VI SINH VẬT TRONG NƯỚC

PHẦN 2: VI SINH VẬT TRONG NƯỚC Chương 4: NHỮNG VẤN ĐỀ CHUNG VỀ VI SINH VẬT Thế vi sinh vật học? VI SINH VẬT HỌC môn khoa học nghiên cứu vi sinh vật vô nhỏ bé đến mức thấy chúng kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử, trông thấy mắt thường Các vi sinh vật có tên gọi chung VI SINH VẬT Vi sinh vật bao gồm nhiều nhóm khác nhau: Các virus (nhóm chưa có cấu tạo tế bào), vi khuẩn vi khuẩn lam (nhóm sinh vật nhân sơ), vi nấm (nhóm sinh vật nhân chuẩn) số động vật nguyên sinh tảo đơn bào thuộc nhóm Giữa nhóm khơng có mối liên hệ chặt chẽ mặt hình thái hay phân loại, người ta gộp chúng lại chúng có số phương pháp nuôi dưỡng, nghiên cứu hoạt động sinh lý gần giống có đặc điểm chung 4.1 Nguyên tắc phân loại vi sinh vật Có thể phân loại vi sinh vật dựa vào đặc tính hình thái, đặc tính ni cấy đặc tính sinh lý 4.1.1 Đặc tính hình thái Bao gồm hình dáng, kích thước tế bào, khả di động, bố trí tiên mao, khả hình thành bào tử, nhuộm màu gram, hình thức sinh sản, quy luật biến hóa hình thái trình phát triển cá thể 4.1.2 Đặc tính ni cấy Tế bào vi khuẩn phát triển mơi trường đặc có kích thước, hình dạng, màu sắc, tính chất vật lý, đặc điểm bề mặt, rìa mép xung quanh khuẩn lạc, xếp loại khuẩn lạc S, R, M, G, Tế bào vi khuẩn phát triển mơi trường lỏng có tính chất như: làm đục môi trường, phát triển bề mặt, lơ lửng mơi trường hay đáy bình ni cấy 4.1.3 Đặc tính sinh lý Tác dụng với nguồn thức ăn cacbon tự dưỡng hay dị dưỡng, sử dụng nguồn gluxit nào, phát triển nguồn nitơ vô hay nitơ hữu * Vi sinh vật tự dưỡng: Gồm vi sinh vật có khả tiết enzym làm xúc tác cho phản ứng tổng hợp cacbon từ CO2 thành chất hữu phức tạp đáp ứng nhu cầu tế bào Gồm số vi sinh vật quan trọng nông nghiệp, cơng nghiệp * Vi sinh vật dị dưỡng: Nhóm khơng có khả tổng hợp chất hữu từ nguyên tử cacbon Nhóm chiếm đa số vi sinh vật Cách dinh dưỡng giống động vật Thuộc loại gồm có loại: - Dị dưỡng quang năng: Nguồn cacbon chất hữu cơ, nguồn lượng ánh sáng, ví dụ vi khuẩn khơng lưu huỳnh màu tía Chúng sử dụng hợp chất lưu huỳnh làm nguồn cung cấp electron phản ứng tạo thành ATP (Ađênôsin tri photphat) thể Vi sinh vật thuộc nhóm có sắc tố quang hợp, nên chúng có 75 khả hấp thu lượng mặt trời, chuyển hoá thành lượng hố học tích luỹ phân tử ATP - Dị dưỡng hoá năng: Nguồn cacbon chất hữu cơ, nguồn lượng từ chuyển hoá trao đổi chất chất nguyên sinh thể khác, vi sinh vật hoại sinh, vi sinh vật ký sinh Ví dụ động vật nguyên sinh, nấm, số vi khuẩn Với vi sinh vật dị dưỡng nguồn thức ăn cacbon làm hai chức năng: nguồn dinh dưỡng nguồn lượng Một số vi khuẩn dị dưỡng, vi khuẩn gây bệnh sống máu, tổ chức ruột người động vật muốn sinh trưởng nguồn cacbon hữu cần phải cung cấp lượng nhỏ CO2 phát triển 4.2 Đặc điểm chung vi sinh vật 4.2.1 Kích thước nhỏ bé Các Vi sinh vật có kích thước bé, đo đơn vị nanomét (1nm = 10-9 m) vi rút micromet (1μm = 10-6 m) vi khuẩn, vi nấm Chẳng hạn: - Các vi khuẩn có kích thước thay đổi khoảng (0,2 - 2) x (2,0 - 8,0) μm; vi khuẩn Escherichia coli nhỏ: 0,5 x 2,0μm - Các tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có đường kính - 10μm Kích thước bé diện tích bề mặt vi sinh vật đơn vị thể tích lớn 4.2.2 Hấp thu nhiều, chuyển hóa nhanh Tuy vi sinh vật có kích thước nhỏ bé chúng lại có lực hấp thu chuyển hố vượt xa sinh vật khác Chẳng hạn vi khuẩn lắctic (Lactobacillus) phân giải lượng đường lactose lớn 100 - 10 000 lần so với khối lượng chúng, tốc độ tổng hợp protein nấm men cao gấp 1000 lần so với đậu tương gấp 100 000 lần so với trâu bị Năng lực chuyển hóa sinh hóa mạnh mẽ VSV dẫn đến tác dụng vô to lớn chúng thiên nhiên hoạt động sống người 4.2.3 Khả sinh sản nhanh So với sinh vật khác vi sinh vật có tốc độ sinh trưởng sinh sơi nảy nở lớn Chẳng hạn, trực khuẩn đại tràng (Escherichia coli ) điều kiện thích hợp sau 12-20 phút lại phân cắt lần Nếu lấy thời gian hệ 20 phút phân cắt lần, sau 24 phân cắt 72 lần tạo (4 722 366 1017) tế bào Tất nhiên tự nhiên khơng có điều kiện tối ưu (vì thiếu thức ăn, thiếu oxy, dư 76 thừa sản phẩm trao đổi chất có hại ) Trong nồi lên men với điều kiện ni cấy thích hợp từ tế bào tạo sau 24 khoảng 100 000 000 - 000 000 000 tế bào Thời gian hệ nấm men dài hơn, ví dụ với men rượu (Saccharomyces cerevisiae) 120 phút Với nhiều vi sinh vật khác cịn dài nữa, ví dụ với tảo tiểu cầu (Chlorella ) giờ, với vi khuẩn lam Nostoc 23 giờ, Có thể nói khơng có sinh vật có tốc độ sinh sơi nảy nở nhanh vi sinh vật Đây đặc điểm quan trọng người lợi dụng để sản xuất nhiều sản phẩm hữu ích rượu, bia, tương chao, mỳ chính, chất kháng sinh 4.2.4 Năng lực thích ứng mạnh dễ phát sinh biến dị Năng lực thích ứng vi sinh vật vượt xa so với động vật thực vật Trong trình tiến hố lâu dài vi sinh vật tạo cho chế điều hồ trao đổi chất để thích ứng với điều kiện sống bất lợi Người ta nhận thấy số lượng enzim thích ứng chiếm tới 10% lượng chứa protein tế bào vi sinh vật Phần lớn vi sinh vật giữ nguyên sức sống nhiệt độ nitơ lỏng (-196oC), chí nhiệt độ hydro lỏng (- 253oC) Một số vi sinh vật sinh trưởng nhiệt độ 250oC, lạnh đến 0-5oC, mặn với nồng độ 32% NaCl (muối ăn), đến nồng độ mật ong, pH thấp đến 0,5 (vi khuẩn Thiobacillus thioxydans) cao đến 10,7 (vi khuẩn Thiobacillus denitrificans), áp suất cao đến 1103 atm Ở nơi sâu đại dương (11034 m) nơi có áp lực tới 1103,4 atm thấy có vi sinh vật sinh sống Nhiều vi sinh vật thích nghi với điều kiện sống hồn tồn thiếu oxy (vi sinh vật kị khí bắt buộc - Obligate anaerobes) Vi sinh vật đa số đơn bào, đơn bội, sinh sản nhanh, số lượng nhiều, tiếp xúc trực tiếp với mơi trường sống dễ dàng phát sinh biến dị Tần số biến dị thường mức 10-5-10-10 Chỉ sau thời gian ngắn tạo số lượng lớn cá thể biến dị hệ sau Những biến dị có ích đưa lại hiệu lớn sản xuất 4.2.5 Phân bố rộng, chủng loại nhiều Vi sinh vật phân bố khắp nơi trái đất Chúng có mặt thể người, động vật, thực vật, đất, nước, khơng khí, đồ dùng, vật liệu, từ biển khơi đến núi cao, từ nước ngọt, nước ngầm nước biển Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc thực vịng tuần hồn sinh - địa hố học (biogeochemical cycles) vịng tuần hồn Cacbon, vịng tuần hồn Nitơ, vịng tuần hồn Photpho, vịng tuần hoàn Lưu huỳnh, Trong đường ruột người thường có khơng 100 - 400 lồi sinh vật khác nhau, chúng chiếm tới 1/3 khối lượng khô phân Chiếm số lượng cao 77 đường ruột người vi khuẩn Bacteroides fragilis, chúng đạt tới số lượng 1010 1011/g phân (gấp 100 - 1000 lần số lượng vi khuẩn Escherichia coli) Ở độ sâu 10.000 m Đơng Thái Bình Dương, nơi hồn tồn tối tăm, lạnh lẽo chí nơi có áp suất cao người ta phát thấy có khoảng triệu - 10 tỉ vi khuẩn/ml (chủ yếu vi khuẩn lưu huỳnh) Hầu khơng có hợp chất cacbon (trừ kim cương, đá graphít ) mà khơng thức ăn nhóm vi sinh vật (kể dầu mỏ, khí thiên nhiên, formol ) Vi sinh vật có phong phú kiểu dinh dưỡng khác 4.2.6 Là sinh vật xuất trái đất Trái đất hình thành cách 4,6 tỷ năm tìm thấy dấu vết sống từ cách 3,5 tỷ năm Đó vi sinh vật hố thạch cịn để lại vết tích tầng đá cổ Vi sinh vật hoá thạch cổ xưa phát dạng giống với Vi khuẩn lam ngày Chúng có dạng đa bào đơn giản, nối thành sợi dài đến vài chục mm với đường kính khoảng 1-2 mm có thành tế bào dày Dựa vào đặc điểm cấu tạo tế bào, người ta chia làm nhóm lớn: - Nhóm chưa có cấu tạo tế bào bao gồm loại virus - Nhóm có cấu tạo tế bào chưa có cấu trúc nhân rõ ràng (cấu trúc nhân nguyên thủy) gọi nhóm Procaryotes, bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn tảo lam - Nhóm có cấu tạo tế bào, có cấu trúc nhân phức tạp gọi Eukaryotes bao gồm nấm men, nấm sợi (gọi chung vi nấm) số động vật nguyên sinh tảo đơn bào 4.3 Thành phần hóa học cấu tạo tế bào vi khuẩn Vi khuẩn vi sinh vật (VSV) đơn bào, khơng có màng nhân, gồm phần sau: - Màng tế bào (thành tế bào) - Nguyên sinh chất tế bào (bào tương) - Nhân tế bào (hạch vi khuẩn) Chúng có cấu trúc hoạt động đơn giản nhiều so với tế bào màng nhân Kích thước vi khuẩn tính theo đơn vị μ m 4.3.1 Màng tế bào Màng tế bào vi khuẩn mỏng ( ≈ 100 - 200 A0), suốt, không màu, có tính chất đàn hồi có độ bền lớn, chịu áp suất cao Đối với vi khuẩn chuyển động được, màng tế bào uốn theo thể cách nhịp nhàng Màng tế bào chất gồm có hai nhiều lớp với cấu trúc sợi - lớp mỏng 10 - 20 nm, chiếm 15 - 30% trọng lượng khơ tế bào Thành phần hóa học màng tế bào vi khuẩn tương tự sinh vật khác Chúng cấu tạo lớp phospholipit (PL), chiếm 30 - 40% khối lượng màng, protein (nằm trong, hay xen màng), chiếm 60 - 70% khối lượng màng Đầu phosphas PL tích điện, phân cực, ưa nước; hydrocarbon khơng tích điện, khơng phân cực, kỵ nước Màng tế bào chất có chức chủ yếu sau đây: - Bảo vệ tế bào, có tính đàn hồi độ bền lớn - Thực việc tích điện bề mặt tế bào 78 - Khống chế qua lại số chất có phân tử lớn, sản phẩm trao đổi chất - Duy trì hình thái tế bào áp suất thẩm thấu bên tế bào - Là nơi hỗ trợ trình sinh tổng hợp thành phần tế bào polyme bao nhầy - Là nơi tiến hành trình phosphoryl oxy hố q trình phosphoryl quang hợp (ở vi khuẩn quang tự dưỡng) - Là nơi tổng hợp nhiều enzym, protein chuỗi hô hấp - Cung cấp lượng cho chuyển động tiên mao Dựa vào tính chất hố học màng tế bào tính chất bắt màu nó, người ta chia làm loại Gram (+) Gram (-) Vi khuẩn Gram (+) có vách tế bào dày hơn, khoảng 14 - 18nm, trọng lượng chiếm từ 10 - 20% trọng lượng khô vi khuẩn Vi khuẩn Gram (-) có vách tế bào mỏng hơn, khoảng 10nm (1nm = 10-3μm = 10-6 mm = 10-9m) Các vi khuẩn Gram (-) có tính thấm màng ngồi ngun vẹn, cịn vi khuẩn Gram (+) khơng Phương pháp nhuộm Gram sử dụng rộng rãi định loại vi sinh vật Thành phần hố học nhóm khác chủ yếu sau: Bảng 22 Thành phần hố học nhóm (gram dương, gram âm) chủ yếu Thành phần Peptidoglycan Axít teicoic (Teichoic axít) Lipid Protein Gram dương Gram âm Tỷ lệ % khối lượng khơ thành tế bào 30 ÷ 95 ÷ 20 Cao Hầu khơng có 20 Khơng có có Cao Các đại dịch tả dịch hạch lịch sử hai loài vi khuẩn Gram (-), Yersinia pestis Vibrio cholera gây ra, chủng E.coli, Salmonella Shigella thường xuyên nguyên nhân bệnh tiêu chảy Trực khuẩn Gram âm Pseudomonas aeruginosa thường mô tả tác nhân hội gây bệnh người bị tổn thương miễn dịch bị bệnh u xơ nang 4.3.2 Nguyên sinh chất tế bào (bào tương) Nguyên sinh chất khối keo bán lỏng, có độ dày từ 7,5 - 10nm, sống tế bào, bao gồm photpholipit protein protein xếp thành lớp: lớp photpholipit bao gồm hai lớp phân mồi phân tử gồm đầu chứa gốc photphat háo nước đầu chứa hydratcacbon, đầu háo nước hai lớp phân tử photpholipit quay ngoài, chứa men vận chuyển Pecmeaza Hai lớp và Protein Nguyên sinh chất có ý nghĩa quan trọng đời sống vi khuẩn, có đầy đủ tính chất vật chất sống lại có khả khơng ngừng đổi cấu trúc Qua việc đồng hóa chất dinh dưỡng, nguyên sinh chất tế bào có ảnh hưởng đến thành phần tính chất mơi trường xung quanh, đồng thời lại chịu ảnh hưởng yếu tố môi trường Bằng phản ứng hóa học phức tạp, nguyên sinh chất tế bào xảy trình tổng hợp chất phức tạp (protein, 79 gluxit, lipit, ) từ chất đơn giản, đồng thời phân giải chất phức tạp thành hàng loạt chất đơn giản Nguyên sinh chất tế bào gồm có phần: - Màng nguyên sinh chất: Nằm sát màng tế bào có chức vận chuyển vật chất qua màng thông qua thẩm thấu chọn lọc; trao đổi thông tin qua màng; phân hóa màng tế bào (xảy q trình sinh tổng hợp số thành phần tế bào tham gia vào q trình hơ hấp) - Ngun sinh chất (cơ chất bào tương): Là hệ keo sống tế bào, nằm bên tế bào Nó có khả khơng ngừng đổi cấu tạo nó, chuyển hóa thức ăn thành chất phức tạp đặc trưng thể sống - Các thể vùi (những kho vật tư tế bào): Tồn số hạt dự trữ Người ta chia thể vùi làm bốn loại: Thể vùi axít nucleic (hạt vơ lutin), thể vùi lipoit (giọt mỡ); thể vùi gluxit; thể vùi vô - Các bào quan (các quan tử bào tương): Để hoàn thành chức định, bao gồm: + Riboxom: Được ví xí nghiệp siêu vi mơ sản xuất protít, nơi tổng hợp protein tế bào chất, chứa chủ yếu ARN protein Ngồi có chứa lipit, số chất khoáng Ribosom nằm tự tế bào chất chiếm tới 70% trọng lượng khô tế bào chất Mỗi tế bào vi khuẩn có 1000 riboxom, thời kỳ phát triển mạnh nó, số lượng riboxom tăng lên Không phải tất riboxom trạng thái hoạt động Chỉ khoảng - 10% riboxom tham gia vào trình tổng hợp protein Chúng liên kết thành chuỗi gọi polyxom nhờ sợi ARN thơng tin Trong q trình tổng hợp protein, riboxom trượt dọc theo sợi ARN thông tin kiểu đọc thông tin Qua bước đọc, axit amin lại gắn thêm vào chuỗi polypeptit + Meroxom: Được coi trung tâm tổng hợp có dạng tiểu thể hình cầu Trong tế bào có dung mezoxom Mezoxom xuất tế bào phân chia, có vai trị quan trọng việc phân chia tế bào hình thành vách ngăn ngang Ở nhiều loài vi khuẩn, Mezoxom thành phần màng tế bào chất phát triển ăn sâu vào tế bào chất + Không bào: Là phức hợp lipít protít Bên khơng bào chứa đầy dịch thể gồm nước nhiều loại chất hịa tan Khơng bào có chức điều hồ áp suất thẩm thấu tế bào + Sắc thể: Giữ ánh sáng chuyển hóa thành hóa hợp chất hữu để sử dụng 4.3.3 Nhân tế bào Là bào quan đặc biệt quan trọng với chức bao trùm lên hoạt động tế bào; phần vật chất dạng keo nằm bên màng sinh chất, chứa tới 80% nước * Qua cơng trình nghiên cứu, người ta kết luận tính chất nhân vi khuẩn sau: - Nhân vi khuẩn chứa ADN (nghĩa có thành phần nhân tế bào động vật, thực vật, kể người), ADN có cấu trúc sợi kép hai đầu ghép lại thành vịng kín 80 - ADN không phân tán nguyên sinh chất mà tập trung lại thành thể giống nhân - Nhân vi khuẩn khơng có màng nhân nhân con, tiếp xúc trực tiếp với bào tương (đó điểm khác so với nhân thơng thường tế bào sinh vật tiến triển hơn) - Nhân vi khuẩn hoàn thành chức giống chức tế bào sinh vật bậc cao: nghĩa điều khiển trình sinh tổng hợp protein tế bào, có q trình sinh tổng hợp enzym di truyền tính chất tế bào mẹ cho - Nhân vi khuẩn trình tế bào phân cắt phân cắt trước lúc tế bào phân cắt - Số lượng nhân tế bào vi khuẩn khác khác nhau: cầu khuẩn nhân, trực khuẩn có nhiều nhân Như tế bào vi khuẩn có nhân, nhân khơng có màng nhân, khơng có nhiễm sắc thể thành phần AND có cấu trúc vịng * Dựa vào hình thái bên ngồi chia vi khuẩn thành loại khác nhau: Cầu khuẩn, trực khuẩn, cầu trực khuẩn, xoắn khuẩn phẩy khuẩn - Cầu khuẩn: Là vi khuẩn có hình trịn hình cầu lồi có hình dáng đơn giản nhất, nhiên hình bầu dục Kích thước cầu khuẩn thay đổi khoảng từ 0,5 ÷1,0 μm - Trực khuẩn: Là vi khuẩn có hình que, hình gậy, đầu trịn hay đầu vng Kích thước trực khuẩn khoảng từ 0,25 ÷ 0,3 × 0,4 ÷ 1,5 μm Ví dụ vi khuẩn tụ huyết trùng, vi khuẩn dịch hạch - Cầu trực khuẩn: Là loại vi khuẩn trung gian cầu khuẩn trực khuẩn, có hình bầu dục, hình trứng, cú kớch thc khong 0,5 ữ1,0 ì 1,0 ữ 5,0m - Xoắn khuẩn: Kích thước xoắn khuẩn thay đổi khong t 0,5 ữ 3,0 ì 5,0 ữ 40,0 μm Là vi khuẩn có hình sợi lượn sóng, gồm vi khuẩn có từ vịng xoắn trở lên, di động nhờ hay nhiều tiên mao (lơng roi) mọc đỉnh Tất có giống, đa số sống hoại sinh - Phẩy khuẩn: Là vi khuẩn có hình que uốn cong, có hình giống dấu phẩy, hình lưỡi liềm Phần lớn phẩy khuẩn sống hoại sinh, điển hình vi khuẩn thổ tả Bảng 23 Thành phần nguyên tố chủ yếu tế bào vi khuẩn E.Coli Nguyên tố % Chất khô Nguyên tố % Chất khô C 50 Na 1,0 O 20 Ca 0,5 N 14 Mg 0,5 H Cl 0,2 P Fe S Các nguyên K tố khác 81 0,3 4.4 Quy luật sinh trưởng phát triển vi sinh vật Sinh trưởng phát triển thuộc tính sở sinh vật sống, Cũng động vật thực vật, vi sinh vật sinh trưởng phát triển Sinh trưởng phát triển thường lúc diễn lúc, nghĩa số lượng tế bào lúc tỷ lệ thuận với sinh khối tạo thành Điều dễ nhận thấy mơi trường nghèo chất dinh dưỡng, tế bào có khả sinh sản để tăng số lượng tế bào kích thước tế bào nhỏ nhiều điều kiện đầy đủ chất dinh dưỡng * Sinh trưởng: Là tăng kích thước khối lượng tế bào (sự tăng sinh khối) Trong điều kiện môi trường nuôi cấy đầy đủ chất dinh dưỡng điều kiện ni cấy thích hợp, tế bào vi sinh vật tăng nhanh kích thước đồng thời sinh khối tích luỹ nhiều Có nhiều phương pháp kiểm tra sinh trưởng vi sinh vật q trình ni cấy Những phương pháp trình bày sau: - Đo kích thước tế bào non tế bào trưởng thành - Xác định sinh khối tươi sinh khối khô phương pháp ly tâm cân xác định trọng lượng - Xác định hàm lượng nitơ tổng số xác định lượng cacbon tổng số - Xác định q trình trao đổi chất thơng qua cấu tử tham gia q trình lượng oxy tiêu hao, lượng CO2 sản sinh sản phẩm trình lên men * Phát triển: Là tăng lên số lượng tế bào (sự sinh sản) Các vi sinh vật sinh sản phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối lớn sau thời gian ngắn Trong trường hợp sinh sản theo phương pháp dịch ni cấy khơng có tế bào già Vì tế bào phân chia thành hai, tế bào lúc trạng thái phát triển Ta phát tế bào già trường hợp môi trường thiếu chất dinh dưỡng tế bào vi sinh vật khả sinh sản Riêng nấm men tượng phát triển tế bào già rõ Nấm men sinh sản cách nảy chồi Khi chồi non tách khỏi tế bào mẹ để sống độc lập nơi tách tế bào mẹ tạo thành vết vết sẹo Vết sẹo khả tạo chồi Cứ tế bào nấm men mẹ chuyển thành tế bào già theo thời gian Trong nước thải trình xử lý nước thải, vi khuẩn đóng vai trị quan trọng phân hủy chất hữu Các vi sinh vật chủ yếu vi khuẩn dị dưỡng Khi bể xử lý xây dựng xong đưa vào vận hành vi khuẩn có sẵn nước thải bắt đầu phát triển theo chu kỳ phát triển vi khuẩn mẻ cấy vi khuẩn Trong thời gian đầu, để sớm đưa hệ thống xử lý vào hoạt động ổn định dùng bùn bể xử lý hoạt động gần cho thêm vào bể hình thức cấy thêm vi khuẩn cho bể xử lý Chu trình phát triển bể xử lý bao gồm giai đoạn: - Giai đoạn tiềm phát: Xảy bể bắt đầu đưa vào hoạt động bùn bể khác cấy thêm vào bể Đây giai đoạn để vi khuẩn thích nghi với mơi trường bắt đầu trình phân bào 82 Trong giai đoạn tế bào chưa phân chia (nghĩa chưa có khả sinh sản), thể tích trọng lượng tế bào tăng lên trình tổng hợp chất (protein, enzym, axít nucleic, ) diễn mạnh mẽ - Giai đoạn tăng trưởng: Các tế bào vi khuẩn tiến hành phân bào tăng nhanh số lượng Tốc độ phân bào phụ thuộc vào thời gian cần thiết cho lần phân bào lượng thức ăn môi trường Trong giai đoạn này, vi sinh vật sinh trưởng phát triển theo lũy thừa - Giai đoạn ổn định: Mật độ vi khuẩn giữ số lượng ổn định Nguyên nhân giai đoạn chất dinh dưỡng cần thiết cho trình tăng trưởng vi khuẩn sử dụng hết số lượng vi khuẩn sinh số lượng vi khuẩn chết - Giai đoạn suy vong: Trong giai đoạn này, số lượng vi khuẩn chết nhiều số lượng vi khuẩn sinh ra, mật độ vi khuẩn bể giảm Nguyên nhân hai yếu tố: môi trường bị cạn thức ăn môi trường bị nhiễm độc sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật Thực tế bể xử lý có nhiều quần thể khác nhau, đồ thị tăng trưởng vi sinh vật giống dạng khác thời gian tăng trưởng đỉnh đồ thị Trong giai đoạn có lồi có số lượng chủ đạo thời điểm điều kiện pH, oxy, dinh dưỡng, nhiệt độ phù hợp cho lồi Vi khuẩn đóng vai trị quan trọng hàng đầu bể xử lý nước thải Do bể phải trì mật độ vi khuẩn cao tương thích với lưu lượng chất nhiễm đưa vào bể Điều thực thơng qua q trình thiết kế vận hành Trong trình thiết kế phải tính tốn xác thời gian tồn lưu vi khuẩn bể xử lý thời gian phải đủ lớn để vi khuẩn sinh sản Trong trình vận hành, điều kiện cần thiết cho trình tăng trưởng vi khuẩn (pH, chất dinh dưỡng, nhiệt độ, khuấy trộn ) phải điều chỉnh mức thuận lợi cho vi khuẩn 4.5 Phân bố vi sinh vật môi trường nước 4.5.1 Mơi trường nước Tất nơi có chứa nước bề mặt hay lòng đất coi môi trường nước Những địa điểm chứa nước cịn gọi thuỷ vực Trong thuỷ vực khác nhau, tính chất hố học vật lý khác Bởi môi trường sống thuỷ vực có đặc trưng riêng biệt phân bố vi sinh vật phụ thuộc vào đặc trưng riêng biệt Khoảng 71% bề mặt trái đất bao phủ mặt nước Nước coi dạng thức vật chất cần cho tất sinh vật sống trái đất môi trường sống nhiều loài Nước tồn trái đất dạng: rắn (băng, tuyết), lỏng thể khí (hơi nước), trạng thái chuyển động (sơng, suối) tương đối tĩnh (hồ, ao biển) Nước ngầm có lớp đất nằm mặt đất nguồn nước khác thấm vào Nước ngầm có hàm lượng muối khống khác tuỳ vùng Nhìn chung nước ngầm nghèo chất dinh dưỡng Nước bề mặt bao gồm suối, sông, hồ, biển Suối tạo thành nơi nước ngầm chảy bề mặt đất từ khe núi đá Tùy theo vùng địa lý nước suối khác nhiệt độ thành phần hoá học Tùy theo thành phần hàm lượng chất khoáng mà người ta phân biệt suối mặn, suối chua, suối lưu huỳnh 83 Nước sơng có lượng nước nhiều suối Sơng vùng đồng thường giàu chất dinh dưỡng vùng núi lại bị ô nhiễm chất thải công nghiệp sinh hoạt Hồ vùng trũng ngập đầy nước đất liền Hồ vùng núi đá có nguồn nước ngầm chảy hồ vùng đồng khác lớn nhiệt độ thành phần chất dinh dưỡng Ngay hồ có phân tầng, tầng lại có điều kiện mơi trường khác như: - Nước cần cho sống môi trường sinh thái: Con người ngày cần đến 1,83 lít nước Nước giúp người động vật trao đổi, vận chuyển thức ăn tham gia vào phản ứng sinh hoá học, mối liên kết cấu tạo thể Nước cần cho tất vi sinh vật, động vật, thực vật người - Nước cần cho sản xuất nông nghiệp: Để sản xuất 1kg lúa cần lượng nước 750 kg (gấp 100 lần sản xuất 1kg thịt), trồng cần 5000m3/ha, với hoa màu tương tự 5000m3/ha - Nước để chữa bệnh: Người ta chữa số bệnh uống nhiều nước để trình phân giải chất độc, trao đổi chất mạnh Tắm nước khống nóng suối nước tự nhiên để chữa bệnh thấp khớp, da, bệnh tim mạch, thần kinh,…vì tắm chất điện giải làm cho thể hoạt hoá mạnh hơn, trao đổi chất tăng, ăn ngon, ngủ khỏe - Nước cho sản xuất công nghiệp: Làm lạnh động cơ, nước gây áp lực quay tuabin, làm dung mơi hồ tan chất màu phản ứng hóa học khác Mỗi ngành công nghiệp, khu chế xuất yêu cầu lượng nước khác - Nước cần cho giao thông vận tải: Giao thơng đường thuỷ bề mặt yếu tố tất yếu Các sơng ngịi, kênh rạch, đại dương, hồ ao, vịnh môi trường thuận lợi để giao thông vận tải - Nước cần cho phát triển du lịch: Nước không cung cấp cho sinh hoạt du lịch mà cịn mơi trường để phát triển dạng du lịch: Du lịch sông, hồ, kênh rạch, Môi trường sống thuỷ vực có đặc trưng riêng biệt phân bố vi sinh vật phụ thuộc vào đặc trưng đó: Môi trường nước Việt Nam Mỗi năm nước ta sử dụng hết khoảng 10 tỷ m3 nước ngầm, lại 340 tỷ m3 hay > 97% nhu cầu nước cho sinh hoạt sản xuất lấy từ sông ngịi Ở Việt Nam có 2360 sơng, tập trung thành 30 hệ thống lớn nhỏ, có hệ thống sơng có diện tích khu vực lớn 10000 km2 Cũng hệ thống sông lớn lưu giữ vận chuyển khoảng 86% tài nguyên nước quốc gia Trữ lượng nước ngầm nước ta mức trung bình so với nước giới phân bố không đồng theo miền địa chất thuỷ văn: Bắc trung (chiếm khoảng 31% trữ lượng nước), nam trung 24%, đông tây bắc miền chiếm khoảng 16%, nam 10%, đồng bắc 6% Tuy nhiên, xem xét toàn phân bố nước Việt Nam thấy trữ lượng phân bố không đồng có dao động lớn năm Trong mùa mưa, lượng nước chiếm tới 80% tổng lượng nước có năm, mùa khơ lượng nước cịn 20% 84 mơi trường Áp suất riêng phần H2 giữ < 10-3 atm để vi sinh vật biến đổi H2 thành CH4 theo phản ứng sau: 4H2 + CO2 → CH4 + 2H2O Các loài vi sinh vật (dinh dưỡng hydro): vi khuẩn cổ hóa dưỡng vơ Chúng dùng H2 để khử CO2 nhằm thu lượng vi khuẩn cổ tự dưỡng chúng sử dụng CO2 làm nguồn cacbon Các loài vi sinh vật thứ hai (sinh axetat): vi khuẩn cổ hố dưỡng hữu chúng cắt axetat thành metan CO2, thu nhận lượng từ axetat: CH3COOH → CH4 + CO2 Axetat anion Khi bị cắt thành metan CO2, cần có cation cặp đơi tham gia vào q trình Khi ion cặp đơi ion NH4+, sinh bước lên men đầu, amoni bicacbonat NH4HCO3, tạo thành Khi cation cặp đôi H3O+ sinh bước lên men đầu, axít cacbonic, H2CO3, tạo thành CO2 giải phóng thể tích khí sinh học Kết hai trường hợp làm môi trường trở nên kiềm hóa (pH lại tăng lên), tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển Do tạo thành metan xuất bước kiềm hóa Nhóm vi khuẩn chủ yếu giai đoạn là: Methalnobacterium, Methalnosacrina, Methalnococcus, Methalnobrevibacter, Methalnothrix Về hình thái vi khuẩn có hình dạng cầu khuẩn, xoắn khuẩn trực khuẩn sinh lý vi khuẩn giống sinh trưởng nồng độ oxy vượt q 0,1% * Q trình metan hóa (Methanogenesis): Vi sinh vật chuyển hóa metan phân hủy số loại chất định CO2 + H2, format, acetat, metanol, metylamin CO Đó giai đoạn cuối trình phân hủy sản phẩm hữu đơn giản giai đoạn trước để tạo thành metan CO2 nhờ vi khuẩn lên men metan Chúng có hai nhóm: - Nhóm biến đổi axetat: Nhóm có tốc độ phát triển chậm ngun nhân mà cơng trình xử lý yếm khí phải có thời gian lưu chất thải cơng trình lâu - Nhóm biến đổi hydrogen: Nhóm có tốc độ phát triển nhanh nhiều, chúng giữ vai trò quan trọng quần thể vi sinh vật sinh metan tổng thể Các vi khuẩn có khả giữ áp suất riêng phần hidro thấp, tạo điều kiện tốt cho q trình axít béo chuyển hóa thành axêtat Do cần phải theo dõi sát nồng độ hydro Dưới điều kiện nồng độ hydro cục cao, tạo thành axetat giảm chất chuyển thành axít propionic, butyric etanol thay metan Vi khuẩn sinh metan vi khuẩn gam (-), thường không di động Chúng phát triển chậm mơi trường nước thải, chu kỳ sinh từ ngày 350C 50 ngày 100C Khoảng 2/3 metan tạo từ chuyển hố axetat nhóm vi khuẩn 1/3 lại giảm CO2 tạo hydro Như vậy, q trình phân hủy yếm khí chia thành giai đoạn sau: 118 Các điều kiện ảnh hưởng đến trình phân hủy yếm khí: * Oxy: Trong xử lý yếm khí nước thải, oxy coi độc tố vi sinh vật Do lý tưởng tạo điều kiện yếm khí tuyệt đối bể xử lý * Ngun liệu: Là loại nước thải có độ nhiễm cao Trong bể phản ứng sinh metan, cần phải khuấy trộn nguyên liệu Tác dụng khuấy trộn để phân bố chất dinh dưỡng, tạo điều kiện chất dinh dưỡng tiếp xúc tốt với vi sinh vật, giải phóng sản phẩm khí khỏi hỗn hợp lỏng - rắn Vi sinh vật phân giải yếm khí, địi hỏi chất dinh dưỡng yếu bao gồm hợp chất chứa C, N, P số nguyên tố vi lượng với tỷ lệ thích hợp Nếu giữ quần thể vi khuẩn khơng đổi hệ yếm khí phải cung cấp chất hữu nhiều gấp lần so với hệ hiếu khí Nếu khơng cung cấp đủ chất dinh dưỡng ảnh hưởng đến trình phân giải chất nước thải Chẳng hạn, cung cấp nhiều N làm hạn chế phát triển vi sinh vật, thiếu N ảnh hưởng đến hình thành enzym thực trình phân giải,… * Nhiệt độ: Nhóm vi sinh vật yếm khí có vùng nhiệt độ thích hợp cho phân hủy hợp chất hữu cơ: + Vùng nhiệt độ cao: 45 - 650C (thermophilic) + Vùng nhiệt độ trung bình: 20 - 450C (mesophilic) + Vùng nhiệt độ thấp: 200C (psychrophilic) Hai vùng nhiệt độ đầu thích hợp cho hoạt động nhóm vi sinh vật sinh metan Ở nước ta, nhiệt độ trung bình 20 - 32oC, thích hợp cho nhóm vi sinh vật nhiệt độ trung bình phát triển Dưới 100C, vi sinh vật metan không hoạt động Trong nhiều tài liệu công bố, khoảng nhiệt độ 40-55oC, hiệu xử lý cao nhiều so với nhiệt độ thường Theo số nghiên cứu cho thấy, mùa hè với nhiệt độ cao, vi sinh vật hoạt động mạnh hơn, q trình xử lý tốt Về mùa đông, nhiệt độ giảm xuống thấp, vi sinh vật bị ức chế hoạt động, hiệu suất xử lý thấp (78.3%) nhiều so với mùa hè (92.8%) Như vậy, hệ thống xử lý nước thải cơng suất lớn, tận dụng khí CH4 để gia nhiệt dịng nước thải đầu vào, làm tăng nhiệt độ môi trường vào mùa đông, hiệu xử lý hệ thống tốt 119 * pH môi trường: Tối ưu từ 6,5 - 8,5 phân hủy thất bại pH gần mức 6,0; axít trung gian tích lũy nhiều, làm phản ứng phân hủy khó thực dẫn đến dừng q trình axetat hố Trong xử lý yếm khí sinh metan có nhóm thực hiện: Nhóm vi sinh vật thực q trình axít hóa làm cho giá trị pH mơi trường giảm Khi độ pH xuống thấp q trình axít hóa chậm lại; nhóm thứ hai thực q trình metan hóa phát triển tốt giá trị pH gần trung tính trung tính Ở pH kiềm tính, vi sinh vật chịu ảnh hưởng so với pH axít Ở giá trị pH axít, vi sinh vật hoạt động hiệu vi sinh vật sinh axít bị ức chế mạnh mơi trường axít so với mơi trường kiềm giá trị kiềm nhẹ, nhóm vi khuẩn sinh metan bị bị ảnh hưởng so với giá trị pH axít Axít gây cản trở nhiều cho nhóm vi khuẩn tạo metan so với nhóm vi khuẩn tạo axít Sự tăng axít dễ bay dấu hiệu cho thấy hệ thống khơng cịn hoạt động hiệu Theo dõi tỷ lệ tổng mức axít dễ bay (như axít acetic) so với tổng độ kiềm (như cácbonat canxi) để bảo đảm tỷ lệ thấp * Các độc tố: - Một số hợp chất như: cacbon tetraclorua cacbon, metylen clorua, clorofooc, …các ion kim loại có nồng độ 1mg/L ảnh hưởng lớn đến hệ vi sinh vật sinh metan Người ta xác định tính độc ion kim loại đến hệ vi sinh vật sau: Cr > Cu > Zn > Cd > Ni - Các hợp chất formandehit, SO2, H2S với nồng độ 400 mg/l gây độc hại với vi sinh vật lên men yếm khí - S2- (do tạo kết tủa với số nguyên tố vi lượng), NH4+(nồng độ 1,5 ÷ mg/l): gây ức chế q trình lên men yếm khí * Thời gian lưu thủy lực: Nếu thời gian lưu thủy lực ngắn, hiệu suất xử lý thấp ngược lại Tuy nhiên, kéo dài thời gian xử lý chi phí đầu tư ban đầu hệ thống lớn Kết nghiên cứu cho thấy, thời gian xử lý lâu hiệu suất xử lý cao, kết phù hợp với báo cáo Mefcaff Theo đó, thời gian lưu thủy lực khoảng 4-12 tùy thuộc vào mức độ ô nhiễm Thời gian lưu bồn phân hủy nhiệt độ thường nhiệt độ cao từ 25 - 35 ngày thấp * Cloramin B nước Javen: Đối với hệ thống xử lý nước thải phương pháp sinh học, chất sát trùng có ảnh hưởng khơng tốt đến hoạt động vi sinh vật làm giảm hiệu suất xử lý Nhiều kết nghiên cứu cho thấy, nồng độ Cloramin B tỉ lệ thuận với hiệu suất xử lý Nồng độ Cloramin B từ 0.01 - 0.02 mg/l cho hiệu suất xử lý thấp, chấp nhận Khi nồng độ tăng lên từ 0.03 - 0.04 mg/l hiệu suất giảm nhiều Khi nồng độ Cloramin B tăng lên đến 0.05 mg/l hiệu suất khơng giảm mà cịn tăng nhẹ tiêu Điều giải thích nồng độ Cloramin B nước thải đạt 0.05 mg/l vi sinh vật hệ thống xử lý nước thải bị ức chế hoàn toàn, thối rữa tạo thành dạng keo nước làm cho COD SS tăng lên 120 Các kết nghiên cứu cho thấy, Javen có tính sát trùng mạnh, mạnh khoảng 10 lần so với Cloramin B Do đó, để khơng ảnh hưởng đến hiệu suất xử lý nước thải cần phải loại bỏ Javen khỏi hệ thống 5.4 Một số phương pháp phân tích vi sinh vật nước 5.4.1 Giới thiệu chung Trong nước thải, đặc biệt nước thải sinh hoạt, nước thải bệnh viện, khu chăn ni, nhiễm vi sinh vật có sẵn phân người phân gia súc Trong có nhiều loài vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt bệnh đường tiêu hóa, tả lỵ, thương hàn, ngộ độc thực phẩm, cần phải loại bỏ khỏi nước trước sử dụng Trong thực tế xác định tất loại vi sinh vật gây bệnh qua đường nước phức tạp tốn thời gian Mục đích việc kiểm tra vệ sinh nước xác định mức độ an toàn nước sức khoẻ người Do dùng vài vi sinh thị ô nhiễm phân để đánh giá ô nhiễm từ rác, phân người động vật Có ba nhóm vi sinh thị nhiễm phân: - Nhóm colifom đặc trưng Escherichia coli (E.coli) - Nhóm Streptococcus đặc trưng Streptococus faecalis - Nhóm Clostridium đặc trưng Clostridium perfringens Đây nhóm vi khuẩn thường xuyên có mặt phân người, E.coli loại trực khuẩn đường ruột, có thời gian bảo tồn nước gần giống vi sinh vật gây bệnh khác Sự có mặt E.coli chứng tỏ nguồn nước bị nhiễm bẩn phân rác có khả tồn loại vi trùng gây bệnh khác Số lượng E.coli nhiều hay tùy thuộc vào mức độ nhiễm bẩn phân rác nguồn nước Colifoms coli tổng số, gồm vi khuẩn có dạng giống coli, khơng nhiễm phân; cịn E.coli coli phân Khuẩn lạc coli có hình trịn, màu hồng, có bờ rõ Nếu colifom khơng có ánh kim; cịn E.coli có ánh kim Colifoms: tiêu chuẩn cho phép 20 khuẩn lạc/1 lít nước sinh hoạt E.coli: tiêu chuẩn cho phép khuẩn lạc/1 lít nước sinh hoạt 5.4.2 Coliforms Coliforms trực khuẩn gram âm khơng sinh bào tử, hiếu khí yếm khí tùy ý, có khả lên men lactose sinh axit sinh 370C 24 ÷ 28 Nhóm Coliforms diện rộng rãi tự nhiên, ruột người động vật Coliforms xem nhóm vi sinh vật thị, số lượng diện chúng nước dùng để thị khả diện vi sinh vật gây bệnh khác Nhiều nghiên cứu cho thấy số Coliforms cao khả diện vi sinh vật gây bệnh khác cao Nhóm Coliforms gồm giống Escherichia, Citrobacter, Klebsiella Enterobacter - Coliforms chịu nhiệt: coliforms có khả lên men đường lactose 44÷45oC; nhóm bao gồm Escherichia lồi Kiebsiella, Enterobacter, Citrobacter Khác với E.Coli, coliforms chịu nhiệt xuất xứ từ nguồn nước giàu chất hữu nước thải công nghiệp từ xác thực vật thối rữa đất 121 Coliforms chịu nhiệt không tái phát triển hệ thống phân phối nước ngoại trừ nước chứa đủ chất dinh dưỡng, chất bẩn tiếp xúc với nước xử lý, nhiệt độ nước cao 13oC nước khơng có clo thừa Trong đại đa số trường hợp, đậm độ coliforms chịu nhiệt có liên quan trực tiếp đến đậm độ E.coli Vì vậy, việc sử dụng loại vi khuẩn để đánh giá chất lượng nước xem chấp nhận cho công việc ngày - Coliforms tổng số: Theo phương pháp phân loại nhóm khơng đồng Nhóm bao gồm vi khuẩn lên men lactose Escherichia cloacae, Citrobacter freundii tìm thấy phân ngồi mơi trường (nước giàu chất dinh dưỡng, đất xác thực vật) nước uống có nồng độ chất dinh dưỡng tương đối cao Nhóm bao gồm lồi thấy phân, phát triển nước uống có chất lượng tương đối tốt Seratia fonticola, Rabnella aqualiris Buttiaxella agrestis Như vậy, sử dụng coliforms tổng số hay coliforms chịu nhiệt để đánh giá ô nhiễm nguồn nước, thực phẩm có nguồn gốc từ phân liên quan đến vi khuẩn đường ruột Giới hạn, nước thành phố chứa tối đa coliform 100 ml, giếng tư nhân phép chứa nhiều Đối với nước uống khơng cho phép chứa nồng độ coliform, cầu khuẩn đường ruột, virus hay động vật nguyên sinh Các thuỷ vực dùng để nuôi cá hay làm bể bơi cho phép chứa từ 70 ÷ 200 coliform 100 ml Nếu số coliform bể nước dùng cho giải trí đạt tới 1000 ml quan y tế thường cấm sử dụng 5.4.3 E.Coli Escherichia.coli (E Coli) vi sinh vật hiếu khí có hình que hai đầu trịn, kích thước dài ngắn khác nhau, thường từ 2÷3 micromet × 0,5 micromet Khơng có khả hình thành bào tử, có khả hình thành giáp mạc (vỏ nhầy) gặp môi trường tốt Escherichia coli loài trực khuẩn đường ruột người số động vật Buchner phát từ năm 1885 Escherich nghiên cứu đầy đủ năm 1886 E.Coli bình thường sống ruột già Trong tiếng Latinh ruột già colum E.coli thải môi trường theo phân, chiếm tới 80% vi khuẩn hiếu khí ruột giữ cân sinh thái nên E.coli chọn làm vi sinh vật thị ô nhiễm Có nghĩa đâu có E.coli chứng tỏ có nhiễm phân có nhiễm loại vi sinh vật gây bệnh khác E.coli gọi E.coli phân có nhiều tính chất sinh hóa đặc biệt nhóm coli khác Dựa đặc tính loại vi trùng có khả sống mơi trường axít, nhiệt độ cao loại vi trùng khác (42 ÷ 440C), phản ứng với metyl đỏ cho dương tính, khuẩn lạc ánh kim môi trường thạch indol E.Coli thành viên họ Enterobacteriace Nó phát triển nhiệt độ 44 ÷ 45oC môi trường tổng hợp, lên men đường lactose có sinh sinh axit, sinh endol từ triptophan Tuy nhiên số chủng phát triển 37oC khơng phát triển 44 ÷ 45oC số khơng sinh Nó sống pH 5,5 ÷ 8,0, thích hợp pH ÷ 7,2 Phân lập vi khuẩn tỏ phức tạp cơng việc có tính chất ngày Vì vậy, người ta xây dựng số phương pháp phân lập nhanh chóng tin cậy Trong phương pháp đó, số tiêu chuẩn hóa mức độ quốc tế, 122 quốc gia chấp nhận cho việc sử dụng ngày Một số phương pháp khác phát triển đánh giá E.Coli có mặt nhiều phân người động vật Trong phân tươi, đậm độ chúng đến 109/g Như E.coli tiêu vệ sinh rõ ràng, hiển nhiên nhiễm bẩn môi trường hoạt động người Chúng tìm thấy nước cống rãnh, công đoạn xử lý tất nguồn nước đất vừa bị nhiễm phân từ người, động vật sản xuất nông nghiệp Gần người ta nghĩ đến E.coli tồn chí phát triển nguồn nước vùng nhiệt đới đối tượng bị ô nhiễm phân Tuy nhiên, vùng sâu, vùng xa không phép loại trừ khả nhiễm phân động vật hoang dại, kể chim Bởi lẽ động vật lan truyền vi khuẩn gây bệnh cho người nên không quên diện E.coli coliforms chịu nhiệt, có mặt chúng chứng tỏ nước bị nhiễm phân xử lý không hiệu E.coli gây bệnh như: tiêu chảy, kiết lỵ, viêm đường tiết niệu, viêm gan, viêm phế quản, viêm màng phổi, 5.4.4 Phương pháp phân tích a Định lượng E.coli phương pháp màng lọc * Nguyên tắc: Dựa vào nồng độ vi trùng coli khối lượng nước định mọc thành khuẩn lạc màng lọc đặt nuôi cấy thạch Endol 37oC ± 0,5oC 24h Đếm khuẩn lạc có ánh kim tính tổng số coli phân * Tiến hành: Khối lượng nước đem phân tích khơng lấy 350 ml phải lọc qua hai màng lọc Tùy chất lượng nước, chọn cho màng lọc có số khuẩn lạc vi trùng coli không 30 Cần vào lần phân tích trước để chọn cho thích hợp Có thể dùng màng lọc tái tạo sau sử dụng, màng lọc không rách Dùng tầm cồn đốt lên để trùng phễu lọc đế lọc, đặt tiếp phễu lên vặn chặt lại Đổ nước lọc vô trùng vào phễu lọc, cho máy hút chân không hoạt động Ban đầu lọc tý nước một, sau lọc phần cịn lại Khi lọc lượng nước nhỏ (khoảng ml) trước hết lọc 10 ml nước cất, sau lọc nước đem phân tích Sau lọc hết nước, nhấc cẩn thận màng lọc ra, đặt mặt thạch Endol (tránh tạo thành bọt khí màng lọc bề mặt thạch), đặt mặt tiếp xúc với nước lọc ngửa lên Sau đó, đặt mơi trường endol có màng lọc vào tủ có nhiệt độ 37oC 18 - 24h 123 Tính số coli hay coli-tit với phương pháp màng lọc: Chỉ số coli (hay coli-index): số trực khuẩn coli phân có lít nước xác định theo công thức: Coli -index = 1000.n Q Trong đó: n - số khuẩn lạc coli phân; Q - lượng nước đem lọc, tính ml; Chuẩn độ coli (hay colitit): lượng nước có chứa vi khuẩn coli Tính ml Giữa chuẩn độ coli số coli có mối quan hệ sau: Chuẩn độ Coli = 1000 Chỉ số coli Nếu màng lọc khơng thấy có vi trùng mọc có khuẩn lạc, vi trùng mọc khơng điển hình coli phân, khơng sinh ánh kim số coli quy ước < âm tính Khi có khuẩn lạc điển hình coli phân mọc màng lọc - dương tính Ví dụ 1: Chuẩn độ coli có nước phân tích 250 có nghĩa 250 ml có tế bào coli số coli là: 1000/250 = 4: số coli lít nước 4, có nghĩa lít nước có tế bào coli Người ta dùng số coli cho đơn vị thể tích ml, đơn vị khối lượng gam Ví dụ 2: Khi cấy mẫu nước chia làm lần, lần 100 ml lọc qua màng lọc, màng lọc mọc khuẩn lạc coli có ánh kim, cịn màng cịn lại khơng có khuẩn lạc nào, số coli : (3.1000)/300 = 10 coli/l nước Ví dụ 3: Nếu lọc 10 ml qua màng lọc, 100 ml qua màng lọ khác, sau cấy thấy khuẩn lạc coli mọc màng lọc kia, số coli : (6.1000)/110 = 54 coli/l nước b Định lượng coli môi trường Endol * Ngun tắc: Dựa vào tính chất hóa sinh coli: Chịu nhiệt độ cao, chúng phát triển tốt nhiệt độ 420C; sống phát triển mơi trường axít; có khả lên men đường lactoza, sinh nhiều nhanh; có khả sinh indol 124 * Tiến hành: - Đun chảy môi trường endol (đã khử trùng) nồi cách thủy - Đun chảy mơi trường Endol khử trùng, đóng bình cầu, bình 100 ml - Pha lỗng nước kiểm nghiệm đậm độ khác tùy theo độ bẩn nước (1/10, 1/100, 1/1000, ) - Đánh số hộp lồng theo độ pha loãng mẫu nước - Cho vào hộp lồng hộp ml nước có nồng độ tương ứng - Đợi thạch nguội đến 40 - 450C, đổ vào hộp lồng, hộp khoảng 15 ml - Để nghiêng hộp thạch bàn phẳng, xoay nhẹ hộp theo chiều để trộn thạch nước thử - Để yên cho thạch đông, úp ngược, để kênh, cho vào tủ sấy có nhiệt độ 600C tắt tủ sấy, đợi đến nhiệt độ tủ nhiệt độ phịng thí nghiệm lấy ra, úp ngược, nuôi cấy tủ ấm 420C/48h * Kết quả: - Đếm số khuẩn lạc mọc thạch - Khuẩn lạc có hình trịn, màu hồng, có bờ rõ Khuẩn lạc E.coli có ánh kim - Chỉ số coli: X = A + 10B +100C / lít nước S Trong đó: A - Số khuẩn lạc có hộp cấy 1ml nước nguyên mẫu B - Số khuẩn lạc có hộp cấy 1ml nước kiểm nghiệm pha lỗng 1/10 C - Số khuẩn lạc có hộp cấy 1ml nước kiểm nghiệm pha loãng 1/100 S - Số trung bình mẫu, tính số nồng độ pha loãng dùng xét nghiệm, S = Để nâng cao hiệu quy trình định lượng phương pháp đếm khuẩn lạc, điều kiện cần phải điều chỉnh cho có thành viên vi sinh vật cần xác định theo định nghĩa đếm c Định lượng tổng Coli phương pháp lên men nhiều ống (phương pháp ước đoán số lượng Coli kỹ thuật MPN - Most Probable Number) * Nguyên tắc: Định lượng tổng coli phương pháp lên men nhiều ống dựa theo TCVN 2652 - 78 TCVN 2681 - 78 Tiêu chuẩn nước uống - Phương pháp phân tích hóa lý vi khuẩn nước Phương pháp tiến hành sở lên men đường lactoza sinh môi trường lỏng, nhiệt độ 370C/24h dựa tính chất sinh ánh kim loại khuẩn lạc mọc môi trường cứng (thạch Endol,…) để tính số lượng coli nhiều ống nhiều nồng độ pha loãng khác theo bảng MPN * Tiến hành: 125 Tùy theo độ bẩn nước (nước xử lý, nước sông, thải sinh hoạt,…) để chọn độ pha loãng mẫu nước - Nước khử trùng clo, nước javen, clorua vôi, chiếu tia Phân tích nồng độ sau: + ống loại 10 ml nước mẫu ống loại 50 ml, ống loại 10 ml; ống loại ml + Hoặc ống loại 10 ml; ống loại 0,1 ml; ống loại 0,01 ml ống loại 0,1 ml; ống loại 0,01 ml; ống loại 0,001 ml - Nước thải thành phố, nước cạnh chuồng gia súc, cạnh hố xí pha loãng tiến hành pha loãng cách khác Các nồng độ pha loãng dung dịch nước muối sinh lý NaCl dung dịch đệm phosphas Trên giá đựng ống nghiệm có nhiều lỗ, hàng ống nghiệm chứa ống Durham - khoảng 50x6mm, đặt ngược để thu khí sinh q trình lên men Cho vào ống nghiệm ml nước cần phân tích Đặt giá vào tủ ấm có nhiệt độ 370C 430C Chọn ống CLD (Canh Lactô phenol đỏ) dương tính - thấy men sinh (chỉ thị phenol chuyển thành màu vàng có bọt ống Durham) Chỉ tính ngược lại ống có nồng độ pha lỗng Hình 13 Sau giữ 24 giờ, ống đánh giá theo sinh khí Kết dương tính sinh khí chứng sơ có mặt coliforms Số ống dương tính đếm dùng để tính số lượng thường gặp coliforms dựa theo bảng thống kê Phép thử khẳng định tiến hành cách cấy mẫu dương tính vào ống nghiệm khác Giả sử khuẩn lạc ống lên men sinh thạch Endol có ánh kim ta có hộp số, tra bảng số MPN tìm số E coli từ tính số coli hay colitit * Kỹ thuật MPN có số nhược điểm Trước hết cần vài ngày để thực Thứ hai, không phân biệt coliforms thường gặp đất nước (Enterobacter) với coliforms thuộc phân thật chủ yếu sống đường ruột động vật (Escherichia) Để xác định coliform thuộc phân đòi hỏi phép thử đặc hiệu chẳng hạn phép lọc qua màng d Định lượng Colifoms theo phương pháp màng lọc * Nguyên tắc: Lọc lấy mẫu nước cần xác định vi khuẩn qua màng lọc máy lọc hút chân khơng Đặt màng lọc có vi khuẩn vào hộp lồng có mơi trường dinh dưỡng đặt hộp lồng vào tủ ấm 370C/24h, hôm sau lấy đọc kết đếm khuẩn lạc màu xanh tím Mỗi khuẩn lạc vi khuẩn * Tiến hành: 126 - Pha loãng nước kiểm nghiệm đậm độ khác tùy theo độ bẩn nước (1/10, 1/100, 1/1000, ) - Chuẩn bị ống môi trường (đã khử trùng) tuýp bảo quản tủ lạnh - Gắp màng lọc đặt vào phễu lọc máy lọc hút chân không - Đổ ống nghiệm chứa 10 ml mẫu nước pha loãng vào phễu lọc - Bơm hút cho nước mẫu chảy xuống hết qua màng lọc - Cho môi trường vào hộp lồng đánh số theo độ pha loãng mẫu nước - Gắp màng lọc từ phễu lọc đặt vào hộp lồng có mơi trường - Đợi cho mơi trường ngấm hết giấy lọc, lật ngược cất hộp lồng vào nuôi cấy tủ ấm 370C * Kết quả: - Đếm số khuẩn lạc màu xanh tím mọc màng lọc, khuẩn lạc vi khuẩn - Tổng số colifoms có 100 ml nước mẫu tính theo cơng thức: X = A N 10 Colifoms/100 ml Trong : A: số khuẩn lạc mọc hộp lồng N: hệ số pha loãng 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Văn Bảo Hóa nước Nhà Xuất Xây dựng Hà Nội 2002 Trần Ngọc Lan Hóa học nước tự nhiên Nhà Xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 2007 Lâm Ngọc Thụ, Trần Thị Hồng Hóa học nước Nhà Xuất Khoa học Kỹ thuật Hà nội 2006 Nguyễn Ngọc Tuấn Phân tích mơi trường Giáo trình cao học Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà lạt 2004 Lê Ngọc Chung Hóa học mơi trường Giáo trình cao học Trường Đại học Đà lạt 2004 Lê Đức (Chủ biên) Một số phương pháp phân tích mơi trường NXB Đại học Quốc gia Hà Nội 2006 Nguyễn Thạc Cát, Từ Vọng Nghi, Đào Hữu Vinh Cơ sở lý thuyết Hóa học phân tích Nhà Xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 1985 Lê Ngọc Chung Các phương pháp phân tích kích hoạt Giáo trình cao học Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà lạt 2004 G.Rheinheimer (Người dịch Kiều Hữu Ánh) Vi sinh vật học nguồn nước Nhà Xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 1985 10 Đỗ Hồng Lan Chi, Lâm Minh Triết Vi sinh vật kỹ thuật môi trường - Viện TN & MT Tp Hồ Chí Minh, 2003 11 Trung tâm đào tạo ngành nước môi trường dịch giới thiệu: Sổ tay xử lý nước, tập Nhà Xuất Xây dựng Hà Nội, 1999 12 Lê Xn Phương 1999 Giáo trình vi sinh vật cơng nghiệp Trường Đại học Kỹ thuật Đại học Đà Nẵng 13 Trần Cẩm Vân Giáo trình vi sinh vật học mơi trường NXB quốc gia Hà Nội 2001 14 Nguyễn Xuân Thành (Chủ biên) Giáo trình sinh học đất NXB Giáo dục 2007 15 Đặng Trung Thuận Địa Hóa Học Nhà Xuất quốc gia Hà Nội 2005 16 Trương Văn Lung Chuyên đề công nghệ sinh học Tủ sách Đại học Khoa học Huế 1995 17 Trần Thị Thanh Công nghệ vi sinh Nhà Xuất giáo dục 2007 18 Lương Đức Phẩm Công nghệ xử lý nước thải biện pháp sinh học Nhà Xuất Giáo dục 2007 19 Nguyễn Đức Lượng (Chủ biên), Nguyễn Thị Thùy Dương 2003 Công nghệ sinh học môi trường Tập Nhà Xuất Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh, 2001 20 Trương Văn Lung (Chủ biên) Công nghệ sinh học sản xuất đời sống Tài liệu lưu hành nội Huế, 2005 21 Lê Văn Khoa (Chủ biên), Nguyễn Xuân Quýnh, Nguyễn Quốc Việt Chỉ thị sinh học môi trường Nhà Xuất giáo dục 2007 22 Tiêu chuẩn nhà nước Việt Nam môi trường Chất lượng nước Tập Hà Nội, 1995 23 Bộ Khoa học Công nghệ Môi trường, Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng, 1995 Các Tiêu chuẩn Nhà nước Việt Nam Môi trường - Chất lượng nước 24 Nguyễn Đức Lượng (Chủ biên) Thí nghiệm Cơng nghệ sinh học - tập Nhà Xuất Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh, 2001 25 Nước uống TCVN 2652 - 78 ÷ TCVN 2681 - 78 Hà Nội 1980 26 Dự án thoát nước vệ sinh thành phố Đà lạt Quan trắc chất lượng nước Hà nội 2003 128 PHỤ LỤC Phụ lục Tiêu chuẩn chất lượng nước mặt-TCVN 5942-1995 STT Thông số Đơn vị Giá trị giới hạn A B 6-8,5 5,5-9