(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô cho 2 dòng bạch đàn lai UP54 và UP99 giống lai giữa bạch đàn uro (eucalyptus urophylla) và bạch đàn pellita

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI & TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHAN QUYỀN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP NI CẤY MƠ CHO HAI DỊNG BẠCH ĐÀN LAI UP54 VÀ UP99: GIỐNG LAI GIỮA BẠCH ĐÀN URO(Eucalyptus urophyla) VÀ BẠCH ĐÀN PELLITA (Eucalyptus pellita) LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, 2014 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI & TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHAN QUYỀN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP NI CẤY MƠ CHO HAI DỊNG BẠCH ĐÀN LAI UP54 VÀ UP99: GIỐNG LAI GIỮA BẠCH ĐÀN URO(Eucalyptus urophyla) VÀ BẠCH ĐÀN PELLITA (Eucalyptus pellita) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS Nghiêm Quỳnh Chi Hà Nội, 2014 LỜI CẢM ƠN Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii Sau thời gian thực đề tài, đến tơi hồn thành đề tài Nhân dịp cho phép tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nghiêm Quỳnh Chi người trực tiếp giúp đỡ hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thiện luận văn Nhân tơi xin chân thành cảm ơn tới lãnh đạo, tập thể cán bộ, nhân viên, đặc biệt anh, chị, em Bộ môn CNTB thực vật Viện nghiên cứu Giống Công nghệ sinh học lâm nghiệp quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân động viên ủng hộ suốt thời gian học tập làm nghiên cứu Viện nghiên cứu Giống Công nghệ sinh học lâm nghiệp Do cộng tác viên đề tài “Nghiên cứu nhân nhanh số giống keo Bạch đàn công nghệ tế bào thực vật’’ đồng ý chủ nhiệm đề tài nên số liệu luận văn có sử dụng phần kết nghiên cứu đề tài Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Phan Quyền MỤC LỤC Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Phân bố tự nhiên khả sinh trƣởng đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Bạch đàn uro (Eucalyptus urophylla S.T.Blake) 1.1.2 Bạch đàn pellita (Eucalyptus pellita F Muell) 1.2 Khả lai giống tiềm sử dụng giống lai Bạch đàn uro Bạch đàn pellita 1.3 Khái niệm sở khoa học phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 1.3.1 Khái niệm 10 1.3.2 Cơ sở khoa học 11 1.3.2.1 Tính tồn tế bào 11 1.3.2.2 Sự phân hoá phản phân hoá tế bào 11 1.3.2.3 Môi trường dinh dưỡng 12 1.4 Nhân giống nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 1.4.1 Ưu nhược điểm nhân giống nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 1.4.2 Các giai đoạn quy trình ni cấy mơ 13 1.4.3 Các nhân tố ảnh hưởng tới trình nuôi cấy mô 15 1.4.4 Những vấn đề thường gặp nhân giống in vitro giải pháp khắc phục 21 1.5 Thành tựu công nghệ nuôi cấy mô công tác nhân giống lâm nghiệp 22 1.5.1 Ngoài nước 22 1.5.2 Trong nước 25 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv Chƣơng 2: MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 28 2.1.1 Mục tiêu chung 28 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 28 2.2 Đối tƣợng nghiên cứu 28 2.3 Nội dung nghiên cứu 28 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 29 2.4.1 Vật liệu nuôi cấy 29 2.4.2 Địa điểm điều kiện bố trí thí nghiệm 29 2.4.3 Phương pháp tiến hành 29 2.5 Các bƣớc nhân giống in vitro cho Bạch đàn lai UP54 UP99 31 2.5.1 Các cơng thức thí nghiệm 31 2.5.2 Thu thập xử lý số liệu 34 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Xác định phƣơng pháp khử trùng thích hợp 38 3.1.1 Ảnh hưởng hóa chất, nồng độ thời gian tới kết khử trùng 38 3.1.2 Ảnh hưởng thời điểm lấy mẫu năm tới kết khử trùng 41 3.2 Xác định môi trƣờng nuôi cấy 43 3.3 Ảnh hƣởng chế độ nuôi sáng – tối tới kết nhân chồi 44 3.4 Xác định môi trƣờng nhân nhanh số lƣợng chồi 47 3.4.1 Ảnh hưởng BAP đến hệ số nhân chồi (HSNC) tỷ lệ chồi hữu hiệu (TLCHH) 48 3.4.2 Ảnh hưởng phối hợp BAP + Kinetin (Kn) đến hệ số nhân chồi tỷ lệ chồi hữu hiệu 50 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v 3.5 Xác định môi trƣờng nâng cao chất lƣợng chồi 53 3.5.1 Ảnh hưởng phối hợp BAP + Kn + NAA đến HSNC TLCHH 53 3.5.2 Ảnh hưởng phối hợp BAP + Kn + IAA đến HSNC TLCHH 55 3.6 Xác định môi trƣờng rễ 57 3.6.1 Ảnh hưởng IBA đến trình rễ Bạch đàn lai UP54 UP99 57 3.6.2 Ảnh hưởng phối hợp IBA ABT1 đến hiệu rễ Bạch đàn lai UP54 UP99 59 3.6.3 Ảnh hưởng phối hợp IBA + NAA đến hiệu rễ bạch đàn lai UP54 UP99 61 3.6.4 Ảnh hưởng phối hợp IBA IAA đến hiệu rễ bạch đàn lai UP54 UP99 63 3.7 Ảnh hƣởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chiều cao vƣờn ƣơm 65 3.8 Thảo luận chung 68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt BAP HSNC Nghĩa đầy đủ 6- Benzyl Amino Purine Hệ số nhân chồi B5 Mơi trường Gamborg BT Bình thường Ca(OCl)2 Hypoclorit canxi GA3 Gibberellic Acid H2O2 Ôxi già HgCl2 Clorua thuỷ ngân IAA Indol 3- Acetic Acid IBA Indol Butiric Acid Kn Kinetin MS* Môi trường MS cải tiến NAA Naphthy acetic Acid NaClO PVP Hypoclorit natri Polyvinyl Pyrrolidone Sd Sai tiêu chuẩn mẫu Tb Trung bình UP E urophylla x E pellita TLBCHH Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu TLCHH WPM Tỷ lệ chồi hữu hiệu Môi trường cho thân gỗ Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 3.1 Kết thí nghiệm khử trùng mẫu cho bạch đàn lai: UP54 39 UP99 (sau 25 ngày khử trùng) 3.2 Ảnh hưởng mùa vụ đến khả tái sinh chồi bạch đàn 42 lai UP54 UP99 (sau 25 ngày khử trùng) 3.3 Ảnh hưởng loại môi trường đến khả nhân chồi bạch 43 đàn lai UP54 UP99 (sau 15 ngày cấy chuyển) 3.4 Ảnh hưởng chế độ nuôi sáng – tối tới kết nhân chồi 45 Bạch đàn lai UP54 UP99 (sau 15 ngày cấy) 3.5 Ảnh hưởng BAP đến hệ số nhân chồi tỷ lệ chồi hữu 49 hiệu Bạch đàn lai UP54 UP99 (sau 15 ngày nuôi cấy) 3.6 Ảnh hưởng phối hợp BAP + Kn đến HSNC TLCHH 51 Bạch đàn lai UP54 UP99 (sau 15 ngày nuôi cấy) 3.7 Ảnh hưởng phối hợp BAP + Kn + NAA đến HSNC 54 TLCHH Bạch đàn lai UP54 UP99 (sau 15 ngày cấy) 3.8 Ảnh hưởng phối hợp BAP + Kn + IAA đến HSNC 55 TLCHH Bạch đàn lai UP54 UP99(sau 15 ngày cấy) 3.9 Ảnh hưởng IBA đến trình rễ Bạch đàn lai 58 UP54 UP99(sau 15 ngày cấy) 3.10 Ảnh hưởng phối hợp IBA ABT đến hiệu rễ 60 Bạch đàn lai UP54 UP99 (sau 15 ngày) 3.11 Ảnh hưởng phồi hợp IBA + NAA đến hiệu rễ 62 Bạch đàn lai UP54 UP99 (sau 15 ngày cấy) 3.12 Ảnh hưởng phối hợp IBA IAA đến hiệu rễ Bạch 63 đàn lai UP54 UP99 (sau 15 ngày cấy) 3.13 Ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chiều cao vườn ươm (sau tháng cấy vào giá thể) Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 66 viii DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang 1.1 Phân bố tự nhiên bạch đàn urô 1.2 Phân bố tự nhiên bạch đàn pellita 3.1 Cây vật liệu dùng để vào mẫu, sau tuyển chọn dẫn 41 giống trồng vườn ươm 3.2 Các chồi bất định Bạch đàn lai UP54 UP99 sau 25 ngày khử 41 trùng 3.3 Ảnh hưởng chế độ nuôi sáng- tối tới hiệu nhân chồi 47 dòng UP99 3.4 Ảnh hưởng BAP Kn tới khả nhân chồi cho bạch 52 đàn lai UP99(sau 15 ngày nuôi cấy) 3.5 Chồi Bạch đàn lai UP54(trái) UP99(phải) môi 56 trường nâng cao chất lượng chồi 3.6 Ảnh hưởng IBA đến hiệu rễ bạch đàn lai UP99 59 3.7 Bình rễ Bạch đàn lai UP54 UP99 64 3.8 Ảnh hưởng ABT, IAA NAA đến hiệu rễ 65 bạch đàn lai UP54 3.9 Bạch đàn rễ huấn luyện trước cấy vào giá thể 3.10 Cây UP54 UP99 vườn ươm Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN 67 67 http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐẶT VẤN ĐỀ Giống khâu quan trọng sản xuất nông lâm nghiệp, đặc biệt rừng có đời sống dài ngày, lâu thu hoạch sản phẩm, diện tích canh tác lớn khó có điều kiện áp dụng biện pháp kỹ thuật thâm canh nông nghiệp, nên việc sử dụng giống có chất lượng di truyền cải thiện, phù hợp với mục tiêu kinh tế đặt phù hợp với vùng sinh thái vô quan trọng Các hoạt động cho chương trình cải thiện giống rừng sau: Chọn lọc khảo nghiệm loài  xuất xứ  chọn lọc trội  xây dựng rừng giống vườn giống  lai giống  nhân giống  rừng trồng Như thấy nhân giống khâu cuối công tác giống, song quan trọng giúp cung cấp giống với số lượng lớn chất lượng di truyền ổn định, từ nâng cao suất chất lượng rừng trồng Có hai phương pháp nhân giống chủ yếu, (i) nhân giống hữu tính (bằng hạt), thực cấp khác (rừng giống hay vườn giống); (ii) nhân giống sinh dưỡng hom mô tế bào Tuỳ đối tượng cụ thể mà áp dụng phương pháp nhân giống thích hợp nhằm đưa lại hiệu cao Tuy nhiên, nhân giống sinh dưỡng dùng phổ biến để cung cấp giống với số lượng lớn chất lượng ổn định cho trồng rừng thương mại, nhân giống sinh dưỡng phương thức nhân giống dựa sở phân bào ngun nhiễm, lối phân bào khơng có tái tổ hợp thể nhiễm sắc trình phân chia, hom mơ giữ đặc tính di truyền giống, đặc biệt để nhân dòng lai đời F1 Hiện nay, nhân giống sinh dưỡng phương pháp nuôi cấy mô (tissue culture) xem giải pháp công nghệ hàng đầu từ mẫu nuôi cấy, chủ yếu phận tách rời thực vật (các mơ phân sinh mơ đỉnh chồi cành có kích thước 0,1mm – 1,0 cm) tạo hàng triệu Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 61 Phân tích kết thí nghiệm cho thấy: Nồng độ ABT1 ảnh hưởng không đồng đến hiệu rễ cho hai dòng bạch đàn lai UP Khi ta cho thêm ABT1 vào mơi trường có IBA cho hiệu rễ tốt sử dụng đơn lẻ IBA môi trường rễ Với dịng UP54 nồng độ ABT1 cho hiệu tốt 0,25 mg/l với tỷ lệ chồi rễ đạt 90,18%, số rễ trung bình 2,86 rễ/cây, chiều dài trung bình rễ 1,15 cm, cịn dịng UP99 nồng độ 0,5mg/l cho hiệu cao với tỷ lệ chồi rễ đạt 91,25%, số rễ trung bình 3,21 rễ/cây, chiều dài trung bình rễ 1,17 cm Rễ hình thành phát triển đồng đều, rễ to mập, màu trắng Khi tăng nồng độ ABT1 tăng lên ta nhận thấy tiêu theo dõi giảm Bổ sung nồng độ 1mg/l ABT1 làm rễ tạo thành bị thâm đen, ngắn sùi to gốc chồi Như vậy, mơi trường rễ thích hợp cho hai dịng Bạch đàn lai UP54 UP99 phối hợp IBA ABT1 là: + Dịng UP54 mơi trường: ½ MS* + 1,5mg/l IBA + 0,25mg/lABT1 + Dòng UP99 mơi trường: ½ MS* + 1,5mg/l IBA + 0,5mg/lABT1 3.6.3 Ảnh hưởng phối hợp IBA + NAA đến hiệu rễ bạch đàn lai UP54 UP99 NAA chất điều hịa sinh trưởng có tác dụng kích thích hình thành rễ bất định Hiện NAA sử dụng nhiều để tạo hoản chỉnh Đoàn Thị Ái Thuyền cộng sự, 2005 sử dụng NAA môi trường rễ Hông: 1/2MS* + 0,1mg/l NAA; Hồ Văn Giảng cộng sự, 2006 đưa mơi trường rễ cho Dó trầm: WPM + 0,3mg/l NAA… Thí nghiệm tiến hành bổ sung NAA theo thang nồng độ: 0mg/l(ĐC), 0.25mg/l, 0.5mg/l, 0.75mg/l 1mg/l vào mơi trường rễ ½ MS* + 1,5mg/lIBA Kết thí nghiệm cho thấy: Nồng độ NAA ảnh hưởng không đồng đén hiệu rễ cho hai dòng bạch đàn lai UP Với dòng UP54 cho kết Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 62 rễ tốt bổ sung thêm NAA với nồng độ 0,25mg/l , tỷ lệ chồi rễ đạt 78,54%; số rễ trung bình 2,65 ; chiều dài rễ TB 1,09cm Cịn dịng UP99 cho kết rễ tốt bổ sung thêm NAA với nồng độ 0,5mg/l, tỷ lệ rễ đạt 80,11%; số rễ trung bình 2,81; chiều dài trung bình 1,03 cm Nhưng tăng nồng độ NAA lên ta thấy tiêu theo dõi giảm rõ rệt Đặc biệt bổ sung NAA nồng độ 1mg/l cho tỷ lệ chồi rễ, số rễ TB chiều dài TB có xu hướng giảm dần hàm lượng auxin ngoại sinh cao gây ức chế rễ, rễ sinh mảnh, ngắn thâm đen(Bảng 3.11) Bảng 3.11 Ảnh hưởng phối hợp IBA + NAA đến hiệu rễ Bạch đàn lai UP54 UP99 (sau 15 ngày cấy) Dịng Mơi trƣờng ½ MS* + 1,5mg/l IBA + UP54 NAA (mg/l) 0,25 0,5 0,75 1,0 Tỷ lệ chồi rễ (%) Tb 63,56 78,54 59,25 49,86 42,14 Sd 2,2 1,3 1,2 2,2 1,3 Số rễ TB (rễ/cây) Tb 2,23 2,65 2,46 2,64 2,34 Sd 0,4 0,1 0,3 0,02 0,06 Chiều dài TB rễ (cm) Tb Sd 1,07 0,01 0,1 1,09 0,79 0,04 0,61 0,02 0,62 0,1 Ftính = 160,32 > F05 = 3,47 (Tỷ lệ chồi rễ) Ftính = 28,16 > F05 = 3,47 ( Số rễ TB) UP99 1/2MS* + 1,5mg/l IBA + 0,25 0,5 0,75 1,0 63,95 71,23 80,11 59,72 48,23 1,3 1,3 2,6 2,2 2,6 2,43 2,59 2,81 2,69 2,71 0,02 0,9 0,1 0,9 0,1 0,87 1,02 1,03 0,84 0,73 Ftính = 90,24 > F05 = 3,47 (Tỷ lệ chồi rễ) Ftính = 26,97 > F05 = 3,47 ( Số rễ TB) Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 0,2 0,1 0,04 0,1 0,04 63 Như vậy, môi trường rễ thích hợp cho hai dịng Bạch đàn lai UP54 UP99 phối hợp IBA NAA là: + Dịng UP54 mơi trường: ½ MS* + 1,5mg/l IBA + 0,25mg/l NAA + Dịng UP99 mơi trường: ½ MS* + 1,5mg/l IBA + 0,5mg/l NAA 3.6.4 Ảnh hưởng phối hợp IBA IAA đến hiệu rễ bạch đàn lai UP54 UP99 IAA ba Auxin hay gặp thường dùng nuôi cấy tế bào thực vật Cũng IBA NAA, IAA có tác dụng kích thích tạo rễ bất định Thí nghiệm tiến hành xác định ảnh hưởng IAA đến hiệu rễ với thang nồng độ: 0mg/l (ĐC); 0,25; 0,5; 0,75 1,0 mg/l vào mơi trường có IBA Kết thí nghiệm tổng hợp Bảng 3.12 Bảng 3.12 Ảnh hưởng phối hợp IBA IAA đến hiệu rễ Bạch đàn lai UP54 UP99 (sau 15 ngày cấy) Dịng Mơi trƣờng ½ MS* + 1,5 mg/l UP54 IBA + UP99 ½ MS* + 1,5 mg/l IBA + IAA (mg/l) 0,25 0,5 0,75 0,25 0,5 0,75 Tỷ lệ chồi rễ (%) Số rễ TB (rễ/cây) Chiều dài TB rễ (cm) Tb Sd Tb Sd Tb 63,11 0,2 2,62 0,8 1,08 1,3 0,4 75,86 2,85 1,12 62,36 1,1 2,69 0,1 0,89 55,15 1,3 2,55 0,9 0,74 44,38 2,2 2,45 0,6 0,59 Ftính = 178,2 > F05 = 3,47 (Tỷ lệ chồi rễ) Ftính = 40,54 > F05 = 3,47 ( Số rễ TB) 63,85 1,5 2,54 0,2 0,88 73,25 1,3 2,59 0,3 1,02 1,3 0,2 77,48 2,89 1,19 59,12 2,2 2,85 0,1 0,88 49,22 2,3 2,78 0,1 0,74 Ftính = 119,92 > F05 = 3,47 (Tỷ lệ chồi rễ) Ftính = 32,48 > F05 = 3,47 ( Số rễ TB) Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Sd 0,03 0,04 0,1 0,1 0,01 0,03 0,1 0,1 0,1 0,1 64 Kết phân tích số liệu cho thấy: Đối với dòng UP54 cho hiệu rễ cao bổ sung 0,25 mg/l IAA, cho tỷ lệ rễ đạt 75,86 %; số rễ trung bình 2,85 rễ/ cây; chiều dài trung bình rễ 1,12 cm tiếp tục tăng nồng độ IAA lên tiêu đo đếm giảm nồng độ auxin cao gây ức chế q trình rễ.Cịn với dịng UP99 lại cho hiệu rễ cao bổ sung 0,5 mg/l IAA, cho tỷ lệ rễ đạt 77,48; số rễ trung bình 2,89 rễ/cái; chiều dài trung bình rễ 1,19 cm, giống dòng UP54 ta tăng nồng độ IAA lên tiêu đo đếm giảm Như vậy, mơi trường rễ thích hợp cho hai dòng Bạch đàn lai UP54 UP99 phối hợp IBA IAA là: + Dịng UP54 mơi trường: ½ MS* + 1,5mg/l IBA + 0,25mg/l IAA + Dòng UP99 mơi trường: ½ MS* + 1,5mg/l IBA + 0,5mg/l IAA UP54 UP99 UP54 UP99 Hình 3.7 Bình rễ Bạch đàn lai UP54 UP99 Từ kết thí nghiệm ảnh hưởng Auxin đến hiệu rễ cho bạch đàn lai UP54 UP99 trên, đề tài rút nhận xét: - Khi bổ sung nồng độ sử dụng hóa chất khác cho hiệu rễ không giống ABT cho hiệu tốt nhất, tiếp sau NAA cuối IAA Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 65 - Mơi trường có phối hợp chất cho hiệu rễ tốt so với môi trường sử dụng chất đơn lẻ Kết luận: Từ kết thí nghiệm rễ trên, đề tài xác định môi trường rễ tối ưu cho bạch đàn lai UP54 UP99 là: + Với dòng UP54 môi trường: 1/2MS* + 1,5mg/l IBA + 0,25mg/l ABT1 + Với dịng UP99 mơi trường: 1/2MS* + 1,5mg/l IBA +0,5mg/l ABT1 1/2MS*+ IBA + NAA 1/2MS*+ IBA + IAA 1/2MS*+ IBA + ABT1 Hình 3.8 Ảnh hưởng ABT1, IAA NAA đến hiệu rễ bạch đàn lai UP54 3.7 Ảnh hƣởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chiều cao vƣờn ƣơm Cây rễ in vitro điều kiện nhân tạo đưa nhà huấn luyện cho tiếp xúc với điều kiện ánh sáng tự nhiên trước cấy vào giá thể vườn ươm Đây giai đoạn quan trọng trình sản xuất giống phương pháp nuôi cấy mô tế bào, có ý nghĩa thiết thực việc ứng dụng trình vi nhân giống vào thực tiễn sản xuất Đề tài thử nghiệm Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 66 ảnh hưởng công thức thời gian huấn luyện sau: (i) không huấn luyện (ii) huấn luyện 4, 8, 12 16 ngày để theo dõi tỷ lệ sống sinh trưởng vườn ươm Cây sau huấn luyện theo công thức cấy vào giá thể cát bầu đất, chăm sóc vườn ươm tương tự đối tượng Bạch đàn khác (Đoàn Thị Mai cộng 2011) Kết thu sau tuần sau cấy vào giá thể trình bày Bảng 3.13 Bảng 3.13 Ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chiều cao vườn ươm (sau tháng cấy vào giá thể) Dòng UP54 Thời gian huấn Tỷ lệ sống (%) Chiều cao TB (cm) luyện ( ngày) Tb Sd Tb Sd 0→4 45,6 1,26 6,26 2,28 4→8 75,7 2,24 6,30 1,55 8→12 93,3 2,24 6,43 0,14 12 → 16 92,2 1,27 6,40 0,19 Ftính = 25,35 > F05 = 4,07 (Tỷ lệ sống) Ftính = 15,32 > F05 = 4,07 ( Chiều cao TB) UP99 0→4 42,3 2,22 6,28 0,62 4→8 70,9 1,28 6,29 1,21 8→12 90,4 1,28 6,33 2,21 12 → 16 88,5 2,57 6,24 1,42 Ftính = 24,46 > F05 = 4,07 (Tỷ lệ sống) Ftính = 36,12 > F05 = 4,07 ( Chiều cao TB) Từ kết thí nghiệm cho thấy: Thời gian huấn luyện có ảnh hưởng rõ đến tỷ lệ sống vườn ươm Cây không huấn luyện đạt tỷ lệ sống thấp( đạt 45,6% với dòng UP54 42,3% với dòng UP99).Tỷ lệ Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 67 sống tăng lên kéo dài thời gian huấn luyện đạt tỷ lệ sống cao huấn luyện khoảng thời gian từ 8– 12 ngày: dịng UP54 có tỷ lệ sống 93,3% gấp 2,04 lần; dịng UP99 có tỷ lệ sống 90,4% gấp 2,08 lần so với tỷ lệ sống huấn luyện từ – ngày (cho tỷ lệ sống thấp nhất) Cây huấn luyện khoảng thời gian cho rễ phát triển cân đối, rễ mập, đanh Tỷ lệ bắt đầu giảm thời gian huấn luyện lên tới 16 ngày Qua quan sát thấy với thời gian huấn luyện nhiều 16 ngày rễ bình thường bị đen, xuất nhiều rễ chết Hình 3.9 Bạch đàn rễ huấn luyện trước cấy vào giá thể UP54 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN UP99 http://www.lrc.tnu.edu.vn 68 Hình 3.10 Cây UP54 UP99 vườn ươm Như vậy, thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chiều cao vườn ươm hiệu khoảng thời gian từ – 12 ngày 3.8 Thảo luận chung Trong quy trình nhân giống in vitro khâu vào mẫu đóng vai trị tạo vật liệu ni cấy khởi đầu cho quy trình Việc lựa chọn chế độ khử trùng thích hợp tạo điều kiện thuận lơi cho khâu sau Thông thường người ta hay sử dụng NaClO, Ca(OCl)2, HgCl2, H2O2 nồng độ thời gian khác Ở đề tài sử dụng hai loại hóa chất: HgCl2 (nồng độ 0,1% 0,05%) Ca(OCl)2 (nồng độ 5% 10%) Kết cho thấy HgCl2 cho hiệu khử trùng cao Hóa chất, nồng độ thời gian khử trùng thích hợp cho hai dịng Bạch đàn lai UP54 UP99 HgCl2 0,1% khử trùng thời gian từ phút Bên cạnh chọn hóa chất nồng độ khử trùng thích hợp, đề tài nhận thấy thời điểm lấy mẫu năm ảnh hưởng tới lớn tới kết khử trùng , thời điểm lấy mẫu thích hợp từ tháng – năm, thời điểm chồi phát triển mạnh Nuôi cấy in vitro có ưu điểm vượt trội hệ số nhân giống cao mà việc tìm mơi trường ni cấy môi trường nhân nhanh, nâng cao chất lượng chồi quan trọng Xuất phát từ việc xác định môi trường nuôi cấy MS, đề tài thay đổi bổ sung thêm số chất điều hòa sinh trưởng, vitamin, PVP… tạo mơi trường MS cải tiến (MS*) Thí nghiệm xác định môi trường nhân nhanh chồi sử dụng BAP đóng vài trị chủ đạo có thêm Cytokine khác phối hợp Kết cho thấy có mặt phối hợp BAP Kn có ảnh hưởng lớn đến HSNC TLCHH Tuy nhiên đặc điểm di truyền dịng khơng giống Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 69 tạo phản ứng khác với môi trường , nồng độ ni cấy Chính HSNC dịng nghiên cứu có sai khác, bên cạnh xác định loại mơi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi, đề tài nhận thấy phương pháp cấy ảnh hưởng tới kết nhân nhanh chồi, kết cho thấy cấy dập cho kết nhân chồi cao so với cấy thẳng, cấy dập diện tích tiếp xúc tế bào với môi trường cao hơn, chồi nuôi cấy hấp thu trao đổi tối đa nguồn dinh dưỡng có mơi trường ni cấy Mặt khác, chồi cắt thành nhiều đoạn (mỗi đoạn bao gồm đốt có mắt ngủ) mắt tạo nên cụm chồi gồm nhiều chồi nhỏ Trong mơi trường nâng cao chất lượng chồi việc bổ sung NAA có hiệu so với IAA hai dòng Bạch đàn UP nghiên cứu Trong mơi trường rễ phối hợp IBA +ABT1 lại cho hiệu rễ tốt tổ hợp IBA + NAA Mặc dù tổ hợp IBA +NAA cho hiệu rễ cao song tốc độ rễ chậm dùng có bổ sung ABT1 Kết đề tài cho thấy môi trường nhân chồi rễ sử BAP (hay IBA) làm nhân tố chủ đạo Auxin hay Cytokin phối hợp thường sử dụng có hiệu bổ sung nồng độ thấp (0 – 0,5 mg/l) Nếu bổ sung nồng độ cao thường gây ức chế nhân chồi hay rễ, chất lượng chồi, giảm Bên cạnh chế độ ni phịng chế độ huấn luyện trước đem trồng vào giá thể có ảnh hưởng lớn Thời gian huấn luyện phù hợp (8 – 12 ngày) giúp cứng cáp, rễ phát triển cân đối , giúp làm quen thích nghi dần với mơi trường tự nhiên bên ngồi Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 70 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu nhân giống nuôi cấy mơ cho dịng bạch đàn lai UP54 UP99, đề tài rút số kết luận sau: Loại hóa chất, nồng độ thời gian khử trùng có ảnh hưởng đến kết khử trùng mẫu vật: Phương thức khử trùng tốt cho Bạch đàn lai UP54 UP99 sử dụng dung dịch HgCl2 0,1% phút Thời điểm lấy mẫu năm có ảnh hưởng tới kết khử trùng mẫu vật: Thời điểm lấy mẫu thích hợp cho Bạch đàn lai UP54 UP99 từ tháng – năm Chế độ ni sáng – tối có ảnh hưởng rõ rệt đến kết nhân chồi: Chế độ nuôi ngày sáng : ngày tối : ngày sáng tốt cho Bạch đàn lai UP54 UP99 Cho dù Bạch đàn lai UP song phản ứng với môi trường nuôi cấy dịng khơng giống nhau: * Mơi trường nhân nhanh chồi thích hợp + Dịng UP54 là: MS* + 30 g/l đường + 3,7 g/l agar + 1,0 mg/l BAP + Dòng UP99 là: MS* + 30 g/l đường + 3,7 g/l agar + 1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kn * Môi trường nâng cao chất lượng chồi thích hợp + Dịng UP54 là: MS* + 1,0 mg/l BAP + 0,25 mg/l NAA + Dòng UP99 là: MS* + 1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kn + 0,25 mg/l NAA * Mơi trường rễ thích hợp: + Dịng UP54 : ½ MS* +15 g/l đường + 4,1 g/l agar + 1,5 mg/l IBA + 0,25 mg/l ABT1 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 71 + Dịng UP99 là: ½ MS* +15 g/l đường + 4,1 g/l agar + 1,5 mg/l IBA + 0,5 mg/l ABT1 Thời gian huấn luyện để rễ thích nghi dần với điều kiện tự nhiên có ảnh hưởng đến tỷ lệ sống sinh trưởng giai đoạn vườn ươm: Với hai dòng Bạch đàn lai UP54 UP99 chồi non sau rễ huấn luyện -12 ngày trước cấy vào giá thể cho tỷ lệ sống cao Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu nhân giống in vitro cho dịng Bạch đàn lai khác để hồn thiện quy trình nhân giống cho dịng Bạch đàn lai công nhận giống TBKT Tiếp tục nghiên cứu cải tiến phương pháp nhân giống, rút ngắn công đoạn để giảm bớt giá thành in vitro => Người dân dễ tiếp nhận giống đưa vào trồng rừng sản xuất Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Bá (2006) Hình thái học thực vật Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Việt Cường, 2006 Nghiên cứu lai giống số loài Bạch đàn, thông, keo.Báo cáo tổng kết đề tài, Hà Nội 137 trang Lê Văn Chi, 1992 Cách sử dụng chất điều hoà sinh trưởng vi lượng hiệu cao NXB Khoa học - Kỹ thuật, Hà Nội Dương Mộng Hùng, 1993 Chọn trội nhân giống ni cấy mơ tế bào cho hai lồi Bạch đàn E camaldulensis E Urophylla Báo cáo đề tài, trường Đại học Lâm nghiệp, Hà Tây Lê Đình Khả, 1970 Di truyền chọn giống rừng Trường Đại học Lâm nghiệp Lê Đình Khả Nguyễn Việt Cường, 2001 Ưu lai sinh trưởng tính chống chịu số tổ hợp lai khác lồi Bạch đàn Nhà xuất Nơng nghiệp, Hà Nội, tr 41- 43 Lê Đình Khả, Đồn Thị Mai 2002 Một số phương thức nhân giống sinh dưỡng sản xuất lâm nghiệp Công nghệ nhân sản xuất giống trồng, giống lâm nghiệp giống vật nuôi Nhà xuất Lao động xã hội (Chủ biên: Ngô Thế Dân, Lê Hưng Quốc) Hà Nội (2002), tr 166-182 Lê Đình Khả, Dương Mộng Hùng, 2003 Giống rừng NXB Nông nghiệp, Hà Nội Lê Đình Khả cộng sự, 2003 Chọn tạo nhân giống cho số loài trồng rừng chủ yếu Việt Nam NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 10.Lê Đình Khả, Hà Huy Thịnh Nguyễn Việt Cường, 2005 Cải thiện giống bạch đàn cho chương trình trồng rừng Việt Nam.KHCN NN&PTNT 20 năm đổi mới- Bộ NN&PTNT – tập 5: trang 169-178 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 73 11.Lê Đình Khả (2006) Lai giống rừng Nhà xuất Nông nghiệp 12 Trần Văn Minh (1999) Công nghệ tế bào thực vật Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh- Trường ĐH Nơng Lâm 13 Đồn Thị Mai cộng sự, 2000 Kết bước đầu nhân giống Bạch đàn lai phương pháp ni cấy mơ phân sinh Tạp chí Lâm nghiệp, (số 10/2000), tr 46-47 14 Đoàn Thị Mai cộng (2005), “Bước đầu ứng dụng công nghệ mơ hom nhân giống Trầm hương”, Tạp chí NN&PTNT (số 2), tr 57-67 15 Đoàn Thị Mai cộng sự, 2011 Nhân giống cho số giống rừng chọn tạo nuôi cấy mô tế bào Tạp chí KHLN số đặc biệt 2011, pp 1509 – 1518 16 Nguyễn Hồng Nghĩa, Lê Đình Khả, Hồng Chương (1993), Kết khảo nghiệm loài xuất xứ bạch đàn giai đoạn 1990-1992, Báo cáo khoa học, Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam, 41 trang 17 Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2001 Nhân giống vơ tính trồng rừng dịng vơ tính Nhà xuất Nơng nghiệp, 120 trang 18 Vũ Ngọc Phượng cộng sự, (2002), “Nhân giống in vitro Tre tàu (Sinocalamus latiflorus) Tre mạnh tông (Dendrocalamus asper)”, Tạp chí sinh học (số 6), tr 59-64 19 Hồ Văn Giảng, Vũ Thị Huệ, (2006), “Xây dựng qui trình nhân giống Gió trầm kỹ thuật ni cấy mơ-tế bào”, Tạp chí Nơng nghiệp & phát triển nông thôn, (số đặc san 1-2006) 20 Nguyễn Dương Tài,1994 Bước đầu khảo nghiệm xuất xứ Bạch đàn E.urophylla vùng nguyên liệu giấy trung tâm miền Bắc Việt Nam Luận án PTS khoa học nông nghiệp, Đại học lâm nghiệp,153 trang 21 Nguyễn Quang Thạch, 1995 Công nghệ sinh học thực vật NXB Nông nghiệp, Hà Nội Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 74 22 Nguyễn Quang Thạch, 2000 Giáo trình sinh lý thực vật Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 23 Nguyễn Đức Thành, 2000 Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dụng NXB Nông nghiệp, Hà Nội 24 Đoàn Thị Ái Thuyền cộng sự, 2005 Nhân giống vơ tính Hơng (Paulownia fortunei Hemsi) phương pháp ni cấy mơ Tạp chí sinh học, (số 9), tr 46-50 25 Vũ Văn Vụ, 1994 Sinh lý học thực vật Nhà xuất Khoa học - Kỹ thuật, Hà Nội, tr 182 - 237 26 Nguyễn Văn Uyển, 1993 Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống rừng NXB Nông nghiệp, Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 27 Darus H Ahmad 1994 Multiplication of Acacia mangium by stem cutting and tissue culture techniques Advances in tropical acacia research, pp 32-34 28 Harwood, C.E, 1998 Eucalyptus pellita – An annotated bibliography CSIRO Forestry and Forest products, Australia, 69pp 29.Glori A.V., 1993 The Eucalyptus tree improvemenbt of PICOP In Proceeding of the Regional Symposium on Resent Advences in “Mass Multiplication of Forest Trees for plantation Programes”: Ed.by David son J.(ed): UNDP/FAO, Los Banos, Philippines, pp.253 -261 30 Gamborg O L, G C Phillips 1997 Plant Cell, Tissue and Organ culture-bG Fundamental Methods cell spinger Lab Manual 31 Ikemori Y K 1987 Epicormic shoots from branches of Eucalpytus grandis as an explant source for in vitro culture Commw For Rev (66), pp 351-356 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 75 32 Litvay J D et al 2002 Plant cell and tissue culture media Duchefa Biochemie, Hofmanweg 71 2031 BH Haarlem, The Netherlands, p 44 33 Lloyd G and McCown B 1980 Commercially - feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot - tip culture Int Plant Proc 30, pp 410 - 421 34 Murashige T and Skoog F 1962 A resied medium for rapid growth and bioassays wirh tobacco tissue cultures Physiol Plant (15), pp 473-495 35 Street 1974 Plant tissue and cell culture Bormonogrvol, Black well scient, London 36 Trindate, H Ferreina, J G Pais, M S Aloni R 1990 The role of Cytokinin and auxin in rapid multiplication of shoots of Eucalyptus globolus grown in vitro Aust For 53(4), pp 221-223 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ... nước 2. 1 .2 Mục tiêu cụ thể - Xác định môi trường phù hợp để nhân giống hai dòng Bạch đàn lai: UP54 UP99 phương pháp nuôi cấy mô - Tạo hồn chỉnh cho hai dịng Bạch đàn lai: UP54 UP99 phương pháp nuôi. .. 31 2. 5 Các bƣớc nhân giống in vitro cho Bạch đàn lai UP54 UP99 Đề tài thực bước nhân giống nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cho hai dòng Bạch đàn lai UP54 UP99 theo sơ đồ sau: Dòng tuyển chọn (UP54 UP99) ... pháp ni cấy mơ cho dịng Bạch đàn lai UP54 UP99: giống lai Bạch đàn uro (Eucalyptus urophylla) Bạch đàn pellita (Eucalyptus pellita) ” làm nội dung nghiên cứu cho luận văn thạc sỹ Số hóa trung tâm