(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu tạo cây con mây nếp (calamus tetradactylus hance) bằng phương pháp nuôi cấy invitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN THỊ MAI DƯƠNG NGHIÊN CỨU TẠO CÂY CON MÂY NẾP (CALAMUS TETRADACTYLUS HANCE) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP HÀ NỘI, 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN THỊ MAI DƯƠNG NGHIÊN CỨU TẠO CÂY CON MÂY NẾP (CALAMUS TETRADACTYLUS HANCE) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Lâm học Mã số: 60.62.60 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: TS HOÀNG THANH LỘC HÀ NỘI, 2010 ĐẶT VẤN ĐỀ Ở nước ta, lâm sản ngồi gỗ có vai trị đặc biệt quan trọng phát triển kinh tế - xã hội đất nước Mây loài lâm sản ngồi gỗ có giá trị kinh tế cao Nghề gây trồng, chế biến kinh doanh sản phẩm từ mây, tạo nhiều việc làm, tăng thu nhập, cải thiện đời sống cho người dân Trong năm gần đây, việc khai thác mây tự nhiên diễn mức, bất hợp lý, làm cho khu phân bố, trữ lượng mây cịn khơng nhiều Nguồn mây ngun liệu tự nhiên khơng cịn đủ đáp ứng cho sở sản xuất để tạo sản phẩm phục vụ cho nhu cầu sử dụng nước xuất Vì hàng năm phải nhập lượng lớn mây nguyên liệu từ bên ngoài, chủ yếu từ Lào Trung Quốc Hiện nay, nhiều tỉnh nước có chương trình mở rộng diện tích trồng mây nguyên liệu Để nâng cao suất, giống tốt có vai trị quan trọng Giống mây nếp (C tetradactylus Hance) đánh giá giống cho suất giá trị kinh tế cao Việt Nam, nhiều địa phương gây trồng Với diện tích gây trồng mây ngày mở rộng, nên thị trường có nhu cầu lớn giống chất lượng cao Trồng rừng nguyên liệu từ thực sinh thường có tượng phân li hữu tính, nên có sinh trưởng phát triển, có số lượng chất lượng sản phẩm chuyên dụng không đồng Điều ảnh hưởng không nhỏ tới việc gây trồng, chăm sóc, khai thác chế biến Việc áp dụng kỹ thuật tạo phương pháp nuôi cấy mô tế bào - phương pháp nhân giống sinh dưỡng tiên tiến nhằm chủ động tạo số lượng lớn giống có phẩm chất di truyền tốt đồng đều, thời gian ngắn thực việc làm cấp bách đầy ý nghĩa Với ý nghĩa vậy, thực đề tài: “Nghiên cứu tạo mây nếp (Calamus tetradactylus Hance) phương pháp nuôi cấy in vitro" Chương TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Đại cương nuôi cấy mô – tế bào 1.1.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mơ – tế bào thực vật Tính tồn với phân hóa phản phân hóa tế bào sở lý luận kỹ thuật ni cấy mơ – tế bào 1.1.1.1.Tính tồn (Totipotence) tế bào Haberlandt (1902) người đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính tồn tế bào Theo ông, tế bào thể sinh vật mang lượng thông tin di truyền cần thiết đủ sinh vật đó, gặp điều kiện thích hợp tế bào phát triển thành thể hồn chỉnh [2], [12] Tính tồn tế bào mà Haberlandt nêu sở lý luận phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật Đến người hoàn toàn chứng minh khả tái sinh thành thể thực vật hoàn chỉnh từ tế bào riêng rẽ 1.1.1.2 Sự phân hóa phản phân hóa tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành chỉnh thể thống bao gồm nhiều quan chức khác nhau, có nhiều loại tế bào khác thực chức cụ thể khác Tuy nhiên tất loại tế bào bắt nguồn từ tế bào phơi sinh Q trình phân hóa tế bào biểu thị: Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào phân hóa chức Tuy nhiên, tế bào phân hóa thành mơ chức chúng khơng hồn tồn khả phân chia Trong trường hợp cần thiết, điều kiện thích hợp, chúng lại trở dạng tế bào phơi sinh lại phân chia mạnh mẽ Q trình gọi phản phân hóa tế bào, ngược lại với phân hóa tế bào Về chất q trình phân hóa phản phân hóa q trình hoạt hóa phân hóa gen Tại thời điểm q trình phát triển cá thể, có số gen hoạt hóa (mà vốn trước bị ức chế) tính trạng mới, số gen khác lại bị đình hoạt động Điều xảy theo chương trình mã hóa cấu trúc phân tử ADN tế bào Mặt khác, tế bào nằm khối mô thể thường bị ức chế tế bào xung quanh Khi tách riêng rẽ tế bào, gặp điều kiện thuận lợi gen hoạt hóa, q trình phân hóa xảy theo chương trình định sẵn 1.1.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô – tế bào thực vật 1.1.2.1 Trên giới - Giai đoạn khởi xướng (1898 - 1930) Haberlandt (1902) – nhà sinh lý thực vật học người Đức người đề xuất phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật để chứng minh tính tồn tế bào Theo ông, tế bào thể sinh vật mang lượng thông tin di truyền cần thiết đủ sinh vật đó, gặp điều kiện thích hợp tế bào phát triển thành thể hồn chỉnh [12] Tuy nhiên ơng khơng thành cơng thí nghiệm ni cấy tế bào khí khổng - Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930 - 1950) Giai đoạn bắt đầu năm 1934 với cơng trình White (Mỹ) Ơng nuôi cấy thành công rễ cà chua (Lycopersicum esculanum) mơi trưởng lỏng chứa muối khống, glucose dịch chiết nấm men Năm 1935, Thimann phát Auxin (IAA) mô thực vật Nhiều nhà nghiên cứu sử dụng IAA Vitamin bổ sung vào môi trường nuôi cấy thu kết tốt Cũng thời gian này, Gautheret (Pháp) nghiên cứu nuôi cấy mô tượng tầng số thân gỗ Trong năm 1940, nhiều chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm Auxin (NAA, 2,4D) tổng hợp thành công nhiều nhà nghiên cứu sử dụng nuôi cấy mô với nước dừa Kết nghiên cứu cho thấy chất có tác dụng kích thích tạo mơ sẹo, thúc đẩy tế bào phân chia rõ rệt [2] - Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1950 - 1960) Năm 1954 – 1955, Skoog Miller (Mỹ) nuôi cấy mô lõi thuốc xác định vai trò Kinetin kích thích phát triển mơ Năm 1956, Skoog Miller tìm hiểu ảnh hưởng tỷ lệ Auxin/Cytokinin mơi trường ni cấy đến hình thành quan tạo chồi từ mô thuốc nuôi cấy Năm 1956, Nickell nuôi thành công tế bào đơn đậu (Phaseolus vulgaris) dịch lỏng Năm 1960, Bergman tái sinh tế bào đơn thuốc mơi trường lỏng (cịn gọi kỹ thuật gieo tế bào) [2], [14] - Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô vào công nghệ sinh học thực vật (từ 1960 đến nay) Năm 1960, Cooking (Anh) dùng enzym Cellulase để phân hủy vỏ cellulose tế bào thực vật thu tế bào không vỏ, gọi tế bào trần (protoplast) Nitsh (1967), Nakata Tanaka (1968) tạo thuốc đơn bội cách nuôi cấy bao phấn Nakata Tanaka (1970 1971) cho protoplast thuốc tái tạo vỏ Cellulose, tế bào phân chia tạo nên quần lạc tế bào mơi trường lỏng sau tạo hoàn chỉnh Năm 1977, Melchers dung hợp protoplast khoai tây cà chua thành công tạo lai khoai tây – cà chua “Pomate” Từ năm 1965, Ledoux cho gây biến dị di truyền tế bào, chí hạt giống cách cho chúng hấp thụ ADN ngoại lai, ADN ngoại lai sau vào tế bào gắn với ADN nội bào ADN ngoại lai vào tế bào thực vật, đặc biệt tế bào trần, chúng không bị nuclease tế bào chủ phân hủy Từ năm 1980, hàng loạt nghiên cứu lĩnh vực công nghệ sinh học (công nghệ gen) công bố Ngày nuôi cấy mô – tế bào sở quan trọng công nghệ sinh học đại, công cụ quan trọng chọn tạo nhân giống đại mà đóng góp sở lý luận cho sinh học đại 1.1.2.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô – tế bào thực vật Việt Nam Nuôi cấy mô – tế bào thực vật phát triển Việt Nam sau chiến tranh kết thúc (1975) Phịng thí nghiệm ni cấy mơ – tế bào xây dựng Viện Sinh vật học, viện Khoa học Việt Nam (KHVN) PGS.TSKH Lê Thị Muội đứng đầu Phòng nghiên cứu phương pháp nuôi cấy điều kiện Việt Nam nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo protoplast Thành công nuôi cấy bao phấn lúa thuốc công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội cs, 1978; Lê Thị Xuân cs.,1978) Tiếp thành cơng ni cấy protoplast thuốc khoai tây (Lê Thị Muội Nguyễn Đức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành Lê Thị Muội, 1980, 1981) Trong thời gian, phân viện KHVN thành phố Hồ Chí Minh, Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, viện Khoa học kỹ thuật Nơng nghiệp Việt Nam phịng thí nghiệm ni cấy mô – tế bào thành lập chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây Đến nay, nước ta có nhiều phịng thí nghiệm nuôi cấy mô – tế bào viện nghiên cứu (viện Di truyền Nông nghiệp, viện Rau Trung ương, ); trường đại học (Đại học Nông nghiệp I, Đại học Lâm nghiệp, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, ); số tỉnh sở sản xuất giống nông – lâm nghiệp (Yên Bái, Hưng Yên, Bình Định, Đà Lạt, Quảng Ninh, Hịa Bình, Phú Thọ, ) Đối tượng giống sản xuất phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật mở rộng như: bạch đàn, keo, dó trầm, lan, cúc, 1.1.3.Thành tựu ni cấy mơ – tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào thực vật thành công với hàng loạt trồng như: ăn quả, lương thực, công nghiệp, thuốc, hoa loại quý có giá trị cao Ở nước ta, hướng nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật phát triển mạnh từ năm 1980 đạt kết đáng khích lệ lĩnh vực nhân giống in vitro: nhân giống khoai tây, dứa, chuối, mía; số loài hoa như: phong lan, đồng tiền, cúc, cẩm chướng; số lâm nghiệp như: bạch đàn, keo ; dược liệu như: thông đỏ, hao [12] Với công nghiệp, ứng dụng thành cơng phương pháp ni cấy in vitro, góp phần giải nhu cầu nguyên liệu số trồng trọng điểm như: dứa Cayen, mía theo phương pháp nhân cụm chồi Mapes (1974) Với lương thực, kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem) tạo khoai tây virus, lập ngân hàng giống khoai tây hay nuôi cấy bao phấn lúa tạo đơn bội [2], [12], [15] Một số kết bước đầu ghi nhận lĩnh vực chọn dòng tế bào chọn dòng kháng bệnh, chọn dòng chịu muối, chịu nước Nuôi cấy dược liệu quý để bảo tồn nguồn gen tạo dịng tế bào có hàm lượng chất sinh học quan trọng cao phát triển Ni cấy mơ – tế bào cịn ứng dụng để nhân chuyển gen nhằm tạo nhiều trồng chuyển gen với đặc tính mong muốn như: tính kháng virus, kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng côn trùng, kháng thuốc diệt cỏ, kháng kim loại nặng chống băng giá, chống hạn thành công nhiều đối tượng lúa, [2], [12] Đến nay, nuôi cấy mô – tế bào thực vật trở thành công cụ thiếu công nghệ sinh học đại lĩnh vực ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp thực vật, công nghệ tạo giống nhân nhanh giống đại 1.2 Nhân giống vơ tính in vitro 1.2.1 Khái niệm nhân giống vơ tính in vitro - Nhân giống in vitro hay vi nhân giống (micropropagation) hệ thống sử dụng phát triển nhân tạo nhân điểm sinh trưởng tồn mô phân sinh [12] - Nói cách khác, nhân giống in vitro hay vi nhân giống (micropropagation) tăng bội tái sinh sản vật liệu thực vật thu nhỏ ống nghiệm điều kiện môi trường vô trùng điều khiển 1.2.2 Yêu cầu thực tiễn Hiện nay, ngành sản xuất nông lâm nghiệp quan tâm nhiều quốc gia Mong muốn tạo nhiều sản phẩm có suất, chất lượng cao, bệnh phục vụ nhu cầu người Đáp ứng nhu cầu vấn đề đẩy mạnh công tác nhân giống in vitro quan tâm với mục tiêu sau: - Duy trì nhân nhanh kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác nhân giống - Nhân nhanh trì cá thể đầu dịng tốt để cung cấp hạt giống loại trồng khác lương thực, cảnh, dược liệu, loài hoa - Nhân nhanh điều kiện vô trùng cách ly tái nhiễm kết hợp với làm virus - Bảo quản tập đồn giống, nhân giống vơ tính loài giao phấn ngân hàng gen [2] 1.2.3 Một số phương thức nhân giống vô tính in vitro Phương pháp nhân giống in vitro bổ sung cho kỹ thuật nhân giống cổ điển như: chiết cành, ghép, giâm hom Nhân giống in vitro hay vi nhân giống ống nghiệm bốn lĩnh vực ứng dụng cơng nghệ tế bào thực vật mang lại hiệu kinh tế lớn Có phương thức để tạo in vitro: 1.2.3.1 Hoạt hóa chồi nách Hoạt hóa chồi nách cách phá vỡ tượng ưu nuôi cấy đỉnh chồi đoạn thân mang mắt ngủ Theo phương pháp hoạt hóa chồi nách diễn theo cách: - Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh chồi nách (xảy ni cấy lồi hai mầm như: khoai tây, hoa cúc, thuốc ) - Tạo cụm chồi từ đỉnh chồi nách (xảy với mầm như: lúa, mía ) 1.2.3.2 Phương pháp tạo chồi bất định Chồi bất định chồi hình thành từ quan, phận khác cây, phôi Như: chồi hình thành từ mơ sẹo (callus) Tạo chồi bất định sử dụng phận như: đoạn thân, mơ lá, giẻ hành Trong q trình cần thực q trình phản phân hóa tái sinh tế bào để bắt tế bào sơma hình thành chồi trực tiếp gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mơ sẹo 1.2.3.3 Phương pháp tạo phơi vơ tính Trong q trình ni cấy in vitro, phơi hình thành từ tế bào sôma gọi phôi vô tính Các phơi vơ tính tái sinh thành hồn chỉnh sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo Tương tự tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính cần thực q trình phản phân hóa tái sinh tế bào để tách tế bào sôma, hình thành 65 Bảng 3.8 Ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng đến khả tạo hồn chỉnh mây nếp Công NAA IBA Tỷ lệ tạo rễ Số rễ tb/chồi Tổng chiều dài Chất thức (mg/l) (mg/l) (%) (rễ) rễ/chồi (cm) lượng rễ R1 0,10 - 86,67 2,2 9,4 + R2 0,25 - 80,65 2,3 10,3 + R3 0,50 - 80,00 2,5 8,4 + R4 - 0,5 71,88 2,2 10,2 ++ R5 - 1,0 75,00 2,3 11,3 ++ R6 - 1,5 87,10 2,1 10,4 ++ R7 - 2,0 83,33 2,1 10,1 ++ R8 0,10 0,5 83,87 2,3 10,3 +++ R9 0,25 0,5 78,13 2,1 10,5 +++ R10 0,50 0,5 76,67 1,9 10,5 +++ R11 0,10 1,0 83,33 2,3 11,3 +++ R12 0,25 1,0 68,75 2,1 11,4 +++ R13 0,50 1,0 100,00 2,5 11,5 +++ R14 0,10 1,5 80,65 2,3 11,3 +++ R15 0,25 1,5 74,19 2,1 10,4 +++ R16 0,50 1,5 83,33 2,4 10,2 +++ R17 0,10 2,0 80,65 2,0 9,3 +++ R18 0,25 2,0 86,67 2,2 9,4 +++ R19 0,50 2,0 80,65 2,3 8,3 +++ R20 0,00 0,0 40,38 1,6 10,1 ++ Ghi chú: (+): Rễ nhiều cứng, tạo chùm rễ; (++): Rễ ngắn, màu trắng; (+++): Rễ dài, có nhiều rễ thứ cấp 66 Sử dụng hàm phân tích phương sai ANOVA hai nhân tố kiểm tra ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng IBA NAA đến khả tạo rễ mây nếp điều kiện nuôi cấy in vitro Kết thu Ftính = 3,49 > Ftra bảng = 3,26 (Phụ biểu 04); điều cho thấy IBA NAA có ảnh hưởng rõ rệt đến khả tạo rễ mây nếp điều kiện nuôi cấy in vitro Kết tổng hợp bảng 3.8 cho thấy: Trên công thức thí nghiệm tỷ lệ tạo rễ cao, 70% số chồi nuôi cấy tạo rễ Tỷ lệ tạo rễ cao công thức R13 (bổ sung 0,5mg/l NAA 1mg/l IBA) 100% Cao nhiều so với công thức đối chứng R17 đạt 80,65% Đây cơng thức có số rễ/chồi cao cơng thức thí nghiệm (trung bình 2,5 rễ/chồi) Kết cao báo cáo Zeng Bingshan (1998) tỷ lệ rễ số rễ/chồi số loài song mây D margaritae (92,1% chồi rễ 2,4 rễ/chồi); C.simplicifolius (65,7% chồi rễ 2,4 rễ/chồi) C.egregius (85,7% 1,4 rễ/chồi) [45] Với cơng thức thí nghiệm từ R1 – R3 (trong mơi trường ni cấy bổ sung chất điều hịa sinh trưởng NAA), kết tổng hợp bảng 3.4 cho thấy: Khi nồng độ NAA tăng dần từ 0,1 – 0,5 (mg/l) tỷ lệ số chồi rễ giảm dần từ 86,67% - 71,88% Tỷ lệ tạo rễ tốt (86,67%) công thức R1 (bổ sung 0,1 mg/l NAA) Kết nghiên cứu với chất điều hòa sinh trưởng IBA cho thấy, công thức môi trường tốt R6 có bổ sung mg/l IBA cho tỷ lệ tạo rễ 87,1% Khi nồng độ tăng lên 1,5 – (mg/l), tỷ lệ giảm xuống 83,33% 83,87% Khi giảm nồng độ IBA xuống 0,5 mg/l, có 75% số chồi tạo rễ Khi kết hợp IBA NAA nuôi cấy tạo hoàn chỉnh, nồng độ NAA thay đổi từ 0,5 – (mg/l) nồng độ IBA 0,5mg/l, tỷ lệ số chồi rễ cao đạt 83,33% NAA nồng độ 1,5 mg/l Tỷ lệ thấp công thức môi trường R1 (86,67%) bổ sung 0,5mg/l NAA Nhưng tăng nồng độ IBA lên 1mg/l, số chồi tạo rễ sau tuần nuôi cấy đạt cao 100% Tỷ lệ đạt cao cơng thức thí nghiệm Cùng nồng độ IBA mg/l, nồng độ NAA 1,5 mg/l; tỷ lệ chồi tạo rễ đạt thấp 74,19% 67 Hình 3.6 Cây Mây in vitro hoàn chỉnh 3.5 Ảnh hưởng giá thể chế độ che sáng đến tỷ lệ sống mây nếp in vitro vườn ươm Giai đoạn chuyển in vitro từ bình nuôi cấy ngồi vườn ươm giai đoạn có ý nghĩa quan trọng, định khả ứng dụng toàn q trình ni cấy in vitro vào thực tiễn sản xuất Đây giai đoạn gặp nhiều khó khăn in vitro nuôi cấy điều kiện ổn định dinh dưỡng, ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ… chuyển điều kiện tự nhiên bên hoàn toàn biến động dễ bị “sốc” điều kiện sống dẫn đến tỷ lệ chết cao, phải chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang giai đoạn tự dưỡng Quá trình đưa in vitro vườn ươm cần có thời gian để dần thích ứng với điều kiện mơi trường bên Trong tự nhiên, mây loài q trình sinh trưởng phát triển có giai đoạn cỏ, giai đoạn loài phải cạnh tranh với loài khác mạnh mẽ dễ bị tổn thương, chậm phát triển, đòi hỏi rễ cần khoẻ mạnh Trong nuôi cấy in vitro mây nếp, số rễ tạo trung bình từ – rễ/chồi, rễ cứng phát triển nhanh, có nhiều rễ phụ Trong cơng thức thí nghiệm, số rễ trung bình tạo nhau, khơng có khác biệt rõ rệt Chiều dài 68 rễ đủ tiêu chuẩn đưa vườn ươm theo số báo cáo mây in vitro 1,0 – 1,5 (cm) có tỷ lệ sống cao Tiêu chuẩn in vitro đưa vườn ươm: in vitro có nhiều tiêu chuẩn khác đưa vườn ươm Nếu chiều cao (H) ≥ cm tổng chiều dài rễ (R) ≥ cm, tỷ lệ sống cao Cây có rễ phụ có khả sống tốt khơng có rễ phụ Cây khơng có rễ có tỷ lệ sống tương đối cao D margaritae (40%), C.egregius (75%) C.simplicifolius (68,5%) Vì vậy, chiều cao tiêu chuẩn để đưa vườn ươm, chiều dài rễ có khơng rễ phụ tiêu chuẩn cuối đưa vườn ươm.Tiêu chuẩn đưa vườn ươm H ≥ 4cm, R ≥ cm Cây đưa vườn ươm có chiều cao ≥ 4cm bị nhiễm nấm nhẹ đưa trồng ngồi vườn ươm có tỷ lệ sống 60% Cây mây nếp in vitro hoàn chỉnh, đảm bảo tiêu chuẩn chiều cao ≥ cm có từ -3 rễ, trước đưa trồng vườn ươm, tiến hành huấn luyện điều kiện nhà lưới 10 – 15 ngày để thích ứng với ánh sáng tự nhiên sai khác nhiệt độ ngày đêm Trước cấy vườn ươm 2- ngày, tháo lỏng mở hẳn nắp bình để dần thích ứng với mơi trường có độ ẩm thấp Giá thể cho mơ nói chung để cải thiện độ ẩm tác động học cung cấp chất dinh dưỡng Để xác định ảnh hưởng thành phần giá thể ươm đến tỷ lệ sống in vitro vườn ươm, tiến hành thử nghiệm với công thức thí nghiệm từ U1 – U5 Che sáng yêu cầu quan trọng giai đoạn vườn ươm nói chung, đặc biệt tạo ni cấy in vitro nói riêng Mỗi loài yêu cầu chế độ che sáng, chịu bóng khác Mây lồi chịu bóng giai đoạn cỏ giai đoạn trưởng thành Do đó, đưa mây in vitro trồng vườn ươm, việc lựa chọn chế độ che sáng thích 69 hợp yếu tố thuận lợi để sống sót, sinh trưởng phát triển tốt.Thí nghiệm bố trí với chế độ che sáng khác (50%, 75% 100%) Sau tuần theo dõi kết thu trình bày bảng 4.9 Bảng 3.9 Ảnh hưởng giá thể chế độ che sáng tỷ lệ sống mây nếp in vitro vườn ươm Thành phần tỷ lệ phối trộn Số cấy (cây) Số sống (cây) Tỷ lệ sống (%) U1 40% trấu tồn tính trộn với 60% cát vàng 50 40 80 U2 60% trấu tồn tính trộn với 40% cát vàng 50 34 68 U3 100% cát vàng 50 35 70 50 45 90 50 38 76 Công thức 50% che sáng U4 U5 75% che sáng 100% che sáng 40% đất đồi + 60% cát vàng 60% đất đồi + 40% cát vàng U1 40% trấu tồn tính trộn với 60% cát vàng 50 41 82 U2 60% trấu tồn tính trộn với 40% cát vàng 50 35 70 U3 100% cát vàng 50 37 74 U4 40% đất đồi + 60% cát vàng 50 47 94 U5 60% đất đồi + 40% cát vàng 50 39 78 U1 40% trấu toàn tính trộn với 60% cát vàng 50 39 78 U2 60% trấu tồn tính trộn với 40% cát vàng 50 32 64 U3 100% cát vàng 50 33 66 U4 40% đất đồi + 60% cát vàng 50 44 88 U5 60% đất đồi + 40% cát vàng 50 37 74 70 Hình 3.7 Ảnh hưởng giá thể chế độ che sáng đến tỷ lệ sống mây nếp in vitro ngồi vườn ươm Phân tích phương sai hai nhân tố thu kết Ftính = 4,46 > Ftra bảng = 3,84 (Phụ biểu 05) điều cho thấy chế độ che sáng giá thể (thành phần tỷ lệ phối trộn) có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ sống mây nếp in vitro vườn ươm Kết bảng 3.9 hình 3.7 cho thấy: Cây mây nếp in vitro trồng ngồi vườn ươm có tỷ lệ sống cao (> 60%) Trong đó, cơng thức thí nghiệm tốt công thức U4 (40% đất đồi + 60% cát vàng) chế độ che sáng 75% cho tỷ lệ sống cao cơng thức thí nghiệm 94% Kết cao nhiều nghiên cứu công bố Zeng Bingshan trồng mây nếp in vitro 66,7% - 75,9% [45] Cây trồng giá thể có 40% đất đồi + 60% cát vàng cho tỷ lệ sống cao công thức thí nghiệm chế độ che sáng khác (chế độ che sáng 50% 90%; che sáng 75% 94% che sáng 100% 88%) Còn công thức U1, U2, U3 U5 tỷ lệ sống thấp 80%, 68%, 70% 76% chế độ che sáng 50%; 82%, 70%, 74% 78% chế độ che sáng 75%; 78%, 64%, 66% 74% chế độ che sáng 100% Ở cơng thức thí 71 nghiệm tỷ lệ cát chiếm đa số tỷ lệ mây mơ sống cao hơn, điều giải thích cát có kết cấu rời rạc, thống khí, nước tốt nấm bệnh nên rễ khơng bị bí chặt, bị nhiễm bệnh, sinh trưởng phát triển tốt Trên giá thể từ U1 – U5, chế độ che sáng 75% cho tỷ lệ sống cao (trên giá thể U1, U2, U3, U4 U5: tỷ lệ sống chế độ che sáng 75% 82%, 70%, 74%, 94% 78% cao so với che sáng 50% 80% , 68%, 70%, 90% 76%; tỷ lệ sống thấp chế độ che sáng 100% với 78%, 64%, 66%, 88% 74% giá thể từ U1 – U5) A B Hình 3.8 Cây mây in vitro sau tuần trồng vườn ươm A: 40% đất đồi+ 60% cát vàng chế độ che sáng 75%; B: 60% đất đồi+ 40% cát vàng chế độ che sáng 100% 72 3.6 Quy trình nhân giống in vitro mây nếp CÂY MẸ Phôi hạt (Khử trùng mẫu: NaOCl (60%) 10 phút) Chồi măng (Khử trùng mẫu: HgCl2 (0,1%) phút + phút) Cây mầm - (tháng) Tạo cụm chồi (MS* + mg/l BAP + 0,25 mg/l Kinetin) Cấy chuyển: lần/tháng × 40 lần Nhân nhanh chồi ( MS* + mg/l BAP + 0,25 mg/l Kinetin bổ sung 300 g/l Polyvinylpyrolidone mg/l Cysteine + 10 mg/l Vitamin C) tháng Kích thích tăng trưởng chồi (MS* + 1,0 mg/l BAP + 0,25 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l GA3) tháng Tạo hoàn chỉnh (MS* + 1,0 mg/l IBA + 0,5 mg/l NAA) tháng Trồng chăm sóc ngồi vườn ươm (40% đất đồi + 60% cát vàng + 75% che sáng) Hình 3.9 Sơ đồ quy trình nhân giống in vitro lồi Mây nếp 18 tháng 73 QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LOÀI MÂY NẾP Tạo mẫu in vitro - Tạo mẫu in vitro từ phôi hạt: Phôi hạt làm vỏ, khử trùng NaOCl 60% 10 phút, sau rửa cấy vào mơi trường MS khơng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng Sau tuần hạt nảy mầm thu mầm đủ tiêu chuẩn cấy chuyển sang môi trường tạo cụm chồi - Tạo mẫu in vitro từ chồi măng: Chồi măng khử trùng lần HgCl2 0,1 % ( lần 1: phút; lần 2: phút), sau rửa nước cất vơ trùng lần Cấy vào môi trường MS cải tiến + mg/l BAP + 0,5 mg/l IBA Tạo cụm chồi in vitro Sau – tháng cấy chuyển liên tục (1 tháng/lần), chồi cấy ban đầu có cảm ứng tạo cụm chồi Môi trường nuôi cấy tạo cụm chồi MS* + mg/l BAP + 0,25 mg/l Kinetin + 30 g/l sucrose + g/l agar Nhân nhanh chồi in vitro Các cụm chồi thu tiếp tục nuôi cấy môi trường tạo cụm chồi, cụm chồi có tượng tạo chồi có kích thước nhỏ li ti, chồi khơng rõ ràng, giảm hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng xuống cịn 60% - 80% Mơi trường ni cấy nên bổ sung chất chống oxy hóa Polyvinylpyrolidone (300mg/l) Cysteine (4mg/l) + Vitamin C (10mg/l) Các cụm chồi mây cấy chuyển 40 chu kỳ mà có hệ số nhân chồi cao Kích thích tăng trưởng chồi in vitro Sau số lần nhân nhanh, tùy theo mục đích sử dụng mà điều chỉnh số lần nhân nhanh Sau cấy chuyển cụm chồi tạo sang mơi trường kích thích tăng trưởng chồi 1,0 mg/l BAP + 0,25 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l GA3 74 Tạo rễ in vitro Sau tháng ni cấy mơi trường kích thích tăng trưởng chồi, chồi có chiều cao ≥ cm, rõ ràng cấy chuyển sang môi trường tạo rễ MS* bổ sung thêm 1,0 mg/l IBA + 0,5 mg/l NAA + 8,0 g/l agar + 20 g/l đường saccharose Sau tháng, rễ với tỷ lệ 100%, số rễ 2- rễ/chồi, chiều cao ≥ 10 cm, khỏe mạnh, rõ ràng đủ tiêu chuẩn đưa huấn luyện 10 – 15 ngày trước trồng vườn ươm Trồng chăm sóc Mây nếp in vitro ngồi vườn ươm - Cây đem cấy có chiều cao ≥ 10 cm, rõ ràng, qua huấn luyện 10 – 15 ngày, không cong queo sâu bệnh, không nấm bệnh - Cây cấy giá thể 40% đất đồi + 60% cát vàng chế độ che sáng 75% Do thời gian nghiên cứu luận văn nhiều hạn chế, chưa xác định đủ tiêu chuẩn xuất vườn, thơng thường lồi song mây, thời gian chăm sóc ngồi tối thiểu 18 tháng đủ tiêu chuẩn trồng rừng 75 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.KẾT LUẬN 1.1.Tạo mẫu in vitro từ hạt chồi măng mây nếp - Công thức khử trùng tốt hạt mây nếp sử dụng chất khử trùng NaOCl nồng độ 60% thời gian 10 phút, đạt tỷ lệ mẫu 78,79% - Công thức khử trùng tốt chồi măng mây nếp lấy từ thực địa là: khử trùng dung dịch loãng HgCl2 0,1% lần phút, rửa mẫu nước cất vô trùng - lần sau khử trùng tiếp HgCl2 0,1% lần phút, rửa mẫu nước cất vô trùng - lần cho tỷ lệ mẫu đạt 75,1% tỷ lệ mẫu nảy mầm đạt 61,9% 1.2 Tạo cụm chồi mây nếp điều kiện nuôi cấy in vitro - Môi trường ni cấy thích hợp để tạo cụm chồi MS* + mg/l BAP + 0,25 mg/l Kinetin + 30 g/l sucrose + g/l agar cho tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi đạt 74,5% 3,85 chồi/cụm - Vật liệu thích hợp cho việc nhân nhanh chồi cụm chồi (3chồi/cụm) - Để chống tượng cụm chồi bị nâu hóa, cần bổ sung vào mơi trường nhân nhanh chồi chất chống oxy hóa Polyvinylpyrolidone (300mg/l) Cysteine (4mg/l) + Vitamin C (10mg/l), cụm chồi sinh trưởng, phát triển tốt 1.3 Kích thích tăng trưởng chồi điều kiện nuôi cấy in vitro - Thành phần, nồng độ chất điều hịa sinh trưởng thích hợp cho việc kích thích tăng trưởng chồi mây nếp là: 1,0 mg/l BAP + 0,25 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l GA3 1.4.Tạo rễ mây nếp điều kiện nuôi cấy in vitro - Môi trường nuôi cấy tối ưu cho rễ chồi mây nếp tạo in vitro hoàn chỉnh là: MS* bổ sung thêm 1,0 mg/l IBA + 0,5 mg/l NAA + 8,0 76 g/l agar + 20 g/l đường saccharose, cho tỷ lệ chồi mây rễ tạo in vitro hoàn chỉnh đạt 100% sau tuần nuôi cấy 1.5 Ảnh hưởng giá thể chế độ chiếu sáng đến tỉ lệ sống mây nếp in vitro vườn ươm - Giá thể tốt 40% đất đồi + 60% cát vàng chế độ che sáng 75% cho tỷ lệ sống cao cơng thức thí nghiệm 94% KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu để xác định thêm số biện pháp kỹ thuật chăm sóc thời gian cần thiết ni dưỡng vườn ươm để mây nếp in vitro đạt tiêu chuẩn xuất vườn đem trồng rừng - Hồn thiện quy trình nhân giống mây nếp in vitro, nhân nhanh từ chồi măng để áp dụng vào sản xuất giống có chất lượng tốt phục vụ nhu cầu trồng rừng 77 MỤC LỤC Trang phụ bìa Trang Lời cảm ơn Mục lục Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Đại cương nuôi cấy mô – tế bào 1.1.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô – tế bào thực vật 1.1.1.1.Tính tồn (Totipotence) tế bào 1.1.1.2 Sự phân hóa phản phân hóa tế bào 1.1.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô – tế bào thực vật 1.1.2.1 Trên giới 1.1.2.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô – tế bào thực vật Việt Nam 1.1.3.Thành tựu nuôi cấy mô – tế bào thực vật 1.2 Nhân giống vơ tính in vitro 1.2.1 Khái niệm nhân giống vơ tính in vitro 1.2.2 Yêu cầu thực tiễn 1.2.3 Một số phương thức nhân giống vơ tính in vitro 1.2.3.1 Hoạt hóa chồi nách 1.2.3.2 Phương pháp tạo chồi bất định 1.2.3.3 Phương pháp tạo phôi vô tính 1.2.4 Các giai đoạn trình nhân giống in vitro 1.2.5 Các nhân tố ảnh hưởng tới trình nhân giống 11 1.2.5.1 Thành phần môi trường dinh dưỡng 11 1.2.5.2 Môi trường vật lý 19 78 1.2.5.3 Vật liệu nuôi cấy 20 1.2.5.4 Điều kiện vô trùng 20 1.3 Đại cương mây .21 1.3.1.Tổng quan mây 21 1.3.2 Tình hình nghiên cứu ni cấy mơ tế bào lồi song mây 23 1.3.2.1 Những nghiên cứu giới 23 1.3.2.2 Những nghiên cứu Việt Nam 26 1.3.3 Tổng quan mây nếp 27 1.3.3.1 Đặc điểm sinh thái, hình thái lồi mây nếp 27 1.3.3.2 Các nghiên cứu mây nếp giới 28 1.3.3.3 Những nghiên cứu mây nếp Việt Nam 29 Chương MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 33 2.2 Nội dung nghiên cứu 33 2.3 Vật liệu nghiên cứu 33 2.4 Địa điểm nghiên cứu 33 2.5 Thiết bị hóa chất 33 2.6 Phương pháp nghiên cứu 34 2.6.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 34 2.6.1.1 Phương pháp nghiên cứu tạo mẫu in vitro Mây nếp từ phôi hạt 34 2.6.1.2 Phương pháp nghiên cứu tạo mẫu in vitro Mây nếp từ chồi măng 35 2.6.1.3 Phương pháp nghiên cứu tạo cụm chồi mây nếp điều kiện nuôi cấy in vitro 36 2.6.1.5 Phương pháp nghiên cứu tạo rễ mây nếp điều kiện in vitro 40 2.6.1.6 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng giá thể chế độ chiếu sáng đến tỉ lệ sống mây nếp in vitro vườn ươm 42 2.6.2 Phương pháp thu thập, xử lý số liệu 43 2.6.2.1 Phương pháp thu thập số liệu 43 2.6.2.2 Phương pháp xử lý số liệu: 44 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .46 79 3.1 Tạo mẫu in vitro từ hạt chồi măng Mây nếp 46 3.1.1 Tạo mẫu in vitro từ phôi hạt mây nếp .46 3.1.2 Tạo mẫu in vitro từ chồi măng mây nếp 48 3.2 Tạo cụm chồi mây nếp nuôi cấy in vitro 51 3.2.1 Ảnh hưởng thành phần môi trường dinh dưỡng nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP đến khả tạo cụm chồi mây nếp 51 3.2.2 Ảnh hưởng phối hợp BAP Kinetin dến khả tạo cụm chồi Mây nếp in vitro 56 3.3 Kích thích tăng trưởng chồi Mây nếp điều kiện nuôi cấy in vitro 61 3.4 Tạo rễ mây nếp điều kiện nuôi cấy in vitro 64 3.5 Ảnh hưởng giá thể chế độ che sáng đến tỷ lệ sống mây nếp in vitro vườn ươm 67 3.6 Quy trình nhân giống in vitro mây nếp 72 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 1.KẾT LUẬN 75 1.1.Tạo mẫu in vitro từ hạt chồi măng mây nếp 75 1.2 Tạo cụm chồi mây nếp điều kiện nuôi cấy in vitro .75 1.3 Kích thích tăng trưởng chồi điều kiện nuôi cấy in vitro 75 1.4.Tạo rễ mây nếp điều kiện nuôi cấy in vitro 75 1.5 Ảnh hưởng giá thể chế độ chiếu sáng đến tỉ lệ sống mây nếp in vitro vườn ươm 76 KIẾN NGHỊ 76 ... tài: ? ?Nghiên cứu tạo mây nếp (Calamus tetradactylus Hance) phương pháp nuôi cấy in vitro" 2 Chương TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Đại cương nuôi cấy mô – tế bào 1.1.1 Cơ sở khoa học ni cấy mơ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN THỊ MAI DƯƠNG NGHIÊN CỨU TẠO CÂY CON MÂY NẾP (CALAMUS TETRADACTYLUS HANCE) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên... Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu in vitro từ hạt chồi măng mây nếp - Nghiên cứu kỹ thuật tạo cụm chồi mây nếp điều kiện nuôi cấy in vitro - Nghiên cứu kỹ thuật kích thích tăng trưởng chồi điều kiện ni cấy