Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của ba loài thuộc chi gynostemma blume ở việt nam tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM TUẤN ANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA BA LOÀI THUỘC CHI GYNOSTEMMA BLUME Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền Mã số: 62731001 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Hà Nội, năm 2019 Cơng trình hồn thành tại: - Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội - Viện Hóa học, Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Bộ môn Dược lý - Học viện Quân Y - Khoa Dược lý - Viện Dược liệu Người hướng dẫn khoa học: GS TS PHẠM THANH KỲ Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Trường Đại học Dược Hà Nội vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Chi Gynostemma Blume có khoảng 19 lồi phân bố từ vùng nhiệt đới châu Á tới Đông Á: từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia, New Guinea Loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino (Cổ yếm, Thất diệp đởm, Giảo cổ lam) sử dụng theo kinh nghiệm dân gian với tác dụng chữa ho, chữa viêm phế quản, chống viêm giải độc Thành phần dược liệu Giảo cổ lam saponin dammaran (gọi gypenosid) có nhiều tác dụng đáng ý hạ lipid, hạ đường huyết, điều tiết chức miễn dịch, gây độc tế bào Các saponin có cấu trúc đa dạng, khác vị trí nhóm gốc đường Tại Việt Nam, qua khảo sát ban đầu chi Gynostemma Blume đa dạng loài, lồi Về cảm quan định tính sơ thấy mẫu dược liệu có vị khác nhau, thành phần hóa học khơng giống Thực tế sản xuất dùng lẫn dược liệu với cơng dụng lồi G pentaphyllum (Thunb.) Makino, ảnh hưởng tới chất lượng độ an toàn sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ dược liệu Giảo cổ lam Nhằm tạo sở khoa học cho việc khai thác sử dụng có hiệu loài chi Gynostemma Blume Việt Nam, chúng tơi thực đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học ba loài thuộc chi Gynostemma Blume Việt Nam” Mục tiêu luận án - Giám định tên khoa học ba mẫu Giảo cổ lam nghiên cứu - Nghiên cứu thành phần hóa học ba lồi Giảo cổ lam - Đánh giá tác độc tính cấp số tác dụng sinh học (gây độc tế bào ung thư, ức chế NF-κB chống viêm) Những đóng góp luận án 3.1 Về thực vật Ba loài giám định tên khoa học Gynostemma pentaphyllum (Giảo cổ lam năm lá), Gynostemma longipes (Giảo cổ lam cuống dài) Gynostemma laxum (Cổ yếm bóng) mơ tả chi tiết đặc điểm thực vật, có ảnh chụp đầy đủ quan dinh dưỡng quan sinh sản 3.1 Về hóa học Từ lồi G pentaphyllum phân lập xác định cấu trúc hóa học saponin dammaran, có hợp chất biết 3β,20S,21trihydroxydammar-24-en 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-Dglucopyranosyl-(1→3)]-α-L-arabinopyranosyl-21-O-β-D-glucopyranosid (SAP2) hợp chất đặt tên gypenosid VN1-7 Từ loài G longipes phân lập xác định cấu trúc hóa học saponin dammaran, có hợp chất biết (23S)-3β,20ξ,21ξtrihydroxy-19-oxo-21,23-epoxydammar-24-en 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→2)][β-D-xylopyranosyl(1→3)]-α-L-arabinopyranosid hợp chất đặt tên gylongiposid II gylongiposid III Từ loài G laxum phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất quercetin (E5), ombuin (E1), rhamnetin-3-O-rutinosid (GL-8), 2,4-dihydroxybenzyl-O-α-L-rhamnopyranosid (GL-2), benzyl-O-β-Dglucopyranosid (GL-6), benzyl-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-Dglucopyranosid (GL-9), ethyl-β-rutinosid (GL-1), acid vanillic (GL-10) 3,4-dihydroxybenzoat ethyl (GL-7B) Trong 2,4-dihydroxy-benzyl-Oα-L-rhamnopyranosid hợp chất 3.3 Về độc tính tác dụng sinh học Lần cơng bố độc tính cấp cao chiết nước từ lồi G longipes G laxum Kết độc tính cấp G longipes có LD50 119,49 g dược liệu/kg ttc, G laxum chưa thấy độc dùng đến liều 150 g dược liệu/kg ttc đường uống Saponin tồn phần chiết từ G pentaphyllum có tác dụng ức chế dòng tế bào OVCAR8 mức độ yếu (112,09 µg/ml), Lu mức độ trung bình (87,62 µg/ml) MCF-7 mức độ trung bình (50,88 µg/ml) Bảy saponin phân lập từ G pentaphyllum gypenosid VN1-7 có tác dụng ức chế dòng tế bào MCF-7, HT-29, A549, SK-OV-3 mạnh gypenosid VN2 đạt IC50 = 19,6 µM dịng ung thư phổi A549 Các gypenosid VN1-7 ức chế yếu dòng tế bào HL-60 Phân đoạn GL3C chiết từ G longipes có tác dụng ức chế dịng tế bào OVCAR8 mức độ yếu (109,04 µg/ml), Lu MCF-7 mức độ trung bình (86,33 72,65 µg/ml) Các saponin tinh khiết phân lập từ G longipes có tác dụng ức chế dịng tế bào MCF-7, HT-29, A549, OVCAR-8 mạnh CGP7 đạt IC50 = 9,8 µM dịng tế bào ung thư buồng trứng OVCAR-8 Ba hợp chất phân lập từ G laxum thể tác dụng ức chế phụ thuộc vào liều NF-κB hoạt hóa TNF-α ethyl-β-rutinosid; 2,4dihydroxybenzyl-O-α-L-rhamnopyranosid rhamnetin-3-O-rutinosid với IC50 9,3 ± 0,3; 7,6 ± 0,4 9,2 ± 0,3 µM Hợp chất 2,4dihydroxybenzyl-O-α-L-rhamnopyranosid có tác dụng ức chế đáng kể ethyl-β-rutinosid; rhamnetin-3-O-rutinosid ức chế yếu gen biểu iNOS COX-2 TNF-α kích hoạt Ý nghĩa luận án Luận án đóng góp hiểu biết thành phần hóa học, độc tính cấp tác dụng sinh học loài thực vật thuộc chi Gynostemma Blume Việt Nam: G pentaphyllum, G longipes G laxum Kết nghiên cứu thành phần hóa học phát 10 chất lần phân lập từ tự nhiên Kết nghiên cứu độc tính cấp tác dụng sinh học góp phần giải thích kinh nghiệm sử dụng người dân địa phương sở khoa học mở triển vọng nghiên cứu đầy đủ để sử dụng rộng rãi dược liệu cộng đồng Bố cục luận án Luận án có 146 trang, gồm chương, 64 bảng, 78 hình Bố cục gồm: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan (50 trang); Nguyên vật liệu, trang thiết bị phương pháp nghiên cứu (14 trang); Kết nghiên cứu (66 trang); Bàn luận (12 trang) Kết luận kiến nghị (2 trang) Luận án có 183 tài liệu tham khảo phụ lục (90 trang) B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Chương TỔNG QUAN Tổng hợp phân tích vị trí phân loại chi Gynostemma Blume, họ Bí (Cucurbitaceae) Tập hợp trình bày cách hệ thống kết nghiên cứu tới thực vật, thành phần hóa học, tác dụng sinh học cơng dụng số loài chi Gynostemma Blume giới Việt Nam Chương NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu Mẫu Giảo cổ lam năm (G pentaphyllum) thu hái tỉnh Cao Bằng vào tháng năm 2005 thu hái Sapa, tỉnh Lào Cai vào tháng 3,4 tháng 7,8 năm 2010 Mẫu Giảo cổ lam cuống dài (G longipes) thu hái Sapa, tỉnh Lào Cai vào tháng 3,4 tháng 7,8 năm 2010 Mẫu Cổ yếm bóng (G laxum) thu hái huyện Đà Bắc, tỉnh Hịa Bình vào tháng 7,8 năm 2010 - Các hóa chất, thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định Dược điển Việt Nam Các dòng tế bào, thuốc thử sinh học chuột thí nghiệm đạt tiêu chuẩn nghiên cứu 2.2 Phương pháp giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu Thẩm định tên khoa học mẫu nghiên cứu dựa sở phân tích đặc điểm hình thái, thực vật, đối chiếu với khóa phân loại tiêu mẫu chuẩn lưu phòng tiêu 2.3 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học 2.3.1 Định tính nhóm chất hữu G longipes G laxum Định tính nhóm chất hữu phản ứng hóa học đặc hiệu 2.3.2 Chiết xuất, phân lập nhận dạng hợp chất dược liệu Chiết xuất chất dược liệu phương pháp chiết nóng hồi lưu với methanol, thu hồi dung mơi cao thô Phân lập chất phương pháp sắc ký cột nhiều lần Nhận dạng chất phân lập dựa vào độ chảy, phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ tử ngoại (UV-Vis), phổ khối (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1D-NMR) hai chiều (2D-NMR) kết hợp đối chiếu với tài liệu công bố Sơ đồ chiết xuất phân lập lồi theo hình 2.1, 2.2 2.3 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập chất từ G pentaphyllum 2.4 Đánh giá độc tính cấp số tác dụng sinh học 2.4.1 Độc tính cấp G longipes G laxum Đánh giá độc tính cấp theo hướng dẫn Đỗ Trung Đàm tính giá trị LD50 theo phương pháp Litchfied – Wilcoxon (1949) 2.4.2 Tác dụng gây độc tế bào G pentaphyllum G longipes Đánh giá tác dụng gây độc tế bào theo phương pháp MTT theo tác giả Mosmann (1983) 2.4.3 Tác dụng ức chế NF-κB chống viêm G laxum Đánh giá tác dụng ức chế NF-κB thực theo phương pháp đo hoạt độ luciferase Kim cs (2010) Chứng minh tác dụng chống viêm thể qua tác dụng ức chế phiên mã enzym iNOS COX-2 kỹ thuật PCR phiên mã ngược - Các số liệu thực nghiệm xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng cơng cụ R Hình 2.2 Sơ đồ phân lập chất từ G longipes Hình 2.3 Sơ đồ phân lập chất từ G laxum Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu Mô tả chi tiết đầy đủ phận quan dinh dưỡng (thân, lá), quan sinh sản (hoa, quả, hạt), đối chiếu với tiêu lưu khóa phân loại giám định mẫu nghiên cứu: - Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino (Giảo cổ lam năm lá) - Gynostemma longipes C Y Wu (Giảo cổ lam cuống dài) - Gynostemma laxum (Wall.) Cogn (Cổ yếm bóng) 3.2 Kết nghiên cứu thành phần hố học 3.2.1 Định tính nhóm chất hữu Hai mẫu G longipes G laxum có nhóm chất flavonoid, saponin, đường khử, acid hữu cơ, acid amin, sterol polysaccharid Đặc biệt, mẫu G longipes chứa nhiều saponin flavonoid ngược lại với mẫu G laxum 3.2.2 Nhận dạng chất phân lập từ Gynostemma pentaphyllum Từ cao thô saponin (SP) Giảo cổ lam năm (G pentaphyllum) phân lập chất, ký hiệu SAP1 – SAP8 Các hợp chất nhận dạng dựa vào liệu phổ MS, NMR hai chiều (bảng 3.1 3.2) Tám hợp chất từ loài G pentaphyllum saponin khung dammaran, SAP2 hợp chất biết, cịn lại hợp chất đặt tên gypenosid VN1-7 (hình 3.1, 3.2) Bao gồm: Hợp chất SAP2: 3β,20S,21-trihydroxydammar-24-en 3-O-α-L-rhamnopyr anosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-L-arabinopyranosyl-21-Oβ-D-glucopyranosid Chất rắn màu trắng; ESI-MS:m/z 1061,4 [M-H] (C50H90O21) Hợp chất SAP8 (gypenosid VN1): 3β,20S,21-trihydroxydammar-24-en-3O-α-L-rham-nopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-L-arabinopyran-osyl-21-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid Chất rắn màu trắng; FTICR-MS:m/z 1247,63991 [M+Na]+ - C59H100O26 Hợp chất SAP4 (gypenosid VN2): 3β,20S,21-trihydroxydammar-24-en-12on 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-Larabino-pyranosyl-21-O-β-D-glucopyranosid 5'''' HO 4'''' HO 1'''' OH 3''' 2''' OH 1''' 6'' H3C HO 4'' HO4''' HO 5'''' O HO 3''' 1''' 2''' 3' OH 4'' HO 5'''' O 3'''' 1'''' 2''''OH O Gypenosid VN3 (SAP7) 17 O O 4' 6''' HO 5''' HO4''' 28 HO 3''' 20 HO 1''' O 2''' OH H3C HO OH 4'' 30 1' O 2' O 3' 29 28 1'' O 5'' 6'' 17 O 5' O 24 HO 18 2'' 3'' 6'''' 4'''' HO 1'' O 5'' 6'' H3C HO OH 24 HO 18 29 2'' HO HO 30 1' 2' O 28 29 1'' O 20 O 5' O O HO 1'''' OH HO 4' O O 3'' 4'' 1' O 2'''' 3'''' O 17 6'''' 4'''' Gypenosid VN2 (SAP4) 5''' 2' 3' 5'' OH HO 6''' 1''' 2''' OH 2'' 3'' HO HO O 3''' 24 30 O 5' 4' O 5''' H3C HO HO HO4''' 6''' 6'' HO O HO HO 28 29 1'' O 1'''' OH 18 HO 2' O 3' 5'' O 2'''' 3'''' 20 30 O 5'''' 17 O 1' 6'''' O HO 4'''' HO SAP8 (gypenosid VN1) O 5' 4' O 5''' HO HO HO 6''' HO 1''''' 2'''''OH 3''''' 24 18 HO4''' HO O 20 SAP2 5''''' O HO 4''''' O 2'''' 3'''' 6''''' HO 6'''' HO 2'' 3'' HO OH OH HO HO 5'''' O 4'''' HO 25 6'''' 3'''' 1''''O 2'''' OH O Gypenosid VN4 (SAP1) 20 HO4''' HO O 5''' 3''' 2''' 1''' O H3C HO 4'' HO 28 3''' 2''' 1''' O H3C HO 2'' 3'' OH O 28 29 1'' O 5'' 4'' 30 1' 2' O 3' OH 6'' HO O 5' 4' O 5''' HO4''' 29 1'' O 5'' H 17 HO 6''' HO O 2' O 3' OH 6'' 1' 21 20 HO 18 30 O 5' 4' OH HO 6''' OH 17 18 HO Gypenosid VN5 (SAP5) 24 HO 24 HO 2'' 3'' HO OH OH 25 Gypenosid VN6 (SAP3) 24 21 20 HO O OH Gypenosid VN7 (SAP6) HO 25 HO H 18 HO H HO4''' HO 5''' 3''' HO 6''' 2''' OH 5' 4' O 1''' O H3C HO 4'' 3'' HO 1'' O 5'' 6'' 1' 2' O 3' HO O HO4''' 29 HO 30 O O 20 HO 17 17 18 21 28 HO 6''' O 5''' 3''' 2''' 1''' O H3C HO 2'' 4'' 3'' HO 30 1' 1'' O 5'' O 29 2'' OH Hình 3.1 Các chất phân lập từ G pentaphyllum O 2' O 3' OH 6'' OH 5' 4' 28 24 17,21 16,76 17,27 16,87 104,70 75,19 82,32 68,54 64,79 17,23 (3-xyl) 105,77 77,71 87,21 70,11 65,82 104,68 75,00 82,22 68,52 64,71 102,83 72,91 81,56 66,68 64,00 105,17 75,32 82,23 68,55 64,90 105,09 75,01 82,10 68,46 64,61 101,96 72,13 72,13 73,85 70,27 17,99 101,86 72,04 71,97 73,72 70,16 18,03 101,86 72,12 72,04 73,78 70,26 18,05 101,93 72,08 72,07 73,80 70,23 18,01 100,31 70,32 70,28 71,95 68,40 17,80 102,01 72,15 72,15 73,87 70,30 18,01 101,94 72,09 72,09 73,82 70,24 18,02 104,99 75,01 77,93 71,17 77,98 62,40 104,26 75,28 77,93 71,22 77,97 62,40 104,26 74,91 77,80 71,07 77,80 62,33 103,93 75,27 77,96 71,63 77,96 62,65 104,29 75,25 77,89 71,17 77,89 62,39 103,65 73,42 76,71 69,86 76,81 60,94 104,35 75,08 78,08 71,24 78,03 62,44 104,26 75,26 77,93 71,18 77,98 62,40 105,09 75,30 77,98 71,77 77,98 62,89 6’’’’-glc 105,17 75,19 77,97 71,72 78,03 70,04 105,16 75,19 77,86 71,59 77,86 62,78 104,84 75,27 78,24 71,73 78,15 62,87 105,13 75,25 77,97 71,59 77,97 62,67 30 16,87 16,85 17,28 104,26 75,27 82,12 68,47 64,61 105,06 75,05 82,00 68,42 64,55 101,94 72,09 72,09 73,81 70,24 18,02 3-ara 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 2’-rha 1’’ 2’’ 3’’ 4’’ 5’’ 6’’ 3’-glc 1’’’ 2’’’ 3’’’ 4’’’ 5’’’ 6’’’ 21-glc 1’’’’ 2’’’’ 3’’’’ 4’’’’ 5’’’’ 6’’’’ 104,76 75,19 77,87 71,60 77,93 62,75 Các tín hiệu đo CD3OD 125 MHz 1’’’’’ 2’’’’’ 3’’’’’ 4’’’’’ 5’’’’’ 6’’’’’ 11 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H-NMR chất phân lập từ G pentaphyllum (Đo CD3OD, 500 MHz) C SAP2 Gyp VN1 Aglycon 1,02m/1,73m 1,01m/1,72m 1,74m/1,81m 1,73m/1,83m 3,16dd(11,0/4,5) 3,18dd(12,0/4,5) 0,80d (12,5) 0,79brd(11,5) 1,50m/1,56m 1,50m/1,55m 1,32m/1,58m 1,30m/1,60m 1,39 m 1,39 m 10 11 1,30m/1,54m 1,30m/1,55m 12 1,65m/1,75m 1,60m/1,76m 13 1,83 m 1,84 m 14 15 1,09m/1,54m 1,05m/1,53m 16 1,27m/1,87m 1,24m/1,87m 17 1,92 m 1,75 m 18 1,02 s 1,02 s 19 0,91 s 0,91 s 20 21 3,50/ 3,92 3,61; 3,83 22 1,53/ 1,65 m 1,50m/1,61m 23 2,00m/2,07m 2,00m/2,06m 24 5,12dt(8,0/1,5) 5,12 t (8,0) 25 26 1,69 s 1,69 s 27 1,64 s 1,65 s 28 1,03 s 1,03 s 29 0,87 s 0,87 s 30 0,92 s 0,92 s Gyp VN2 1,00m/1,58m 1,70m/1,83m 3,14* 0,81brd(11,5) 1,57m/1,63m 1,40m/1,57m 1,70* 2,15*; 2,38* 3,16* 1,18m/1,79m 1,80 m 2,42 m 1,24 s 0,98 s 3,15*; 3,90 1,41m/1,69m 1,95m/2,02m 5,09 t (8,0) 1,66 s 1,62 s 1,03 s 0,88 s 0,75 s Gyp VN3 1,02m/1,59m 1,75m/1,85m 3,17* 0,81brd(11,5) 1,60m/1,67m 1,42m/1,60m 1,75* 2,18*; 2,41* 3,18* 1,21m/1,81m 1,81 m 2,47 m 1,26 s 1,01 s 3,16*; 3,95 1,45m/1,72m 1,98m/2,05m 5,12 t (8,0) 1,69 s 1,65 s 1,06 s 0,91 s 0,78 s 12 Gyp VN4 1,00m/1,61m 1,75m/1,85m 3,17* 0,85brd(11,5) 1,60m/1,65m 1,45m/1,60m 1,75* 2,17*; 2,38* 3,19* 1,24m/1,83m 1,83 m 2,40 m 1,27 s 1,00 s 3,15*; 3,88* 2,15m/2,51m 5,67 m 5,68 d (16,0) 1,30 s 1,29 s 1,05 s 0,90 s 0,76 s Gyp VN5 Gyp VN6 Gyp VN7 1,60m/0,97m 1,02m/1,60m 1,02m/1,74m 1,50m/1,74m 1,77m/1,85m 1,75m/1,83m 3,04* 3,17dd(12,0/4,5) 3,17dd(12,0/4,5) 0,74brd(11,5) 0,85brd(11,5) 0,80brd(11,5) 1,39m/1,46m 1,60m/1,67m 1,50m/1,55m 1,21m/1,56m 1,43m/1,60m 1,32m/1,61m 1,43 m 1,77* 1,38 m 0,97m/1,08m 2,20*; 2,38* 1,31m/1,55m 3,40 m 1,60m/1,77m 1, 38 m 3,01 d (10,5) 1,93 m 1,43m/1,70m 1,22m/1,80m 1,08m/1,60m 1,15m/1,76m 1,57m/1,87m 1,30m/1,75m 2,02 m 2,46 m 2,11 m 0,90 s 1,25 s 1,02 s 0,82 s 1,00 s 0,91 s 3,58 t (8,0) 3,71* 5,12 s 1,24m/1,42m 1,60 m 1,61m/2,29m 1,39m/1,64m 1,42m/1,81m 3,42 m 1,80 m 2,00 m 5,70 d (8,5) 1,07 s 1,23 s 3,95 s 1,11 s 1,21 s 1,70 s 0,93 s 1,05 s 1,03 s 0,76 s 0,91 s 0,87 s 0,83 s 0,80 s 0,93 s 3-ara 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 2’-rha 1’’ 2’’ 3’’ 4’’ 5’’ 6’’ 3’-glc 1’’’ 2’’’ 3’’’ 4’’’ 5’’’ 6’’’ 21-glc 1’’’’ 2’’’’ 3’’’’ 4’’’’ 5’’’’ 6’’’’ 6’’’’-glc 1’’’ 2’’’ 3’’’ 4’’’ 5’’’ 6’’’ 4,52 d (5,5) 3,33 m 3,88 m 4,04 m 3,52m/ 3,91m 4,52 d (5,5) 3,25* 3,90* 4,04* 4,49 d (5,5) 3,86* 3,85* 4,04 m 3,52 dd (12,0/ 2,5); 3,91* 3,51 dd (12,0/ 2,5), 3,92* (3-xyl) 4,47 d (6,5) 3,62* 3,69* 3,70 m 3,28*; 3,96* 3,53 dd (12,0/ 2,5) 4,51 d (5,5) 3,91* 3,89* 4,05 m 4,34 d (5,5) 3,86* 3,85* 4,04 m 4,51 d (5,5) 3,92* 3,89* 4,04 m 4,52 d (5,5) 3,91* 3,89* 4,04 m 3,51 dd (12,0/ 2,5), 3,92 3,52 dd (12,0/ 2,5), 3,90*3,53 dd (12,0/ 2,5), 3,91* 5,23 br s 3,74 m 3,94 m 3,42 m 3,88 m 1,24 d (6,5) 5,22 br s 3,95* 3,75* 3,41* 3,88* 1,24 d (6,5) 5,22 br s 3,91* 3,72* 3,40* 3,89* 1,22 d (6,5) 5,40 br s 3,99* 3,74* 3,42* 3,96* 1,24 d (6,5) 5,23 br s 3,94* 3,75* 3,42* 3,89* 1,24 d (6,5) 5,22 br s 3,91* 3,72* 3,40* 3,89* 1,22 d (6,5) 5,23 d (1,5) 3,95* 3,74* 3,41* 3,87* 1,23 d (6,5) 5,23 br s 3,95* 3,74* 3,42* 3,89* 1,24 d (6,5) 4,51 d (7,5) 3,90 m 3,32 m 3,36 m 3,41 m 3,70 m/ 3,87m 4,51 d (7,5) 3,31* 3,42* 3,36* 3,32* 3,70*; 3,86* 4,50 d (7,5) 3,33* 3,41* 3,36* 3,35* 3,70*; 3,85* 4,53 d (7,5) 3,31* 3,38* 3,35* 3,33* 3,68*; 3,90* 4,52 d (7,5) 3,32* 3,40* 3,37* 3,35* 3,71*, 3,87* 4,50 d (7,5) 3,33* 3,41* 3,36* 3,35* 3,70*; 3,85* 4,52 d (7,5) 3,34* 3,40* 3,37* 3,34* 3,71*, 3,84* 4,51 d (7,5) 3,33* 3,41* 3,36* 3,32* 3,70*; 3,87* 4,30 d (7,5) 3,26 m 3,41 m 3,31 m 3,33 m 3,68m/3,89m 4,29 d (7,5) 3,25* 3,43* 3,35* 3,33* 4,21 d (7,5) 3,21* 3,40* 3,32* 3,31* 3,70*; 3,85* 4,22 d (7,5) 3,22* 3,38* 3,32* 3,30* 3,68*; 3,90* 4,23 d (7,5) 3,24* 3,39* 3,33* 3,29* 3,71*; 3,87* 3,77*/4,19 dd (11,5; 2,0) 4,38 d (7,5) 3,25* 3,45* 3,37* 3,35* 3,70*/3,86* 13 3.2.3 Nhận dạng chất phân lập từ Gynostemma longipes Từ phân đoạn nước (GL3) G longipes phân lập chất, ký hiệu CGP1, CGP5 CGP7 Các chất nhận dạng dựa vào liệu phổ MS, NMR (bảng 3.3) Trong đó, CGP7 chất biết Hai chất lại chất mới, đặt tên gylongiposid II III (hình 3.3) HO O 21 24 25 HO H 18 HO H 17 CGP1 HO HO HO 4'' HO O 5' 4' HO 6'' 3' O 1'' 2'' O HO 28 29 5'' O HO O O OH 30 1' 2' O HO 20 O HO HO OH 3'' O OH HO 27 HO 25 24 26 O O O O CGP5 22 21 20 18 OH 17 OH 4' 5' O HO 3' 1' O HO 6'' 2' O O 5'' 4'' HO 1'' HO 2'' OH 3'' O HO O HO HO 28 29 O HO 30 O OH 25 HO 21 24 20 HO CGP7 O H 18 17 CHO HO HO4''' HO 3''' 2''' 5' 4' O 5''' 1''' O H3C HO 4'' 3'' HO O 29 1'' O 5'' 6'' 1' 2' O 3' OH 30 O 28 2'' OH Hình 3.3 Cấu trúc tương tác HMBC, COSY CGP1,5 Hợp chất CGP1 (gylongiposid II): 3β,20β,21β-trihydroxy-21,23α-epoxy dammar-24-en 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosid Chất rắn, màu trắng; HR-ESI-MS: m/z 791,45529 m/z [M+Na]+C41H68O13 14 Hợp chất CGP5 (gylongiposid III): 3β,25-dihydroxy-20,24;21,24-diepoxy dammar 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosid Chất rắn, màu trắng; HR-ESI-MS: m/z 769,47389 [M+H]+ - C41H68O13 Hợp chất CGP7 (23S)-3β,20ξ,21ξ-trihydroxy-19-oxo-21,23-epoxydam mar-24-en 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→2)][β-D-xylopyranosyl(1→3)]α-L-arabinopyranosid Chất rắn, màu trắng; HR-ESI-MS: m/921,4842 m/z [M+Na]+ C46H74O17 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR chất phân lập từ G longipes Vị trí 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Gylongiposid II δCa δHb 40,37 1,01 m;1,74 m 27,20 1,77 m;1,87 m 91,13 3,17 (brd, 11,0) 40,56 57,45 0,81 (brd, 11,0) 19,28 1,50 m;1,58 m 36,58 1,22 m;1,61 m 41,64 52,09 1,38 m 38,02 22,50 1,32 m;1,65 m 25,22 1,62 m;1,88 m 41,97 1,92 m 50,90 32,17 1,10 m;1,60 m 27,62 1,29 m;1,74 m 45,50 2,10 m 16,17 1,03 (s) 16,76 0,92 (s) 85,58 102,68 5,10 (s) 22 44,36 23 74,24 24 25 128,92 134,89 1,58 m; 2,26 m 4,94 (dd, 8,5; 16,0) 5,45 (brd, 8,5) - Gylongiposid III CGP7 δCa δHb δCa 40,34 27,21 91,12 40,59 57,54 19,25 36,51 41,60 52,14 38,07 22,47 25,60 43,91 50,99 32,14 27,55 45,14 15,98 16,79 91,03 74,25 32,60 1,01 m; 1,72 m 1,77 m; 1,88 m 3,17(brd, 11,0) 0,82(br d,12,0) 1,52 m; 1,58 m 1,32 m; 1,62 m 1,40 m 1,30 m; 1,58 m 1,58 m; 1,83 m 2,15 m 1,15 m; 1,64 m 1,30 m; 1,88 m 1,62 m 1,01 (s) 0,92 (s) 3,41 (d; 6,5); 3,72 (d; 6,5) 1,92 m; 2,04 m 32,75 113,62 71,50 δHb 34,39 2,52 m; 0,87 m 27,85 1,35 m; 1,84 m 88,32 3,19dd(12,0/4,5) 41,31 55,97 1,30 m 17,75 1,80 m; 2,03 m 35,54 1,48 m; 1,78 m 40,81 53,87 1,75 m 53,76 22,85 1,02 m; 1,69 m 25,17 1,62 m; 1,82 m 41,74 1,88 m 50,70 32,59 1,18 m; 1,60 m 27,42 1,30 m; 1,75 m 45,36 2,10 m 16,26 0,82 s 207,91 10,19 s 85,41 102,56 5,07 s 44,32 2,60 m; 2,64 m 1,33 m; 1,63 m 73,66 4,94 m - 128,34 128,87 5,43 d (8,5) - 15 26 27 28 29 30 25,87 17,99 28,48 16,17 16,82 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 105,29 78,99 73,60 68,87 65,22 1’’ 2’’ 3’’ 4’’ 5’’ 6’’ 104,66 73,88 77,86 71,67 78,07 62,87 1,73 (s) 1,69 (s) 1,07 (s) 0,87 (s) 0,92 (s) 25,39 25,39 28,45 16,72 16,34 4,52 (d; 6,0) 3,91 * 3,81 * 3,86 m 3,55 (d; 10,0); 3,88 105,30 79,04 73,65 68,87 65,17 4,61 (d; 7,5) 3,24 (t; 7,5) 3,40 * 3,29 * 3,30 * 3,67 (brd;11,0) 3,84dd;5,0;11,0 104,76 75,93 77,96 71,35 78,16 62,91 3-ara 1,29 (s) 1,30 (s) 1,07 (s) 0,87 (s) 0,94 (s) 3-ara 2’-glc 25,88 18,03 26,90 16,78 17,61 1,74 s 1,68 s 0,91 s 0,95 s 1,10 s 3-ara 4,53 (d; 6,0) 3,90* 3,79* 3,87* 3,53 (dd; 4,0; 13,5); 3,88 2’-glc 104,99 75,18 82,03 68,86 64,97 5,07 d (5,5) 3,87* 3,85* 3,96* 3,52*; 3,88* 2’-rha 4,61 (d; 8) 3,23 (t; 8) 3,40* 3,28* 3,28* 3,66 (brd;12,0) 3,84dd;5,0;12,0 101,92 73,24 72,02 74,21 70,18 18,40 5,21 br, s 3,45* 3,74* 3,40* 3,92* 1,23 d (6,5) 3’-xyl 1’’’ 2’’’ 3’’’ 4’’’ 5’’’ 105,14 74,50 77,40 71,94 66,72 4,47 d (7,5) 3,35* 3,38* 3,92* 3,28*; 3,93* Đo CD3OD: a 125 MHz; b 500 MHz; *: tín hiệu chồng, xác định HMBC, HSQC, COSY 3.2.4 Nhận dạng chất phân lập từ Gynostemma laxum Từ phân đoạn EtOAc (GL2) Cổ yếm bóng (G laxum) phân lập chất, ký hiệu E5, E1, GL-7B, GL-6 GL-8 Từ phân đoạn nước (GL3) Cổ yếm bóng (G laxum) phân lập chất, ký hiệu GL-9, GL-1, GL-10 GL-2 Các hợp chất nhận dạng dựa vào liệu phổ MS, NMR Trong chất phân lập có flavonoid (E5, E1, GL-8), glycosid (GL-2, GL-6, GL-9, GL-1), acid hữu (GL-10) ester (GL-7B) (hình 3.4) Hợp chất GL-2 (2,4-dihydroxybenzyl-O-αL-rhamnopyranosid) chất 16 Hợp chất GL-2 (2,4-dihydroxybenzyl-O-α-L-rhamnopyranosid) Chất rắn vơ định hình, màu trắng; ESI-MS: m/z 287 [M+H]+; HR ESI-MS: m/z 287,1147 [M+H]+ - C13H19O7 Số liệu NMR xem bảng 3.4 Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR chất GL-2 HMBC (HC) C Ca,b Ha,c mult J (Hz) 126,30 148,08 137,73 154,04 126,91 126,37 70,81 7,92 (s) 7,20 (d, 8,0) 7,25 (d, 8,0) 4,42 (d, 12,5); 4,50 (d, 12,5) 2, 6, 1’ 7-rha 1’ 101,59 4,72 (br s) 2’ 71,66 3,78 (d, 3,0) 3’ 71,79 3,56 (dd, 3,0; 9,5) 4’ 73,53 2,24 (t, 9,5) 5’ 70,32 3,43 (m) 6’ 18,17 1,03 (d, 6,0) a: DMSO-d ; b: 125 MHz; c: 500 MHz 5’, 6’ 1’, 6’ 4’, 5’ Hợp chất GL-10 (acid vanillic) Chất rắn vơ định hình, màu trắng ESI-MS: m/z 169 [M+H]+ - C8H8O4 H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 3,86 (3H, s, 3-OCH3); 6,81 (H, d, J = 8,0 Hz, H-5); 7,52 (H, d, J = 2,0 Hz, H-2); 7,53 (H, dd, J = 2,0; 8,0 Hz, H-6) 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 56,44 (OCH3); 113,87 (C-5); 115,88 (C-2); 123,14 (C-6); 125,41 (C-1); 148,77 (C-4); 152,79 (C-3); 170,18 (C=O) Hợp chất GL-7B (ethyl 3,4-dihydroxybenzoat) Chất rắn vô định hình, màu trắng H-NMR (CD3OD, 400 MHz)  (ppm): 1,27 (3H, t, J = 7,0, CH3); 4,20 (2H, q, J = 7,0, CH2O); 6,73 (1H, d, J = 7,8 Hz, H-5); 7,30 m (1H, H-6); 7,35 m (1H, H2) 13 C-NMR (CD3OD, 100 MHz)  (ppm): 14,59 (CH3); 61,67 (CH2O); 115,9 (C5); 117,47 (C-2); 122,95 (C-1); 123,65 (C-6); 146,26 (C-3); 151,76 (C-4); 168,55 (C=O) Hợp chất GL-6 (benzyl-O-β-D-glucopyranosid) Chất rắn vơ định hình, màu trắng H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 3,69 (1H, dd, J=5,6; 12,0 Hz; H-6’); 3,89 (1H, dd, J=2,0; 12,0 Hz; H-6’); 4,34 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1’); 4,65 (1H, d, J=12,0 Hz, H-7); 4,93 (1H, d, J=12,0 Hz, H-7); 7,25 – 7,42 (1H, m, H2~6) 17 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 62,81 (C-6’); 71,69 (C-4’); 71,74 (C7); 75,15 (C-2’); 78,03 (C-3’); 78,10 (C-5’); 103,32 (C-1’); 128,78 (C-4); 129,28 (C-2); 129,28 (C-6); 129,36 (C-3); 129,36 (C-5); 139,16 (C-1) Hợp chất GL-9 (benzyl-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid) Chất rắn vơ định hình, khơng màu H-NMR (CD3OD, 400 MHz)  (ppm): 4,40 (1H, d, J=7,8 Hz, H-1’’); 4,51 (1H, d, J=13,0 Hz, H-7); 4,67 (1H, d, J=13,0 Hz, H-7) 13 C-NMR (CD3OD, 100 MHz)  (ppm): 66,96 (C-5’’); 69,86(C-6’); 71,22 (C4’’); 71,60 (C-4’); 71,95 (C-7); 74,95 (C-2’’); 75,12 (C-2’); 77,14 (C-3’); 77,79 (C-5’); 78,01 (C-3’’); 103,43 (C-1’); 105,69 (C-1’’); 128,79 (C-4); 129,35 (C-2); 129,35 (C-6); 129,37 (C-3); 129,37 (C-5); 139,19 (C-1) Hợp chất E5 (quercetin) Tinh thể hình kim, màu vàng UV: λmax/MeOH 257; 371nm; IR λmax 3406; 1663; 1612 cm-1 ESI – MS: m/z 301 [M-H]- - C15H10O7 H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 6,18 (1H, d, J=2,0 Hz, H-6); 6,40 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8); 6,88 (1H, d, J=8,5 Hz, H-5’); 7,53 (1H, dd, J=8,5/ 2,0 Hz, H6’); 7,67 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2’) 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 93,30 (C-8); 98,13 (C-6); 102,97 (C10); 115,03 (C-2’); 115,56 (C-5’); 119,93 (C-6’); 121,92 (C-1’); 135,67 (C-3); 145,01 (C-3’); 146,77 (C-2); 147,65 (C-4’); 156,10 (C-9); 160,68 (C-5); 163,83 (C-7); 175,79 (C-4) Hợp chất E1 (ombuin) Bột màu vàng UV: λmax/MeOH 260; 375nm; IR λmax 3452; 3278; 1658; 1619; 1588 cm-1 ESI – MS: m/z 331 [M-H]+ - C17H14O7 H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 6,35 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8); 6,72 (1H, d, J=2,0 Hz, H-6); 7,09 (1H, d, J=8,5 Hz, H-5’); 7,68 (1H, dd, J=8,5/ 2,0 Hz, H6’); 7,72 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2’); 9,32 (1H, s, 3-OH); 9,57 (1H, s, 3’-OH); 12,44 (1H, s, 5-OH) 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 55,61 (7-OCH3); 56,00 (4’-OCH3); 91,92 (C-8); 97,47 (C-6); 104,02 (C-10); 111,76 (C-5’); 114,73 (C-2’); 119,78 (C6’); 123,30 (C-1’); 136,40 (C-3); 146,18 (C-3’); 146,75 (C-2); 149,44 (C-4’); 156,11 (C-5); 160,35 (C-9); 164,96 (C-7); 176,05 (C-4) Hợp chất GL-8 (rhamnetin-3-O-rutinosid) Bột màu vàng ESI – MS: m/z 625 [M-H]+ - C21H20O10 H-NMR (CD3OD, 400 MHz)  (ppm): 1,11 (3H, d, J=6,4 Hz, H-6’’’); 3,83 (3H, s, 7-CH3O); 4,51 (1H, d, J=1,6 Hz, H-1’’’); 5,13 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1’’); 6,35 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8); 6,72 (1H, d, J=2,0 Hz, H-6); 7,09 (1H, d, J=8,5 Hz, H-5’); 7,68 (1H, dd, J=8,5/ 2,0 Hz, H-6’); 7,72 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2’) 18 13 C-NMR (CD3OD, 100 MHz)  (ppm): 17,85 (C-6’’’); 56,48 (7-CH3O); 68,62 (C-6’’); 69,71 (C-5’’’); 71,44 (C-4’’’); 72,08 (C-2’’’); 72,25 (C-3’’’); 73,97 (C4’’); 75,77 (C-4’’); 77,21 (C-3’’); 78,19 (C-5’’); 93,26 (C-8); 99,16 (C-6); 102,5 (C-1’’’); 104,68 (C-1’’); 106,47 (C-10); 116,11 (C-2’); 117,88 (C-5’); 123,07 (C6’); 123,73 (C-1’); 135,92 (C-3); 145,93 (C-3’); 150,02 (C-4’); 158,4 (C-2); 159,64 (C-9); 162,69 (C-5); 167,4 (C-7); 179,55 (C-4) Hợp chất GL-1 (ethyl-β-rutinosid) Bột màu vàng ESI – MS: m/z 354 [M-H]+ - C14H26O10 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 Mhz): 15,77 (C-2); 18,31 (C-6’’); 66,05 (C-1); 68,30 (C-6’); 69,79 (C-5’’); 71,75 (C-4’); 72,16 (C-2’’); 72,33 (C-3’’); 73,91 (C4’’); 75,03 (C-2’); 76,90 (C-5’); 78,11 (C-3’); 102,34 (C-1’’); 104,20 (C-1’) OH OH 4' HO O E5 4' HO 1' O OH 10 E1 O OH OH 1' OH 10 OH OH O OH HO HO HO GL-6 O 4' O H3CO OH GL-2 HO HO O O OH CH3 HO HO GL-8 OH O 1' O O O HO HO O OH HO H2C O O HO HO O CH3 HO HO OH GL-1 GL-9 O O HO HO H3CO O CH3 O OH HO O O GL-10 O 10 OH OH HO O CH HO HO OH O OH CH2 CH3 HO HO GL-7B Hình 3.4 Các chất phân lập từ G laxum OH 3.3 Kết nghiên cứu độc tính cấp Đánh giá độc tính cấp G longipes Chuột bắt đầu chết liều 80 g/kg ttc đến 200 g/kg ttc số chuột chết 100% (bảng 3.5) LD50 119,49 g dược liệu/kg ttc theo đường uống 19 Đánh giá độc tính cấp G laxum Khơng có cá thể chuột chết đến liều 150 g/kg ttc Khơng tính liều LD50 dược liệu Cổ yếm bóng theo đường uống Bảng 3.5 Độc tính cấp cao đặc G longipes (GCL cuống dài) STT Liều (g/kg Số chết/ sống STT Liều (g/kg Số chết/ sống ttc/24h) (sau tuần) ttc/24h) (sau tuần) 70 0/10 140 06/4 80 01/9 150 07/3 90 02/8 10 160 08/2 100 04/6 11 170 08/2 110 05/5 12 180 09/1 120 05/5 13 190 09/1 130 06/4 14 200 10/0 3.4 Nghiên cứu độc tính tế bào số dòng tế bào ung thư 3.4.1 Khảo sát độc tính tế bào phân đoạn Các mẫu thử là: (1) phân đoạn SP chứa hỗn hợp saponin thơ chiết xuất từ G pentaphyllum (hình 2.1); (2)- phân đoạn GL3 phân đoạn nhỏ sau phân tách qua cột diaion HP-20 (3) GL-3A; (4)- GL-3C; (5)GL-3C chiết xuất từ G longipes (hình 2.2) Bảng 3.6 Tỉ lệ % ức chế dòng tế bào ung thư phân đoạn Mẫu thử OVCAR-8 Lu MCF-7 (100 µg/ml) (tỉ lệ % ức chế) (tỉ lệ % ức chế) (tỉ lệ % ức chế) SP 55,33 ± 0,42 83,63 ± 0.13 85,68 ± 0,24 GL3 0 54,00 ± 4,98 GL-3A 0 GL-3B 0 GL-3C 53,71 ± 1.77 80,18 ± 0.19 83,78 ± 0,52 Doxorubicin 73,14 ± 1,27 77,16 ± 0,16 82,11 ± 0,7 Bảng 3.7 IC50 mẫu nghiên cứu ba dòng tế bào ung thư Hợp chất SP GL3 GL3C Doxorubicin OVCAR-8 112,09 ± 3,10 109,04 ± 2,6 2,42 ± 0,12 IC50 (µg/ml) Lu 87,62 ± 3,01 86,33 ± 2,34 2,27 ± 0,10 MCF-7 50,88 ± 2,8 116,62 ± 3,81 72,65 ± 2,11 0,38 ± 0,05 Mẫu GL3C SP thể độc tính dịng tế bào nghiên cứu (bảng 3.6) Các mẫu có tác dụng đáng ý GL-3C có IC50 72,65 µg/ml (MCF-7); SP có IC50 50,88 µg/ml (MCF-7) (bảng 3.7) 20 3.4.2 Đánh giá độc tính tế bào chất phân lập Bảy hợp chất phân lập từ loài G pentaphyllum (gypenosid VN 1-7) ba hợp chất phân lập từ G longipes (CGP1, CGP5 CGP7) đánh giá tác dụng gây độc dòng tế bào ung thư HL-60, MCF7, HT-29, SK-OV-3, A549 Bảng 3.8 IC50 gypenosid VN1-7 dòng tế bào ung thư Hợp chất Gypenosid VN1 Gypenosid VN2 Gypenosid VN3 Gypenosid VN4 Gypenosid VN5 Gypenosid VN6 Gypenosid VN7 Mitoxantron IC50 (µM) HL-60 62,8 ± 1,9 > 100 > 100 >100 72,6 ± 3,6 82,4 ± 3,2 > 100 8,1 ± 0,6 A549 22,5 ± 1,4 19,6 ± 1,1 26,8 ± 1,8 28,8 ± 2,4 22,5 ± 1,6 21,4 ± 1,5 28,5 ± 2,0 11,0 ± 0,8 HT-29 30,5 ± 1,9 43,1 ± 1,0 32,6 ± 1,3 20,2 ± 2,1 37,5 ± 1,0 42,3 ± 1,1 36,4 ± 1,7 7,8 ± 1,0 SK-OV-3 28,6 ± 1,4 33,1 ± 0,9 35,4 ± 1,0 27,7 ± 1,4 29,7 ± 1,7 21,4 ± 1,6 35,6 ± 1,1 12,0 ± 1,0 MCF-7 22,6 ± 2,0 21,4 ± 1,3 41,9 ± 1,1 39,2 ± 3,3 19,8 ± 1,0 25,4 ± 1,1 32,0 ± 2,1 11,0 ± 0,8 Các hợp chất gypenosid VN 1-7 thể tác dụng tốt (IC50 < 50 µM) hầu hết dòng tế bào MCF-7, HT-29, A549, SK-OV-3 Tuy nhiên dòng tế bào ung thư bạch cầu cấp (HL-60), hợp chất có tác dụng trung bình đến yếu (bảng 3.8) Ba hợp chất phân lập từ phân đoạn GL3C gylongiposid II, gylongiposid III CGP7 có tác dụng tốt dịng tế bào ung thư thử nghiệm Hợp chất CGP7 thể tác dụng mạnh dòng tế bào ung thư buồng trứng OVCAR-8, IC50 đạt 9,8 µM (bảng 3.9) Bảng 3.9 IC50 gylongiposid II, III CGP7 số dòng tế bào Hợp chất Gylongiposid II Gylongiposid III CGP7 Mitoxantron A549 22,9 ± 3,1 16,3 ± 2,4 30,7 ± 1,1 7,5 ± 0,4 IC50 (µM) HT-29 OVCAR-8 49,6 ± 2,6 16,6 ± 0,2 37,3 ± 4,7 41,5 ± 3,1 30,1 ± 2,5 9,8 ± 2,1 7,1 ± 1,3 8,2 ± 1,0 MCF-7 18,4 ± 2,9 26,3 ± 1,8 28,4 ± 1,6 10,5 ± 1,4 3.5 Kết nghiên cứu tác dụng ức chế NF-κB chống viêm 3.5.1 Tác dụng ức chế NF-κB Tám hợp chất phân lập từ G laxum gồm E5, GL-1, GL-2, GL-6, GL7B, GL-8, GL-9 GL-10 đánh giá tác dụng ức chế NF-κB tế bào HepG2 Hợp chất GL-1, GL-2 GL-8 có tác dụng ức chế đáng kể 21 mức độ ức chế phụ thuộc vào liều NF-κB bị kích hoạt TNF-α Giá trị IC50 hợp chất tìm 7,6 ± 0,4 (GL-2); 9,2 ± 0,3 (GL-8) 9,3 ± 0,3 µM (GL-1) Các chất cịn lại khơng có tác dụng tác dụng khơng đáng kể (hình 3.5) Hình 3.5 Hoạt tính luciferase chất phân lập từ G laxum 3.5.2 Tác dụng chống viêm Hình 3.6 Tác dụng ức chế gen biểu iNOS COX-2 Chất GL-2 có tác dụng ức chế đáng kể hợp chất GL-1; GL-8 ức chế yếu gen biểu iNOS COX-2 TNF-α kích hoạt Tác dụng phụ thuộc vào liều lượng chất thử (hình 3.6) Chương Bàn luận Đã trình bày số ý kiến giá trị khoa học ý nghĩa thực tiễn kết nghiên cứu luận án 22 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ A KẾT LUẬN Về thực vật Đã mô tả chi tiết đặc điểm thực vật có ảnh chụp đầy đủ quan dinh dưỡng quan sinh sản; đối chiếu với khóa phân loại giám định tên khoa học mẫu thu hái Sapa, Lào Cai là: - Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino (GCL năm lá) - Gynostemma longipes C Y Wu (GCL cuống dài) Mẫu thu hái Đà Bắc, Hịa Bình Gynostemma laxum (Wall.) Cogn (Cổ yếm bóng) Về thành phần hóa học - Đã định tính xác định có nhóm chất gồm saponin, flavonoid, đường khử, acid hữu cơ, acid amin, sterol polysaccharid loài Gynostemma longipes Gynostemma laxum - Từ loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino (GCL năm lá) phân lập xác định cấu trúc hóa học saponin có 01 hợp chất biết 3β,20S,21-trihydroxydammar-24-en 3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-L-arabinopyranosyl-21-O-β-Dglucopyranosid chất đặt tên gypenosid VN1-7 - Từ loài Gynostemma longipes C Y Wu (GCL cuống dài) phân lập xác định cấu trúc hóa học saponin có 01 hợp chất biết (23S)-3β,20ξ,21ξ-trihydroxy-19-oxo-21,23-epoxydammar-24-en 3-O[α-L-rhamnopyranosyl(1→2)][β-D-xylopyranosyl(1→3)]-α-L-arabinopyranosid (CGP-7) hợp chất đặt tên gylongiposid II (CGP-1), gylongiposid III (CGP-5) - Từ loài Gynostemma laxum (Wall.) Cogn (Cổ yếm bóng) phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất có flavonoid (quercetin; ombuin, rhamnetin-3-O-rutinosid), glycosid (2,4dihydroxybenzyl-O-α-L-rhamnopyranosid; benzyl-O-β-D-glucopyranosid; benzyl-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid; ethyl-β-rutinosid, acid hữu (acid vanillic) ester (ethyl 3,4-dihydroxybenzoat) Trong có hợp chất 2,4-dihydroxybenzyl-O-α-L-rhamnopyranosid 23 Về độc tính cấp tác dụng sinh học Đã xác định LD50 Gynostemma longipes 119,49 g dược liệu/kg ttc; Gynostemma laxum khơng thể độc tính cấp dùng đến mức liều 150 g dược liệu/kg ttc đường uống Saponin tồn phần chiết từ Gynostemma pentaphyllum có tác dụng ức chế dịng tế bào OVCAR8 (112,09 µg/ml) mức độ yếu; Lu (87,62 µg/ml) MCF-7 (50,88 µg/ml) mức độ trung bình Bảy saponin phân lập từ Gynostemma pentaphyllum gypenosid VN1-7 có tác dụng ức chế dịng tế bào MCF-7, HT-29, A549, SK-OV-3 với IC50: 19,6 – 43,1 µM; mạnh gypenosid VN2 đạt IC50 = 19,6 µM dịng ung thư phổi A549 Các gypenosid VN1-7 ức chế yếu dòng tế bào HL-60 Phân đoạn GL3C chiết từ Gynostemma longipes có tác dụng ức chế dòng tế bào OVCAR8 mức độ yếu (109,04 µg/ml), Lu MCF-7 mức độ trung bình (86,33 72,65 µg/ml) Các saponin tinh khiết phân lập từ Gynostemma longipes có tác dụng ức chế dịng tế bào MCF-7, HT-29, A549, OVCAR-8 với IC50: 9,8 – 49,6 µM; mạnh CGP7 đạt IC50 = 9,8 µM dòng tế bào ung thư buồng trứng OVCAR-8 Ba hợp chất phân lập từ Gynostemma laxum thể tác dụng ức chế phụ thuộc vào liều NF-κB hoạt hóa TNF-α ethyl-β-rutinosid; 2,4-dihydroxybenzyl-O-α-L-rhamnopyranosid rhamnetin-3-O-rutinosid với IC50 9,3 ± 0,3; 7,6 ± 0,4 9,2 ± 0,3 µM Hợp chất 2,4dihydroxybenzyl-O-α-L-rhamnopyranosid có tác dụng ức chế đáng kể ethyl-β-rutinosid; rhamnetin-3-O-rutinosid ức chế yếu gen biểu iNOS COX-2 TNF-α kích hoạt B KIẾN NGHỊ Tiếp tục đánh giá độc tính bán trường diễn dược liệu Gynostemma longipes (GCL cuống dài) để sử dụng dược liệu hợp lý an toàn Tiếp tục sàng lọc nghiên cứu chế tác dụng gây độc tế bào gypenosid phân lập từ loài thuộc chi Gynostemma Blume 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Phạm Thanh Kỳ, Phạm Thanh Huong, Thân Thị Kiều My, Phạm Tuấn Anh, Phan Văn Kiệm, Châu Văn Minh, Nguyễn Xuân Cường, Nguyễn Phương Thảo, Nguyễn Xuân Nhiệm, Jae-Hee Hyun, Hee-Kyoung Kang, Young Ho Kim (2010), "Dammaranetype saponins from Gynostemma pentaphyllum.", Phytochemistry, 71(8–9), 994–1001 Phạm Thanh Kỳ, Phạm Tuấn Anh, Phan Văn Kiệm, Châu Văn Minh, Nguyễn Xuân Nhiệm, Bùi Hữu Tài, Nguyễn Thị Thanh Ngân, Trần Hồng Quang, Nguyễn Phương Thảo, Young Ho Kim (2011), "Benzyl glycosides from the aerial parts of Gynostemma laxum and their NF-κB inhibitory activity in HepG2 cells", Bulletin of the Korean Chemical Society, 32(10), 3763–3766 Phạm Thanh Kỳ, Phạm Tuấn Anh, Phạm Phương Anh (2011), “Phân lập xác định cấu trúc ombuin quercetin từ Cổ yếm bóng”, Tạp chí Dược liệu, 16(4), 253 Phạm Tuấn Anh, Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Xuân Nhiệm, Phạm Hải Yến, Trần Minh Ngọc, Đỗ Thị Trang, Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm (2015), "Damarane-type saponins from Gynostemma longipes and their cytotoxic activity", Natural Product Communications, 4, 1459–1460 Phạm Tuấn Anh, Nghiêm Đức Trọng, Hoàng Văn Lâm, Thân Thị Kiều My, Phạm Thanh Kỳ, Trần Văn Ơn (2015), "Phân loại hình thái số loài thuộc chi Gynostemma Blume Việt Nam", Tạp chí Dược học, 474(33), 34–38 Phạm Tuấn Anh, Phạm Thanh Kỳ, Lê Thị Hồng Hạnh (2018), “Nghiên cứu độc tính cấp hai lồi thuộc chi Gynostemma Blume Việt Nam”, Tạp chí Dược học 5, 53-54 ... lồi chi Gynostemma Blume Việt Nam, thực đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học ba loài thuộc chi Gynostemma Blume Việt Nam? ?? Mục tiêu luận án - Giám định tên khoa học ba mẫu... thuộc chi Gynostemma Blume Việt Nam" , Tạp chí Dược học, 474(33), 34–38 Phạm Tuấn Anh, Phạm Thanh Kỳ, Lê Thị Hồng Hạnh (2018), “Nghiên cứu độc tính cấp hai loài thuộc chi Gynostemma Blume Việt Nam? ??,... dụng sinh học Đã xác định LD50 Gynostemma longipes 119,49 g dược liệu/kg ttc; Gynostemma laxum độc tính cấp dùng đến mức liều 150 g dược liệu/kg ttc đường uống Saponin toàn phần chi? ??t từ Gynostemma