Nghiên cứu nhân giống thông caribe (pinus caribaeca morelet) bằng phương pháp nuôi cấy invitro

-1- Mở đầu Một loài đà dẫn nhập vào trồng thành công Việt Nam Thông caribê (Pinus caribaea Morelet), Thông caribê gồm ba biến chđng lµ Pinus caribaea var caribaea, Pinus caribaea var hondurensis Pinus caribaea var bahamensis có phân bố tự nhiên vùng Trung Mỹ [27] Đây loài gỗ lớn, cung cấp gỗ làm nguyên liệu để sản xuất bột giấy, ván nhân tạo đồ gia dụng Là loài có sinh trưởng nhanh, cành nhánh nhỏ, thân thẳng đẹp, tỷ lệ lợi dụng gỗ cao đáp ứng nhiều mục tiêu kinh tế, nên đến đà có 65 nước nhập giống gây trồng, chủ yếu nước thuộc vùng nhiệt đới nhiệt đới [9] Thông caribê nhập vào trồng thử nghiệm nước ta năm 1963 Lâm Đồng [9], qua khảo nghiệm rừng trồng thử nghiệm cho thấy Thông caribê tỏ loài cã søc sinh tr­ëng nhanh, thÝch øng réng víi nhiỊu vùng sinh thái Kết nhiều nơi cho thấy rừng sinh trưởng tốt Thông caribê có khả thích ứng lớn với môi trường Đặc biệt Thông caribê sinh trưởng vùng đất trống, ®åi träc nghÌo dinh d­ìng, mét bé phËn ®Êt ®ai rÊt lín ë n­íc ta [2], [3] Nh÷ng dÊu hiƯu cho thấy Thông caribê số loài trồng rừng có triển vọng cung cấp gỗ nhỡ, gỗ lớn, gỗ nguyên liệu giấy cho kinh tế quốc dân đồng thời sớm nâng cao độ che phủ rừng góp phần ổn định môi trường sinh thái nhiều quan nghiên cứu, nhiều sở sản xuất quan tâm Việt Nam loài thông trồng chủ yếu Thông ba (Pinus kesiya), Thông nhựa (Pinus merkusii), Thông đuôi ngựa (Pinus masoniana) gần Thông caribê (Pinus caribaeea) với biến chủng khác [11] Nhìn chung loài thông này, Thông caribê loài thông có sinh trưởng nhanh, thân thẳng đẹp, cành nhánh nhỏ Thông ba Thông đuôi ngựa, có tỷ lệ gỗ sử dụng cao nên ưa thích gây trồng Với đặc điểm sinh lý, sinh thái -2- giá trị kinh tế Thông caribê, chương trình trồng triệu hecta rừng nay, Thông caribê đà chọn trồng quan trọng cần ưu tiên phát triển Tuy nhiên hoa kết Thông caribê Việt Nam từ nhiều năm trước có số vấn đề Trên sở theo dõi vật hậu lâm phần Thông caribê nước số liệu điều tra nguồn giống, thấy khả cung ứng giống Thông caribê Việt Nam chưa đủ đáp ứng nhu cầu trồng rừng nước Tình trạng thiếu giống số nguyên nhân Nguyên nhân tạo biến động suất chất lượng hạt giống Thông caribê Việt Nam số lâm phần có diện tích lớn bắt đầu đến tuổi thành thục cho hạt hữu thụ Uông Bí (Quảng Ninh), Hương Sơn (Hà Tĩnh) Ngoài lực sản xuất hạt giống lâm phần Thông caribê Việt Nam chưa đươc tận dụng hết để đáp øng nhu cÇu gièng n­íc [1] NhiỊu khu rõng trồng thông không hoa kết mà hạt hữu thụ số hạt hữu thụ ít, không đủ hạt giống cung cấp cho trồng rừng Trong khả cung cấp hạt Thông caribê chưa đủ, giá thành hạt nhập ngoại đắt, nhân giống vô tính thông có vai trò quan trọng việc phát triển giống để cung cấp cho trồng rừng Ngày nay, kỹ thuật nhân giống trồng đà có bước phát triển vượt bậc, công nghệ nhân giống vô tính tạo số lượng lớn giống mang chất di truyền giống hệt mẹ thời gian ngắn Trên giới công nghệ nhân giống vô tính thông bao gåm kü thuËt nu«i cÊy in vitro (nu«i cÊy mô tế bào) kỹ thuật nhân giống hom, chiết, ghép nuôi cấy in vitro giâm hom ngày đóng vai trò chủ đạo Lần năm 1976, thực nghiệm nhân giống hom với số loài thông nhiệt đới đà tiến hành Trung tâm nghiên cứu có sợi (nay Viện nghiên cứu nguyên liệu giấy) mức nghiên cứu sơ khai đà đạt số kết Trung tâm nghiên cứu giống rừng ( Viện KHLN ) đà thử nghiệm giâm hom số loài thông đà thành công bước đầu với thông lai Thông Caribê Tuy nhiên Thông caribê lại loài nhân giống phương pháp giâm hom trực tiếp -3- từ trội đạt kết Khi giâm hom cho loài thông từ non vườn cấp hom dễ thành công [8] Như giâm hom thông Việt Nam kết chưa cao, chưa thể đưa vào sản xuất quy mô lớn Hiện nuôi cấy in vitro đà áp dụng số nước có lâm nghiệp phát triển đà thực quy mô công nghiệp Nuôi cấy mô tế bào kỹ thuật tiên tiến nhân giống trồng, đặc biệt thân gỗ ăn lâm nghiệp Nuôi cấy mô tế bào có nhiều ưu việt hẳn phương pháp nhân giống khác: cho hệ số nh©n gièng cao, tõ mét c©y mĐ ­u viƯt ban đầu tạo hàng triệu đà làm trẻ hoá bệnh Cây ưu việt đượctrẻ hoá qua nuôi cấy mô nguồn vật liệu lý tưởng để cung cấp hom giống cho nhân giống giâm hom Xuất phát từ vấn đề trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu nhân giống Thông caribê (Pinus caribaea Morelet) phương pháp nuôi cấy in vitro Đối tượng nghiên cứu loài Thông caribê (Pinus caribaea var hondrensis), loài thông biến chủng Thông caribê có nhiều triĨn väng ë ViƯt Nam -4- Ch­¬ng Tỉng quan tàI liệu 1.1 Một số kết ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro thực vật sản xuất nông lâm nghiệp Nhân giống nuôi cấy mô tế bào hay vi nhân giống tên gọi chung cho phương pháp nuôi cấy in vitro cho phận nhỏ tách khỏi (George, 1993) dùng phổ biến để nhân giống thực vật, có lâm nghiệp Các phận dùng để nuôi cấy chồi đỉnh, chồi bên, chồi bất định, bao phấn, phấn hoa, phôi phận khác vỏ cây, non, thân mầm … [18], [19] Nhê øng dơng kü tht nu«i cÊy mô vào nhân giống, người ta đà tạo hàng loạt đồng kiểu gen với số lượng lớn mà phương pháp nhân giống vô tính thông thường khác có Nuôi cấy mô có ưu phương pháp nhân giống vô tính khác có tỷ lệ nhân giống cao, tới hàng triệu năm Ngoài áp dụng nhiều biện pháp xử lý lên nuôi cấy in vitro phương pháp khác Cây giống tạo phương pháp nuôi cấy in vitro vừa khoẻ, trẻ sinh lý virus mẫu lấy từ đỉnh sinh trưởng đà nhiễm virus Năm 1960, Morell đà nhận thấy mô phân sinh địa lan phong lan có virus, từ ông phát khả nhân nhanh bệnh giống Chỉ sau năm, ông thu triệu đồng mặt di truyền từ chồi lan ban đầu [22] Sau Morell cộng đà phục tráng giống khoai tây cách dùng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh đà tạo khoai tây không chứa virus (1968) [22] Theo Murashige (1974) có khoảng 300 loài nhân giống phương pháp nuôi cấy in vitro) [33] Kỹ thuật nuôi cấy mô đà 600 công ty giới áp dụng để nhân hàng triệu giống hàng năm, chủ yếu -5- nhân giống hoa, cảnh, ăn quả, công nghiệp số rau (Vasin, 1994) [21] Nhu cầu giống in vitro ngày nhiều, năm gần hàng năm giới sản xuất khoảng 50 triệu loại, ước tính phải đạt 250 triệu cây/năm đáp ứng yêu cầu thực tiễn [19] Dự kiến thị trường giống nhân kỹ thuật nuôi cấy mô vào khoảng 15 tỷ USD/năm tốc độ tăng trưởng hàng năm thị trường khoảng 15% (Govil Gupta, 1997) [21] Thái Lan năm xuất hoa thu khoảng 20 triệu USD, phần lớn hoa nhân gièng b»ng nu«i cÊy in vitro ViƯc chän vËt liƯu ban đầu cho vi nhân giống quan trọng, định thành công ban đầu mà trình nhân Các công trình D’Amato (1977) cho thÊy chØ cã ®Ønh sinh tr­ëng cđa chồi đảm bảo ổn định di truyền Tiếp đến đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp với xử lý nhiệt để làm bệnh vật liệu tốt để nhân Các chồi nhân ban đầu thường lấy từ đỉnh chồi đỉnh mô phân sinh môi trường thạch chứa muối khoáng, đường, vitamin chất điều hoà sinh trưởng Vi nhân giống bắt đầu bầu tách đỉnh chồi mô phân sinh từ định nhân, sau khử trùng đưa vào nuôi cấy môi trường phù hợp Các chồi hình thành tách cấy chuyển sang môi trường mới, quy trình lặp lại Đây phương pháp cho hệ số nhân thấp phương pháp nhân qua giai đoạn mô sẹo phôi, chồi hình thành giữ đặc điểm mẹ, không bị thay đổi mặt di truyền Trong số trường hợp, vi nhân giống thực thông qua việc tạo phôi tái sinh trực tiếp từ mô sẹo Phương pháp cho hệ số nhân cao thường kéo theo biến dị soma [19] Ưu điểm nuôi cấy in vitro là: cho hệ số nhân cao rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất; nhân số lượng lớn diện tích nhỏ; thuận tiện làm hạ giá thành vận chuyển, việc bảo quản giống thuận lợi Cây nuôi cấy mô thường trẻ hoá cao độ có rễ giống mọc từ hạt, chí khác biệt đáng kể so với mọc từ hạt Trong lúc hom lại -6- thường rễ cọc, rễ đâm sâu xuống đất mọc từ hạt thường có tượng bảo lưu cục Ví dụ, mô Keo lai giai đoạn 1-2 tháng tuổi (cũng loài bố mẹ Keo tai tượng Keo tràm) có đủ loại kép lần, kép hai lần giả, lại có rễ theo kiểu rễ cọc mọc từ hạt điển hình, hom giống lại có giả trưởng thành rễ cọc (nghĩa tính trẻ hoá bị hạn chế , tính bảo l­u cơc bé th× biĨu hiƯn râ rƯt) V× thÕ nuôi cấy mô biện pháp trẻ hoá giống sản xuất lâm nghiệp [13] Khác với nông nghiệp ngắn ngày, rừng có đời sống dài ngày phải nhiều năm hoa kết Sau chọn trội, muốn có giống tốt để đưa vào sản xuất, phải xây dựng vườn giống rừng giống phải đợi thêm số năm thu lượng hạt đủ lớn phục vụ trồng rừng, nhiên giống từ hạt bị phân hoá dẫn đến suất rừng biến động Nhân giống phương pháp nuôi cấy in vitro biện pháp hữu hiệu để trì đặc tính tốt mẹ cho hệ sinh dưỡng Do nuôi cấy in vitro đà áp dụng rộng rÃi cho số loài rừng bạch đàn [14] Hiện nuôi cấy in vitro đà ứng dụng rộng rÃi sản xuất thương mại nhiều nước giới, hàng trăm loài rộng hàng chục loài kim đà nuôi cấy mô thành công Cho tới năm 1991, Thái Lan đà nhân giống thành công nuôi cấy mô cho 55 loài tổng số 67 loài tre trúc thử nghiệm Công nghệ cho phép nhân nhanh loài Dendrocalamus asper với công suất triệu năm Với loài Dendrocalamus asper, năm 1980 họ có tay vài trăm hạt giống đà nhanh chóng có 100 000 đưa huấn luyện vườn ươm, đến năm 1992 mục tiêu họ sản xuất vài triệu phục vụ trồng rừng [14] Số loài bạch đàn đà nhân giống phương pháp in vitro ngày tăng, tới năm 1987 đà có 20 loài bạch đàn khác tạo in -7- vitro (Gupta Mascarenhas, 1987) Các nhà khoa học ấn Độ đà tạo thành công mô từ trôi bạch đàn Eucalyptus camandulensis, Eucalyptus globulus, Eucalyptus tereticornis, Eucalyptus torelliana từ trội có hàm lượng tinh dầu cao bạch đàn chanh Eucalyptus citriodora Cây mô có nguồn gốc từ ưu việt sinh trưởng nhanh gấp lần đồng mọc từ hạt mẹ Tại úc, nhân giống nuôi cấy in vitro đà áp dụng để nhân nhanh chọn cho tính chịu mặn đất đưa vào sản xuất lớn cho loài E camaldulensis Vào năm 1987, khoảng 20 000 mô dòng vô tính chịu mặn đà tạo để trồng lại rừng mỏ bauxite gần Perth, Tây úc [14] Trung Quốc đà tạo in vitro thành công cho 100 loài thân gỗ dương, bạch đàn, bao đồng, tếch Là nước ứng dụng sớm thành công nuôi cấy mô vào trồng rừng diện rộng, nhân giống thành công E urophylla Đến năm 1991 vùng Nam Trung Quốc, người ta đà tạo triệu mô dòng lai chọn lọc Những mô dùng đầu dòng để tạo hom vườn ươm địa phương dùng thẳng vào trồng rừng [15] Nhiều loài rộng châu Âu đà thử nghiệm nhân giống thành công biện pháp nuôi cấy mô, loài như: Acer, Beluta, Carpinus, Fagus, Quercus, Ulmus, Fraxinus, Prunus, Juglans, Castanea, Tilia, Sorbus Các mô đà trồng thực địa để so sánh đà cho thấy chúng cã phenotip gièng nhau, tû lÖ sèng ë rõng trång sau huấn luyện cao, đạt 90 -100% cho loài Beluta, Quercus, Sorbus Salix [15] Hiện nuôi cấy in vitro biện pháp nhân giống áp dụng nhiều loài kim nhằm phục vụ cho chương trình trồng rừng dòng vô tính Đối với loài thông P nigra, P pinaster, P sylvestris giâm hom từ già khó người ta ¸p dơng c¸c biƯn ph¸p nu«i cÊy m« nh­ nu«i cấy phôi, nuôi cấy tạo mô sẹo biện pháp có nhiều triển vọng, đối -8- với thông P pinaster Nhân chồi in vitro từ non loài Vân sam (Picea sitchensis) cho hệ số nhân biến động lớn tuỳ theo mẹ, cụ thể 17 5000 chồi năm Có tới 30 loài số loài kim nghiên cứu nuôi cấy mô đà đạt thành công bước đầu, phải kể đến loài Abies balsamea (tạo chồi 15 20 tuổi), loài Bách tán Araucaria, Liễu sam Cryptomeria japonica, Larix sp., Picea glauca, ThiÕt sam Pseudotsuga menziesii, Cï tïng Sequoia sempervirens, Sequoiadendron gigenteum, Thuja sp., Tsuga heterophylla [15] Nuôi cấy mô biện pháp tốt để trẻ hoá tăng hệ số nhân, biện pháp tạo phôi vô tính Người ta đà nghiên cứu tạo nuôi cấy phôi vô tính cho Thiết sam (Pseudotsuga menziesii), chưa tạo hoàn chỉnh từ phôi vô tính chồi bất định đà tạo từ đỉnh thân mẹ 64 tuổi Bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, loài Bách tán cho hệ số nhân thấp, tạo 20 60 chồi từ vòng tháng loài A cunninghamii có chồi loài rễ in vitro [15] Trong số 30 loài kim đà nuôi cấy mô, có bốn loài đưa vào sản xuất diện rộng, Cù tùng Sequoia sempevirens AFOCEL (Pháp); thông P radiate Viện nghiên cứu lâm nghiệp New Dilân; P taeda Pseudotsuga menziesii Mỹ Các biện pháp nuôi cấy mô đà áp dụng cho Tếch, Gupta cộng (1979) đà mô tả hình thành cụm chồi từ phần cắt non từ mầm 100 tuổi Từ họ tạo 500 in vitro từ chồi trưởng thành 3000 từ non năm Kaosa-ard (1990) cho biết Thái Lan đà phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy mô (nuôi cấy đỉnh thân phôi) vào năm 1986 cho Tếch cho phép tạo 500 000 chồi từ chồi năm Perhutani (1991) cho biết Indonexia đà thử nghiệm nuôi cấy mô thành công vài mô đà đem trồng thử [15] -9- Người ta đà nhân giống thành công Phi lao biện pháp nuôi cấy mô đà trồng so sánh với hạt nhà kính Kỹ thuật dùng để tạo mô Phi lao sinh trưởng nhanh, kháng bệnh cố định đạm cao cho trồng rừng [15] 1.2 Thông caribê, vị trí sản xuất lâm nghiệp triển vọng trồng rừng Việt Nam Thông caribê (Pinus caribaea Morelet) gây trồng nước ta từ năm 1963, thông báo cho thấy Thông caribê loài sinh truỏng nhanh thân thẳng đẹp, cành nhánh nhỏ Thông ba Thông đuôi ngựa nên nhiều địa phương ưa thích gây trồng Tuy nhiên chưa đánh giá đầy đủ, có nhiều ý kiến khác việc sử dụng loài thông [9], [12] Thông caribê gồm biến chủng là: Pinus caribaea var caribaea, Pinus caribaea var hondurensis vµ Pinus caribaea var bahamensis có phân bố tự nhiên vùng Trung Mỹ Trong biến chủng caribaea có phân bố từ 16o 20o độ vĩ Bắc, phân bố tự nhiên Cuba đảo Juventus thuộc vùng biển Caribê, chủ yếu tập trung vùng thấp, đồi bát úp, thường độ cao 330 m so với mặt nước biển Ngoài biến chủng caribaea xuất hiƯn ë ®é cao xÊp xØ 760 m, Ýt cã trường hợp phân bố độ cao 1200 m (Poyton, 1997) [4] Biến chủng bahamensis phân bố tự nhiên từ 22o 27o độ vĩ Bắc, thuộc vùng đảo Bahamas Caicos, tìm thấy bán đảo Yucutan thuộc vùng Đông Bắc Mỹ Biến chủng hondurensis phân bố tự nhiên từ 12o 16o độ vĩ Bắc, tập trung chủ yếu đảo Belize, Guatelama, Poptun, Guanaja, Nicazagua Sinh trưởng chủ yếu khu vực ®ång cá, ®ång b»ng ven biÓn cã ®é cao so với mặt nước biển 460 760 m, phân bố tập trung nhiều độ cao 460 m (Perry JP Jr, 1991) [4] Gỗ Thông caribê có thớ thẳng mịn, độ bóng vừa phải, thường sử dụng làm ván ép, thân Thông caribê thẳng, dễ cưa xẻ phụ thuộc nhiều vào độ tuổi - 10 - (Bredenkamp Van Vuuren, 1987) [25] Ngoài Thông caribê có nhiều công dụng khác như: gỗ xây dựng, gỗ trụ mỏ, ván dăm, ván ép, bột giấy, gỗ đóng tàu thuyền, ván ốp tường, gỗ đóng congtenơ, ván ốp trần, gỗ đóng đồ hộp, gỗ cột điện, gỗ cột nhà, gỗ nội thất, than củi Với tốc độ sinh trưởng nhanh khả thích ứng rộng với vùng sinh thái khác giới, đáp ứng nhiều mục tiêu kinh tế nên Thông caribê đà dẫn nhập gây trồng 65 nước giới, chủ yếu nước thuộc vùng Nhiệt đới nhiệt đới Giới hạn vĩ độ trồng mở rộng nhiều so với nơi nguyên sản, từ vÜ ®é 55o Nam ë Argentina tíi 33o vÜ ®é Bắc ấn Độ Dương, giới hạn kinh độ mở rộng từ 180o kinh đông Fiji tới 158o kinh độ tây Hawaii Độ cao vùng trồng biến động từ mặt nước biển tới 1200 m Zaire, 1220 m ë Nigeria, trªn 1820 m ë Uganda vµ 2400 m ë Kenya (Anoruo vµ Berlyn, 1993) [5] Như vậy, Thông caribê đà gây trồng tất dạng khí hậu nước nhiệt đới cận nhiệt đới Vùng phân bố rừng trồng loài mở rộng vĩ độ kinh ®é, c¶ vïng cã khÝ hËu miỊn nói tíi khÝ hậu cận nhiệt đới vùng ven biển (Anoruo Berlyn, 1993) [5] Nhìn chung thông Caribê sinh trưởng tốt nhiều loại đất khác trồng phạm vi phân bố tự nhiên chúng ViƯt Nam lµ mét n­íc n»m khu vùc nhiƯt đới Châu á, có điều kiện địa lý tương đồng với phân bố tự nhiên Thông caribê, nên đà đưa vào trồng nước ta từ nhiều năm Ngày Thông caribê đà xác định loài trồng rừng chương trình triệu hecta rừng Các kết khảo nghiệm bước đầu Việt Nam cho thấy thông loài có nhiều triển vọng, đặc biệt biến chủng Pinus caribaea var hondurensis Kết khảo nghiệm Thông caribê Đà Lạt năm 1963 bước đầu cho thấy biến chủng hondurensis Thông caribê có sinh trưởng nhanh, hình dáng thân đẹp, cao, thon đều, tán nhỏ, cành mọc ngang, có tốc độ sinh trưởng nhanh Thông ba tuổi 12, cao bình quân 14.3 m đường kính ngang ngực bình - 55 - Vì với mục đích nhân nhanh chåi, chóng t«i thÊy m«i tr­êng cã 1,0 mg/l BAP 0,5 mg/l NAA thích hợp nhất, tổ hợp hai chất điều hoà sinh trưởng sử dụng với mục đích tạo chồi thí nghiệm sau 3.4 ảnh hưởng số yếu tố đến hình thnh rễ chồi thông in vitro Đây giai đoạn cuối trình nhân giống in vitro, mục tiêu giai đoạn tạo hoàn chỉnh, khoẻ mạnh, có rễ cứng cáp để sinh trưởng, phát triển tốt đưa vườn ươm trồng rừng 3.4.1 ảnh hưởng môi trường nuôi cấy tuổi chồi đến tạo rễ sinh trưởng chồi nuôi cáy in vitro Nhằm mục đích tìm môi trường tạo rễ thích hợp, phân loại đánh giá rễ theo số rễ/cây; chiều dài rễ Trong thí nghiệm thứ nhất, tìm hiểu ảnh hưởng hàm lượng chất dinh dưỡng, tuổi chồi lên tạo rễ sinh trưởng chồi thông in vitro Các chồi thông cấy môi trường tạo rễ theo công thức thí nghiệm Theo dõi số chồi hình thành, tăng trưởng chiều cao chồi con, số liệu phân tích thống kê (phụ lục 9) trình bày bảng 3.8, hình 3.8; 3.9; 3.10 Kết thí nghiệm cho thấy môi trường khác nhau, tuổi chồi khác số chồi hình thành rễ khác nhau, chồi 60; 75 ngày tuổi môi trường GD1/2 GD1/4 cho tû lƯ t¹o rƠ cao nhÊt (tõ 27,27% – 31,82%), chồi 45 ngày tuổi hai môi trường đạt tỷ lệ rễ 7,88 9,09% Chồi 60; 75 ngày tuổi cấy môi trường WPM-1;WPM-2; MCM-1; MCM-2 cho tû lƯ t¸i sinh chåi thÊp (7,88 23,33%), chồi 45 ngày tuổi cho tỷ lệ chồi tạo rễ thấp (