán từ sở liệu RefSeq, trình tự so sánh tương đồng với trình tự có nguồn gốc từ vi khuẩn mẫu chiếm đa số (C đạt 79.508 (99,19%) BHR 263.858 (98,17%)) Tương tự vậy, trình tự từ vi khuẩn cổ (vi khuẩn 13 cổ – Archaea) tương ứng đạt 106 (0,13%) 3.333 (1,24%), trình tự từ sinh vật nhân thật (Eukaryota) đạt 189 (0,24%) 1.330 (0,49%) Các trình tự chiếm tỷ lệ nhỏ từ virus đạt 344 (0,43%) 237 (0,09%), trình tự chưa phân loại mẫu chiếm 0,01% (Hình 3.10) 14 Hình 3.10 Đa dạng mức độ từ metagenome C BHR so với sở liệu RefSeq Sự đa dạng mức độ phân loại ngành, lớp, bộ, họ, chi, loài mẫu thống kê số liệu trình bày Bảng 3.7 Bảng 3.7 Đa dạng mức độ chiếm ưu mức độ phân loại metagenome C BHR Mẫu Ngành Lớp Bộ Họ Chi Loài C 45 87 161 301 622 674 BHR 52 110 208 375 786 1070 Tổng số 52 110 208 379 800 1264 3.2.3.1 Đa dạng vi khuẩn từ metagenome C BHR mức độ Ở mức độ ngành vi khuẩn có thay đổi rõ rệt số lượng (Hình 3.11) Trong metagenome C có 27 ngành chiếm tỷ lệ cao Proteobacteria (86,05%) Actinobacteria (11,98%), Firmicutes (0,83%), ngành lại chiếm tỷ lệ nhỏ Còn BHR phát 28 ngành, tỷ lệ tập trung vào ngành Proteobacteria (61,84%), Bacteroidetes (13,31%), Actinobacteria (8,51%) Một số ngành khác chiếm tỷ lệ nhỏ Firmicutes (3,83%), Acidobacteria (2,75%), Chloroflexi (2,33%), Cyanobacteria (1,35%), Nitrospirae (1,01%) Đa dạng vi khuẩn mức độ lớp Betaproteobacteria chiếm 52,20% C chiếm 15,84% BHR Một số lớp có tỷ lệ khơng có chênh lệch lớn C BHR Gammaproteobacteria 25,8% 23,98%, Actinobateria 11,98% 8,51%, Alphaproteobacteria 7,36% 14,38% so với C BHR Trong metagenome BHR có số lớp chiếm tỷ lệ tương đối cao Bacteroidia 15 (5,71%), Deltaproteobacteria (7,27%), Sphingobacteria (3,32%), Clostridia (2,4%), Flavobacteria (2,31%) lại lớp khác chiếm tỷ lệ thấp (Hình 3.11) Đây nhóm C chiếm tỷ lệ thấp, đất bị ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin kéo dài dẫn tới thay đổi đa dạng VSV đất Ở mức độ vi khuẩn, chiếm ưu metagenome C gồm Pseudomonadales, Burkholderiales, Actinomycetales, Xanthomonadales, Rhizobiales, Enterobacteriales với tỷ lệ 42,59%; 23,43%; 11,71%; 4,61%; 4,12% 2,68% Mẫu BHR có thay đổi lớn số lượng tỷ lệ với chênh lệch không nhiều Burkholderiales (15,47%), Rhizobiales (9,93%), Actinomycetales (7,95%), Xanthomonadales (4,93%), Pseudomonadales (2,15%), Enterobacteriales (1,04%) chiếm tỷ lệ cao nhiều so với mẫu C Bacteroidales (5,7%), Myxococcales (4,4%), Chromatiales (3,41%), Sphingobacteriales (3,32%), Nitrosomonadales (2,58%), Rhodocyclales (2,3%), Flavobacteriales (2,25%) (Hình 3.11) 16 Hình 3.11 Đa dạng vi khuẩn mức độ khác metagenome C BHR Ở cấp họ vi khuẩn, chiếm ưu metagenome C Alcaligenaceae 12,38%, Burkholderiaceae 8,16%, Enterobacteriaceae 2,68%, Comamonadaceae 2,16% Buetenbergiaceae 1,32% Với metagenome BHR họ chiếm ưu Comamonadaceae 5,13%, Bradyrhizobiaceae 4,19%, Burkholderiaceae 4,78%, Alcaligenaceae 4,11%, Bacteroidaceae 3,41%, Flavobacteriaceae 2,17%, Ectothiorhodospiraceae 1,91%, Cytophagaceae 1,58%, Chromatiaceae 1,42% (Hình 3.11) Sự khác biệt hai metagenome C, BHR thể rõ mức độ chi (Hình 3.11) Vi khuẩn Pseudomonas chi chiếm tỷ lệ lớn tới 40,54% tổng số trình tự thu từ liệu metagenone đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (mẫu C) Thay đổi lớn quần xã VSV tăng số lượng vi khuẩn thuộc chi Cupriavidus, chi chiếm 1% metagenome C 6,5% (vị trí thứ 2) metagenome BHR Chi Cupriavidus biết đến thông qua minh chứng nhiều chủng chi có khả phân hủy chất diệt cỏ chủng Cupriavidus necator JMP134 có khả phân hủy đáng kinh ngạc hợp chất vòng thơm Kết khảo sát sơ đến loài đáng ngạc nhiên hai chi vi khuẩn kị khí có số lượng lồi chênh lệch Ở chi Anaeromyxobacter có lồi, ngược lại Bacteroides có tới 36 lồi Cịn VSV hiếu khí Burkhodaria có 23 lồi xạ khuẩn Streptomyces có tới 33 lồi, vi khuẩn hiếu khí tùy tiện Pseudomonas Bacillus có 15 loài 25 loài Các chi cộng đồng nhà khoa học nghiên cứu nhiều chứng minh có khả phân hủy 17 dioxin hàng loạt chất đa vòng thơm khác Dehalococcoides có chi có chủng, Sphingomonas có lồi 3.2.3.2 Đa dạng vi khuẩn cổ metagenome C BHR Đa dạng vi khuẩn cổ metagenome C BHR mức độ phân loại khác Phát thấy có khác biệt đa dạng vi khuẩn cổ mức độ ngành metagenome C BHR (Hình 3.12) Đây có lẽ kết lĩnh vực nghiên cứu VSV liên quan đến xenobiotic Ngành Euryarchaeota chiếm tới 92,45% C chiếm 59,02% BHR Ngành Crenarchaeota Korarchaeota chiếm tỷ lệ tương đương mẫu 5,66%; 0,94% metagenome C 9,54%; 1,29% BHR Riêng ngành Thaumarchaeota chiếm tỷ lệ nhỏ C (0,94%) lại chiếm tỷ lệ lớn BHR (30,15%) Đây kết ngạc nhiên, để giải thích tỷ lệ chiến ưu metagenome mẫu nghiên cứu cần thêm thời gian nghiên cứu sâu sắc Ở mức độ lớp vi khuẩn cổ khơng có chênh lệch lớn vi khuẩn (Hình 3.12) Lớp chiếm tỷ lệ cao mẫu Methanomicrobia chiếm 50% metagenome C 24,57% BHR Các lớp khác Archaeoglobi, Halobacteria, Methanobacteria, Methanococci, Methanopyri, Thermococci, Thermoprotei chiếm tỷ lệ thấp mẫu Rất đặc biệt, tỷ lệ quần xã vi khuẩn kị khí bắt buộc chưa biết đến hệ thống phân loại cao C BHR 19,92% 36,54% Mức độ chi (Hình 3.12) cho thấy thay đổi tỷ lệ chi mẫu khác Mẫu C đa dạng tập trung Methanosarcina (22,64%), Methanocella (12,26), Methanosaeta (6,6%), Methanococcus (5,66%) chi chưa phân loại lên tới 16,04% Vi khuẩn cổ mẫu BHR tập trung Nitrosopumilus (23,97%), Methanosarcina (9,66%), Cenarchaeum (6,18%), Pyrococcus (3,63%), Thermococcus (3,6%) chi chưa phân loại chiếm 4,35% mẫu C nhiều Đa dạng vi khuẩn cổ sinh metan metagenome mẫu nghiên cứu Nhóm vi khuẩn cổ sinh metan có mặt metagenome chiếm tỷ lệ cao mẫu BHR (vì chơn lấp với thời gian điều kiện xử lý mô tả chi tiết phần vật liệu phương pháp Đặc biệt giai đoạn cuối qui trình xử lý nước bão hòa) tổng độ độc mẫu giảm xuống mức cho phép có mặt chúng tượng dễ hiểu 18 Hình 3.12 Đa dạng vi khuẩn cổ mức độ metagenome C BHR Đa dạng vi khuẩn cổ ưa mặn metagenome C BHR Trong metagenome mẫu nghiên cứu phát thấy 10 chi vi khuẩn cổ (Archaea) thuộc ngành Euryarchaeota thuộc họ Halobacteriaceae Số lượng chi metagenome mẫu BHR lớn nhiều so với mẫu C (Hình 3.13 Hình 3.14) 19 Hình 3.13 Đa dạng vi khuẩn cổ sinh metan metagenome C BHR Hình 3.14 Đa dạng vi khuẩn cổ ưa mặn metagenome C BHR 3.2.3.3 Đa dạng nấm sợi nấm đảm metagenome C BHR Số lượng nấm sợi nấm đảm metagenome không cao nấm sợi có số lượng đa dạng nhiều có tới 36 chi so với nấm đảm có chi nấm men 13 chi phát mẫu nghiên cứu Đã có nhiều công bố khử độc chất diệt cỏ/dioxin chủng nấm sợi thuộc chi khác Tuy nhiên với nấm men chưa có cơng bố phát mà quần xã nấm men có mặt metagenome đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin số lượng không cao Các chi quen thuộc với có mặt Candida, Saccharomyce, Pichia Các chi cịn lại đóng vai trị phân hủy chất diệt cỏ/dioxin cịn ẩn số Số lượng nấm men BHR cao hẳn metagenome C Đất ô nhiễm C 20 có độ độc cao nấm men có mặt với số lượng thấp Đây câu hỏi cần có lời giải nghiên cứu nên phân lập nấm men, nấm sợi nấm đảm Nếu phân lập dạng khiết môi trường chứa hỗn hợp chất độc chúng nguồn nguyên liệu di truyền quí giá để nghiên cứu đường phân hủy chất độc VSV nhân thật 3.2.4 Mối liên hệ số chi vi khuẩn với tổng độ độc đặc tính lý hóa đất Đối với chi VSV có mặt mẫu nghiên cứu chênh lệch tỷ lệ metagenome khác Ngoài chi so sánh chi có tỷ lệ cao hay đóng vai trị quan trọng hoạt động sinh lý sinh thái tiêu biểu cho nghiên cứu Ví dụ chi sau cung cấp cho tranh nhiều màu sắc giới VSV liên quan đến nhóm mẫu mà chúng tơi nghiên cứu metagenome (Hình 3.15) Chi Candidatus koribacter Candidatus solibacter mẫu BHR chiếm tỷ lệ cao gấp 10 lần so với mẫu C Chi Cupriavidus chi chiến ưu cao mẫu nghiên cứu có khác biệt rõ ràng Hình 3.15 Các chi vi khuẩn có tỷ lệ chiếm ưu chênh lệch metagenome C BHR 3.2.5 Đa dạng gene chức tham gia phân hủy xenobiotic metagenome C BHR Phân tích sâu cho thấy gene liên quan đến đường trao đổi ngoại vi trao đổi chất thông qua hợp chất vòng thơm trung gian chiếm ưu metagenome Các gene liên quan đến hoạt động trao đổi chất hợp chất vòng thơm trung gian hoạt động mạnh mẫu C so với mẫu BHR (Hình 3.16) Một điểm đáng ý khác gene laccase tìm thấy metagenome thuộc laccase vi khuẩn Trong laccases từ nấm thơng báo có khả phân hủy hợp chất liên quan đến dioxin Hiện chưa có minh chứng laccase vi khuẩn tham gia vào trình phân hủy dioxin 21 trực tiếp Có nhiều gene liên quan đến phân hủy hợp chất thơm thông qua montoxypase cytochrome P450 thấp đáng kể so với nhóm khác, cho thấy xu hướng ưu tiên đường khống hóa tạo thành chất trung gian độc hại, chất chuyển hóa ngõ cụt liên hợp chịu trách nhiệm cho việc hình thành dẫn chất PAH-DNA đột biến kích hoạt ung thư động vật (Bảng 3.8) Hình 3.16 Tương quan gene liên quan chuyển hóa xenobiotic metagenome C BHR Do lịch sử cụ thể mẫu đất, nghiên cứu gene chức liên quan đến đường phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T hợp chất có liên quan đến dioxin tiến hành (Bảng 3.9) Bảng 3.8 Số lượng trình tự tương đồng cao với gene chức tập liệu chuẩn hóa Các gene chức C BHR Catechol 1,2-dioxygenase [EC 1.13.11.1] 25 13 catechol 2,3-dioxygenase [EC 1.13.11.2] 54 31 protocatechute 3,4-dioxygenase [EC 1.13.11.3] 59 protocatechute 4,5-dioxygenase [EC 1.13.11.8] 13 30 Cytochrome P450 Bảng 3.9 Số lượng trình tự liên quan đặc thù tới đường phân 2,4-D polychlorinated biphenyl (PCB) dựa sở liệu KEEG Enzyme C BHR 22 Phân hủy 2,4-D Phân hủy PCB alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase [EC:1.14.11.-] 2,4-dichlorophenoxyacetate 13 2,4-dichlorophenol 6-monooxygenase [EC:1.14.13.20] 46 chlorocatechol 1,2-dioxygenase [EC:1.13.11.-] biphenyl 2,3-dioxygenase [EC:1.14.12.18] 17 cis-2,3-dihydrobiphenyl-2,3-diol dehydrogenase [EC:1.3.1.56] 0 biphenyl-2,3-diol 1,2-dioxygenase [EC:1.13.11.39] 17 2,6-dioxo-6-phenylhexa-3-enoate hydrolase [EC:3.7.1.8] 2-keto-4-pentenoate hydratase [EC:4.2.1.80] 21 3.2.5 Nhóm gene mã hóa enzyme tham gia phân hủy, chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin: Đây gene chức thuộc nhóm oxidoreductase, laccase tham gia vào oxy hóa mở hay cắt vòng thơm hoạt động chất xúc tác mạnh Nghiên cứu không phát peroxidase nhiên có tới 18 21 gene mã hóa laccase phát từ metagenome C BHR 3.2.7 Gene tham gia vào phân hủy chuyển hóa xenobiotic từ metagenome phát Bằng phần mềm chuyên dụng, gene mã hóa laccase mẫu nghiên cứu phát liệt kê (Bảng 3.10) Có tất 20/39 gene laccase phát với trình tự có độ tương đồng thấp 85% so với công bố CSDL Laccase - Laccase Database Bảng 3.10 Danh sánh gene laccase hai metagenome C BHR so sánh với trình tự CSDL Laccase - Laccase Database Mẫu Trình tự dự đoán Prokka_26873 Prokka_29204 Prokka_29254 C (6 gene Prokka_36971 mới) Prokka_42353 Prokka_43501 BHR Prokka_14662 Trình tự lồi tương đồng Pseudomonas kuykendallii Bradyrhizobium japonicum Georgenia soli Propionibacteriaceae bacterium NML 150081 Microbacterium profundi Georgenia soli Candidimonas nitroreducens Tương đồng (%) 69 70 77 Độ dài tương đồng 98 99 95 Giá trị tương đồng 0 62 99 WP_094452554.1 67 79 59 99 94 97 0 0.0 WP_033107198.1 PFG38115.1 WP_088601715.1 Số đăng ký Genbank WP_090224340.1 WP_024341998.1 PFG38115.1 23 Prokka_19245 Prokka_49413 Prokka_85327 Prokka_87022 Prokka_88258 Prokka_90273 Prokka_105664 (14 gene Prokka_123396 mới) Prokka_130875 Prokka_148241 Prokka_169983 Prokka_192104 Prokka_196163 Betaproteobacteria bacterium SG8_41 Elizabethkingia anophelis Edaphobacter aggregans Emcibacter sp ZYL Candidatus Methanoperedens nitroreducens Chitinophaga jiangningensis Rhodanobacter sp SCN 66-43 Alphaproteobacteria bacterium 62-8 Nitrobacter sp 62-23 Alphaproteobacteria bacterium 62-8 Methylobacter tundripaludum SV96 Alphaproteobacteria bacterium 62-8 Vibrionimonas magnilacihabitans 69 99 0.0 KPK14192.1 71 69 62 64 99 97 95 98 0.0 0.0 1e-155 5e-126 WP_095439195.1 WP_035356032.1 WP_099473112.1 WP_096203677.1 64 76 74 97 98 99 0.0 8e-159 2E-178 SHL10102.1 ODU94729.1 OJU56834.1 77 72 99 97 0 OJV03616.1 OJU56834.1 59 97 EGW23198.1 76 99 OJU56834.1 72 94 WP_105469515.1 Các kết thu trình bày tóm tắt sau: - Nồng độ DNA tổng số trực tiếp thu mẫu C BHR tương ứng đạt 23,2 ng/µl 14,1 ng/µl xác định máy đo Qubit Fluorometre đáp ứng yêu cầu cho giải trình tự hệ thống Illumina Hiseq 2500 - Độ lớn mẫu sau giải trình tự với liệu thu lớn có độ xác cao (15Gb mẫu với độ xác 99,9%); - Bằng phần mềm tin sinh học dựa sở liệu xác định đa dạng VSV metagenome mức độ từ ngành, lớp, bộ, họ, chi, loài đa dạng gene chức tham gia vào phân hủy hợp chất xenobiotic; - Sự khác biệt đa dạng thể rõ mức độ chi chi Pseudomonas chiếm ưu mẫu nhiễm nặng (40,54%) mẫu làm giảm (1,71%); - Đã xác định đa dạng vi khuẩn cổ thuộc nhóm ưa mặn sinh methan (Methanosarcina, Haloarcula chiếm ưu đất khử độc) Sinh vật nhân thật không nhiều phát thấy nấm sợi, nấm đảm nấm men Candida, Saccharomyce, Pichia, Aspergillus, Penicillium, Coprinopsis; 24 - Số lượng gene mã hóa cho enzyme tham gia vào phân hủy xenobiotic lớn Sự có mặt laccase laccase-like metagenome lên tới 39 gene, có 20/39 gene laccase KẾT LUẬN Vi khuẩn metagenome nghiên cứu chiếm tỷ lệ cao 99,19% C 98,17% BHR, vi khuẩn cổ tương ứng đạt 0,13% 1,24%, vi sinh vật nhân thật (nấm sợi, nấm đảm, nấm men) chiếm tỷ lệ 0,24% 0,49%, virus chiếm tương ứng 0,43% 0,09%, trình tự lỗi chưa phân loại nhỏ 0,01%; - Trong metagenome C có 27 ngành, chiếm tỷ lệ cao Proteobacteria (86,05%) Actinobacteria (11,98%), Firmicutes (0,83%), ngành lại chiếm tỷ lệ nhỏ Còn BHR phát 28 ngành, tỷ lệ tập trung vào ngành Proteobacteria (61,84%), Bacteroidetes (13,31%), Actinobacteria (8,51%) Một số ngành khác chiếm tỷ lệ nhỏ Firmicutes (3,83%), Acidobacteria (2,75%), Chloroflexi (2,33%), Cyanobacteria (1,35%), Nitrospirae (1,01%); - Sự đa dạng vi khuẩn metagenome có khác biệt rõ rệt thể rõ mức độ chi chi Pseudomonas chiếm ưu 40,54% C BHR giảm 1,71%; -Vi khuẩn cổ chiếm ưu nhóm ưa mặn sinh methan, hai chi Methanosarcina Haloarcula chiếm ưu BHR; - Nấm men, nấm sợi nấm đảm phát metagenome BHR nhiều gấp đôi (35 chi) so với C 17 với số đại diện thấp Các chi Aspergillus, Penicillium, Gibberella, Emericella (nấm sợi) có số lượng nhiều BHR sau đến chi Candida, Schizosaccharomyces, Saccharomyce, Pichia (nấm men) Coprinopsi (nấm đảm); Số lượng nhóm gene tham gia vào q trình xúc tác oxy hóa xenobiotic phát với số lượng lớn tới 39 gene laccase laccase-like có 20 gene Ngồi gene mã hóa enzyme khác catechol 1,2-dioxygenase, catechol 2,3-dioxygenase, protocatechute 3,4-dioxygenase, protocatechute 4,5dioxygenase, cytochrome P450 phát với số lượng khác metagenome; Đã phân lập phân loại chủng vi khuẩn có chủng Hydrocarboniphaga sp BHBi4, Bosea sp BHBi7 xạ khuẩn sinh laccase-like (XKBHA3, XKBH4, XKBH28, XKBH921, XKBHA22) phân lập; Sau 30 ngày nuôi cấy, tổ hợp vi khuẩn xạ khuẩn khử độc 59,1% 50,7% đồng loại dioxin 2,3,7,8-TCDD đất với độ độc ban đầu 4294,12 ng TEQ/kg Nếu tính theo ngày khả phân hủy tương ứng đạt 84,58 ng TEQ/kg/ngày 72,59 ng TEQ/kg đất/ngày 25 Đã phát thấy quần xã vi sinh vật tham gia vào đường chuyển hóa hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin chất trao đổi chất, vi sinh vật tham gia vào đường phân hủy hiếu khí chiếm tỷ lệ cao vượt trội so với kị khí Trong quần xã vi sinh vật tham gia vào đường oxy hóa cắt vịng loại khử clo sau cắt vòng chiếm tỷ lệ cao đến quần xã phân hủy theo đường xúc tác; Kết nghiên cứu lần khẳng định công nghệ phân hủy sinh học hồn tồn hiệu tạo điều kiện phù hợp cho quần xã vi sinh vật môi trường khác hoạt động phân hủy, chuyển hóa khống hóa hỗn hợp chất ô nhiễm thuộc POPs với tổng độ độc đất cao Tuy nhiên cần thêm nhiều nghiên cứu trả lời chi tiết vai trò quần xã chuyển hóa nhiễm điều kiện tự nhiên xử lý công nghệ phân hủy sinh học (Bioremediation) KIẾN NGHỊ Luận án dừng lại bước đánh giá đa dạng VSV mức độ để thấy thay đổi, khác biệt tập đoàn VSV đất ô nhiễm nặng với đất xử lý với liệu khổng lồ phát triển không ngừng phần mềm tin sinh giúp khai thác sâu liệu thu Từ lý nghiên cứu sinh đề xuất số kiến nghị gồm: Dữ liệu trình tự metagenome thu nguồn nguyên liệu di truyền khai thác khơng phục vụ nghiên cứu mà cịn hữu ích cho ứng dụng khử độc POP trường ô nhiễm (bao gồm laccase, laccase-like); Kết hợp kiến thức biết chất hóa học bị loại bỏ đường trao đổi chất giả định với phân tích số mơi trường metagenome liên quan đến chất diệt cỏ/dioxin khác để tăng hiệu suất công nghệ khử độc; Rất cần tiếp tục phân lập vi sinh vật có khả phân hủy dioxin POP khác enzyme chúng sinh tổng hợp nhằm tạo chế phẩm cho mục đích phân hủy tái tạo mà mơi trường kiểm sốt NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI Phạm Quang Huy, Đặng Thị Cẩm Hà (2018) Khả phân hủy đồng loại dioxin 2,3,7,8-TCDD tổ hợp xạ khuẩn phân lập từ đất ô nhiễm sân bay Biên Hòa, Đồng Nai Kỷ yếu “Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2018”, p796-802 Pham Quang Huy, Nguyen Kim Thoa, Đang Thi Cam Ha (2018) Degradation of 2,3,7,8-TCDD by a consortium of bacterial strains isolated from heavy herbicide/dioxin contaminated soil in BienHoa airbase Journal of biotechnology, 16(4): 777-784 26 Pham Quang Huy, Nguyen Kim Thoa, Dang Thi Cam Ha (2020) Diversity of reductive declorinating bacteria and archaea in herbicide/dioxin contaminated soils from Bien Hoa airbase using metagenomic approach Journal of biotechnology, 18(4): 773-784 ... là: ? ?Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/ dioxin Biên Hòa, Đồng Nai đánh giá khả phân hủy số chủng phân lập? ?? Kết đa dạng đặc điểm cấu trúc quần xã khả phân hủy dioxin số đại... - Phân tích, đánh giá đa dạng VSV, đa dạng gene chức giả định từ liệu metagenome mẫu nghiên cứu; - Đánh giá khả phân hủy hiếu khí dioxin đất ô nhiễm nặng tổ hợp vi khuẩn xạ khuẩn phân lập từ đất. .. metagenomic; - Đánh giá khả phân hủy hiếu khí dioxin đất nhiễm nặng hỗn hợp chất diệt cỏ/ dioxin tổ hợp vi khuẩn tổ hợp xạ khuẩn (XK) phân lập lựa chọn từ mẫu đất nghiên cứu Nội dung nghiên cứu - Thu