Luận văn thạc sĩ phân lập và tuyển chọn chủng pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng vibrio sp gây bệnh ở tôm nuôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN HUYỀN TRANG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG PSEUDOMONAS SP SINH HOẠT CHẤT KHÁNG VIBRIO SP GÂY BỆNH Ở TÔM NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG PSEUDOMONAS SP SINH HOẠT CHẤT KHÁNG VIBRIO SP GÂY BỆNH Ở TÔM NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN CHÍ THUẬN Học viên: NGUYỄN HUYỀN TRANG Hà Nội – 2014 LỜI CẢM ƠN Tơi xin tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Chí Thuận Trưởng phịng Cơng nghệ Phơi - Viện Cơng nghệ Sinh học tận tình hướng dẫn dìu dắt tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hoàng Uyên, người giúp đỡ tận tình bảo tơi q trình thực luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới phòng Đào tạo - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, trường Đại học Thái Nguyên lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ vật chất tinh thần để tơi hồn thành luận văn Một lần tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2014 Học viên Nguyễn Huyền Trang Bảng chữ viết tắt APW Alkaline Pepton Water bp Base pair CFU Colony-Forming Unit DNA Deoxyribonucleic acid IPTG isopropyl-β-D-thiogalactoside kb Kilobase pair LB Luria - Bertani NB Nutrient broth PCA phenazine - 1carboxylic PCN Pyocyanin PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid SAM S-adenosylmethionine TCA Trichloroacetic acid X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indodyl-β galactosidase Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm 1.1.3 Cấu trúc gen 1.1.4 Phương pháp xác định vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 10 1.1.4.1.Phương pháp phân lập vi sinh truyền thống 10 1.1.4.2 Phương pháp sinh học phân tử phân loại vi khuẩn 10 1.1.5 Ứng dụng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 11 1.2 Hoạt chất pyocyanin 12 1.2.1.Cấu trúc pyocyanin tham gia gen 12 1.2.2.Hoạt tính kháng khuẩn pyocyanin .13 1.2.3 Ứng dụng hoạt chất pyocyanin 14 1.3.Tổng quan Vibrio sp gây bệnh tôm nuôi 15 1.3.1.Đặc điểm phân loại chủng Vibrio sp gây bệnh tôm nuôi 15 1.3.2 Bệnh vi khuẩn Vibrio sp gây tôm 15 1.3.2.1 Lịch sử phát triển bệnh: .15 1.1.2.2 Đặc điểm dịch tễ 17 1.3.3 Các phương pháp phòng ngừa điều trị 18 1.3.2.1 Biện pháp phòng bệnh tổng hợp 18 1.3.2.2 Điều trị 19 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21 2.1 Vật liệu nghiên cứu 21 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.2 Thiết bị .21 2.1.3 Hóa chất .22 2.1.3.1 Hóa chất sử dụng cho vi sinh: 22 2.1.3.2 Hóa chất sử dụng sinh học phân tử: 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phương pháp vi sinh 25 2.2.1.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn môi trường King A 25 2.2.1.2 Phương pháp nhuộm tế bào quan sát hình thái vi khuẩn .26 2.2.1.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme vi khuẩn 26 2.2.1.4 Phương pháp lập kháng sinh đồ 27 2.2.1.5 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn: .27 2.2.1.6 Phương pháp tách chiết xác định sắc tố pyocyanin - PCN [32] .28 2.2.1.7 Phương pháp xác định ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh khối nồng độ hoạt chất vi khuẩn 28 2.2.1.8 Phương pháp xác định khả kháng Vibrio sp: .28 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 29 2.2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 29 2.2.2.2 Phương pháp PRC khuếch đại gen 30 2.2.2.3 Phương pháp điện di 32 2.2.2.4 Phương pháp làm sản phẩm PCR 33 2.2.2.5 Phương pháp tách dòng gen tái tổ hợp (Cloning) 34 2.2.2.6 Phương pháp giải trình tự gen .36 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Kết phân lập xác định P aeruginosa phương pháp vi sinh vật 38 3.1.1 Kết phân lập vi khuẩn P aeruginosa môi trường King A 38 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 3.1.2 Kết nhuộm Gram 39 3.1.3 Kết nghiên cứu hoạt tính enzyme 40 3.1.4 Kết thử hoạt tính kháng kháng sinh 41 3.2 Kết xác định P aeruginosa phương pháp sinh học phân tử 42 3.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số 42 3.2.2 Kết PCR gen đặc hiệu P aeruginosa (PA): 43 3.2.3 Kết PCR gen 16s rRNA 44 3.2.4 Kết tách dòng tái tổ hợp mang đoạn gen 16s rRNA 45 3.2.5 Kết giải trình tự gen 16s rRNA định tên vi khuẩn 47 3.3 Kết nghiên cứu khả sinh hoạt chất kháng Vibrio sp P.aeruginosa PS39 51 3.3.1 Kết xác định ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh khối vi khuẩn nồng độ hoạt chất 51 3.3.2 Kết xác định khả kháng Vibrio dịch nuôi vi khuẩn hoạt chất PCN .54 3.3.3.Xác định nồng độ hoạt chất PCN ức chế Vibrio sp 56 3.3.4 Kết xác định ảnh hưởng nồng độ hoạt chất PCN ức chế Vibrio in vitro 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 Phụ lục 74 Phụ lục 75 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, việc sử dụng kháng sinh nuôi trồng thủy sản nhằm phòng hạn chế bệnh nhiễm khuẩn ngày trở nên phổ biến Vì vậy, đề kháng kháng sinh vi sinh vật tăng lên nhiều, số kháng sinh đưa vào sử dụng để khắc phục vấn đề lại giới hạn Hiện tượng đa kháng thuốc kháng sinh mối lo khơng người ni mà cịn nhà quản lý sức khỏe cộng đồng khơng làm giảm hiệu điều trị mà cịn tiềm ẩn nhiều nguy sức khỏe người Mặt khác, quan ngại hạn chế việc sử dụng kháng sinh nuôi thủy sản nên nghiên cứu hướng quan tâm đến chất thay có nguồn gốc thiên nhiên, chất không gây đề kháng khuẩn tồn dư vật nuôi ảnh hưởng tới môi trường Pseudomonas sp vi khuẩn phổ biến tìm thấy đất, nước, hệ vi sinh vật da môi trường nhân tạo khắp giới Chúng vi sinh vật có giá trị thương mại công nghệ sinh học Trong chế phẩm sinh học, Pseudomonas sử dụng probiotic kiểm soát sinh học nấm gây bệnh vi khuẩn nông nghiệp, phẩy khuẩn nuôi trồng thủy sản Các vi khuẩn Pseudomonas sp có khả tiết nhiều loại sắc tố hợp chất có tính kháng khuẩn Trong đó, hợp chất phenazine Pseudomonas sp tiết môi trường hợp chất có phổ kháng khuẩn rộng Phenazine nhóm sắc tố Pseudomonas sp tiết bao gồm: pyocyanin PCN (5-N-methyl-1-hydroxyphenazine), phenazine-1-carboxylic (PCA) phenazine-1carboxamide Sắc tố pyocyanin từ Pseudomonas aeruginosa, chiết chloroform, phenazine có sắc tố màu xanh Nghiên cứu tách chiết, tính chất ứng dụng pyocyanin tiến hành nhiều phịng thí nghiệm giới: Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang Mĩ (Scott Angell-2006); Đức (Kasozi-2012); Iran (Jamileh Nowroozi-2012); Ấn Độ (Preetha -2010); Thái Lan (Pattamarat Rattanachuay-2010) Sắc tố xác định có phổ kháng khuẩn rộng [75], chống nấm [55], Vibrio sp gây bệnh nuôi trồng thủy sản [66] Phân lập điều tra cho thấy pyocyanin có tính kháng mạnh với vi khuẩn Vibrio sp V parahaemolyticus , V vulnificus , V alginolyticus , V fluvialis , V Proteolyticus, V harveyi ứng dụng cho chế phẩm sinh học nuôi trồng thủy sản Đề tài nghiên cứu: “Phân lập tuyển chọn chủng Pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng Vibrio sp gây bệnh tơm ni” thực nhằm mục đích phân lập chủng Pseudomonas sp có khả sinh hoạt chất kháng Vibrio gây bệnh tơm ni, góp phần điều trị bệnh giúp tăng suất tôm nuôi Việt Nam Nhiệm vụ đặt cho đề tài là: 1.Phân lập tuyển chọn chủng Pseudomonas sp có khả kháng lại vi khuẩn gây bệnh tôm nuôi Sàng lọc chủng Pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng khuẩn 3.Giải trình tự gen 16s rRNA, định danh vi khuẩn Luận văn thạc sỹ 36 Nguyễn Huyền Trang Gilardi G (1985) “Cultural and Biochemical Aspects for Identification of Glucose-Nonfermenting Gram-Negative Rods” Nonfermenting Gram-Negative Rods 1985 p.17-24 37 Gohain et al.(2006).”The purification, crystallization and preliminary structural characterization of FAD-dependent monooxygenase PhzS, a phenazinemodifying enzyme from Pseudomonas aeruginosa”.Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications (Impact Factor: 0.55) 11/2006; 62(Pt 10):989-92 38 Hassan H M and Fridovich I (1980) “Mechanism of the Antibiotic Action of Pyocyanine” Journal of Bacteriology, Jan 1980, 141(1): 156-163 39 Hassanein W.A., Awny N.M., El-Mougith A.A and Salah El-Dein S.H (2009) “Characterization and antagonistic activities of metabolite produced by Pseudomonas aeruginosa Sha8” Journal of Applied Sciences Research, 5:392– 403 40 Hassanein W.A., Awny, M., El-Mougith, A.A and Salah El-Dien, S.H (2009) “The Antagonistic Activities of Some Metabolites Produced by Pseudomonas aeruginosa Sha8” Journal of Applied Sciences Research, 5(4): 404-414 41 Hassett D.J (1996) “Anaerobic production of alginate by Pseudomonas aeruginosa: alginate restricts diffusion of oxygen” J Bacteriol 178 (24): 7322–5 42 Herbert R B., Holliman F.G and Sheridan J B (1974) Biosynthesis of iodinin: incorporationof D- [1-14C]-, D- [6-14C]- and D- [1,6,7-14C3] shikimic acid Tetrahedron Letters, 4201-4204 43 Herbert R B., Holliman F.G and Sheridan J B (1976) Biosynthesis of microbial phenazines :incorporation of shikimic acid TetrahedronLetters, 639642 66 Luận văn thạc sỹ 44 Nguyễn Huyền Trang Ho Sui S.J., Lo R., Fernandes A.R., Caulfield M.D.G., Lerman J.A., Xie L., Bourne P.E., Baillie D.L., Brinkman F.S.L (2012) “Raloxifene attenuates Pseudomonas aeruginosaPyocyanin production and virulence” Int J Antimicrob Agents 40:246–251 45 Hollstein U., Larry G Marshall (1972) “Biosynthesis of phenazines” J Org Chem., 1972, 37 (22), pp 3510–3514 46 Hollstein U and McCamey D A (1973) “Byosynthesis of phenazine II Incorporation of [6 - 14+ C]-D-Shikimic acid into phenazine-1-carbocylic acid and iodinin”, J Org Chem., 38: 3415-3417 47 Iglewski BH (1996) Pseudomonas In: Baron's Medical Microbiology (Baron S et al., eds.) (ấn 4) Univ of Texas Medical Branch 48 Irasema E Luis-Villasor, Ángel I Campa-Córdova, Nolberta Huerta- Aldaz, Antonio Luna-González, José M Mazón-Suástegui1 and Francisco FloresHiguera ( 2013) “Effect of beneficial bacteria on larval culture of Pacific whiteleg shrimp” Litopenaeus vannamei African Journal of Microbiology Research Vol 7(27), pp 3471-3478, July, 2013 49 Jamileh Nowroozi (2012) “Pyocyanine Biosynthetic Genes in Clinical and Environmental Isolates of Pseudomonas aeruginosa and Detection of Pyocyanine’s Antimicrobial Effects with or without Colloidal Silver Nanoparticles” Cell Journal (Yakhteh), Vol 14, No 1, 7-18 50 Jesus G.M., Silvia G.A., Ana I.A and Ftancisco R.V (1999) “Use of 16s - 23s ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity” Journal Microbiol Methods 36: 55 - 64 51 Johnson, G., and Olsen, R (1997) “Multiple Pathways for Toluene Degradation in Burkholderia sp Strain JS150.” Applied and Environmental Microbiology, Volume 63 p 4047-4052 67 Luận văn thạc sỹ 52 Nguyễn Huyền Trang Jyoti Joshia, Jiraporn Srisalaa, Viet Hong Truong, Tung Chend, Bunlung Nuangsaenge, Orasa Suthienkulf, Chu Fang Lod, Timothy W Flegela, Kallaya Sritunyalucksanaa, Siripong Thitamadeea, (2014) “Variation in Vibrio parahaemolyticus isolates from a single Thai shrimp farm experiencing an outbreak of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND)” Aquaculture 53 Karpagam S., Sudhakar T., Lakshmipathy M (2013) “Microbicidal response of Pyocyanin produced by P aeruginosa toward clinical isolates of fungi” Int J Pharm Pharm Sci 5:870–873 54 Kasozi D.M., Gromer S., Adler H., Zocher K., Rahlfs S., Wittlin S., Fritz- Wolf K., Schirmer R.H., Becker K (2011) “The bacterial redox signaller Pyocyanin as an antiplasmodial agent: comparisons with its thioanalog methylene blue” Redox Rep 2011;16(4):154-65 55 Kerr J.R., Taylor G.W., Rutman A., Hoiby N., Cole P.J & Wilson R (1999) “PseudomonasaeruginosaPyocyanin and 1-hydroxyphenazine inhibit fungal growth” Journal of Clinical Pathology, 52: 385-387 56 Khamdan K., Suprapta D.N (2011) “Induction of plant resistance against soyabean stunt virus using some formulations of Pseudomonas aeruginosa” J ASSAAS 17:98–105 57 Khare E., Arora N.K (2011) “Dual activity of Pyocyanin from Pseudomonas aeruginosa—antibiotic against phytopathogen and signal molecule for biofilm development by rhizobia” Can J Microbiol 57:708–713 58 King E.O., Ward M.K., Raney D.E (1954) “Two simple media for the demonstration of Pyocyanin and fluorescin.” J Lab Clin Med 44 (2): 301–7 59 Lederberg, Joshua et al (2000) “Pseudomonas Encyclopedia of Microbiology” Second Edition, Volume 3, San Diego, 2000 p 876-891 68 Luận văn thạc sỹ 60 Nguyễn Huyền Trang Lightner D.V., Redman R.M., Pantoja C.R., Noble B.L., Tran L.H (2012) “Early mortality syndrome affects shrimp in Asia” Glob Aquacult Advocate Jan/Feb 2012: 40 Editorial responsibility: Grant Stentiford, Weymouth, UK 61 Lundgren B.R., Thornton W., Dornan M.H., Villegas-Peñaranda L.R., Boddy C.N., Nomura C.T (2013) “Gene PA2449 is essential for glycine metabolism and Pyocyanin biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa PAO1” J Bacteriol 195:2087–3000 62 Millican R C (1962) “Biosynthesis of Pyocyanine” Can J Microbiol 9: 809-819 63 Mohamed M Gharieb, Mostafa M.El-Sheekh, Sabha M.El-Sabbagh, Walaa T.Hamza (2013) “Efficacy Of Pyocyanin Produced By Pseudomonas aeruginosa As A Topical Treatment Of Infected Skin Of Rabbits” Biotechnology Vol 7, Issue 64 National Center for Biotechnology Information site (NCBI) 65 P aeruginosa PA14 Genomic Sequencing Project 66 Pai S.S., Anas A.A., Jayaprakash N.S., Priyaja P., Sreelakshmi B., Philip R.,Mohandas A & Bright Singh I.S (2010) “Penaeus monodon larvae can be protected from Vibrioharveyi infection by preemptive treatment of rearing system with antagonistic or nonantagonistic bacterial probiotics” Aquaculture Research 41, p 847-860 67 Parsons J.F., Greenhagen B.T., Shi K., Calabrese K., Robinson H., Ladner J.E (2007) “Structural and functional analysis of the Pyocyanin biosynthetic protein Phz M from Pseudomonas aeruginosa” Biochemistry 46:1821–1828 68 Pattamarat Rattanachuay (2010) “Inhibition of shrimp pathogenic Vibrios by extracellular compounds from a proteolytic bacterium Pseudomonas sp W3” Journal of Biotechnology Vol.13 No.1, Issue of January 15 69 Luận văn thạc sỹ 69 Nguyễn Huyền Trang Pattamarat Rattanachuay, Duangporn Kantachote,Manee Tantirungkij (2010) “AntiVibrio compounds produced by Pseudomonas sp W3:characterisation and assessment of their safety to shrimps” World J Microbiol Biotechnol, DOI 10.1007/s11274-010-0529 70 Pieper D., Stadler-Fritzche K., Scholomann M., and Knackmuss H (1992) “Metabolism of 2-Chloro-4-Methylphenoxyacetate by Alcaligenes eutrophus JMP 134: Implications for the Degradation of Chloro- and Methyl-Substituted Aromatics via ortho Cleavage” Pseudomonas Molecular Biology and Biotechnology 1992 p 268-272 71 Pierson L.S., Pierson E.A (2010) “Metabolism and function of phenazines in bacteria: impacts on the behavior of the bacteria in the environment and biotechnological process” Appl Micorbiol Biotechnol 18:1659–1670 72 Porter R.C (2009) Studies in pigment production by Pseudomonas aeruginosa M.S thesis, Texas Tech University, TX, 59 p 73 Prabhakaran Priyajal (2012) Pyocyanin (5-methyl-1-hydroxyphenazine) Produced by Pseudomonas aeruginosa as Antagonist to Vibrios in Aquaculture: Overexpression, Downstream Process and Toxicity National Centre for aquatic animal health Cochin University of science and technology Kochi 682016, Kerala, India Thesis Doctor of Philosophyin marine biotechnology Chape Toxicity of Pyocyanin on various biological systems, p 94-127 74 Prabhakaran Priyajal (2014) “Antogonistic effect of Pseudomonas aeruginosa isolates from various ecological niches on Vibrio species pathogenic to crustaceans” Journal of Coastal Life Medicine 2014; 2(1): 76-84 75 Preetha R., Jose S., Prathapan S., Vijayan K.K., Jayaprakash N.S., Philip R and Bright Singh I.S (2010) “An inhibitory compound produced by Pseudomonas with effectiveness on Vibrio harveyi” Aquaculture Research 41, 1452-1461 70 Luận văn thạc sỹ 76 Nguyễn Huyền Trang Priest F.G and Austin B (1993) “Modern bacterial taxonomy”, Chapman and Hall, pp 50 - 94 77 Pseudomonas Genome Database 78 Rabaey K., and Verstraete W (2005) “Microbial Fuel Cells: novel biotechnology for enegy generation” TrendS in Biotechnology, Volume 23 79 Rojo F., and Dinamarca A (2004) Catabolite Repression and Physiological Control Pseudomonas 2004 p 365-366 80 Ryan K.J., Ray C.G (editors) (2004) Sherris Medical Microbiology (ấn 4) McGraw Hill 81 Saha S., Thavasi R., Jayalakshmi S (2008) “Phenazine pigments from Pseudomonas aeruginosa and their application as antibacterial agent and food colourants” Res J Microbiol 3:122–128 82 Saosoong K., Wongphathanakul W., Paorsiri C., Ruangviriyachi C (2009) “Isolation and analysis of antibacterial substance produced from Pseudomonas aeruginosa TISTR 781” KKU Sci J 37:163-172 83 Scott Angell, Bennie J Bench, Howard Williams (2006) “Pyocyanin Isolated from a Marine Microbial Population: Synergistic Production between Two Distinct Bacterial Species and Mode of Action” Chemistry & Biology 13, 1349– 1359, 84 Sheeba J (2007) “Isolation, pigment production, antifungal activity and antibiogram pattern of Pseudomonas aeruginosa” - a study M.Phil., Thesis, Bharathidasan University, 39 p 85 Spilker T et al (2004) “PCR-Based Assay for Differentiation of Pseudomonas aeruginosa from Other Pseudomonas species Recovered from Cystic Fibrosis Patients” J.Clin Mcrobiol Vol 42, No 5; 2074–2079 71 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 86 Stanisich V., and Richmond M (1075) “Gene Transfer in the Genus Pseudomonas” Genetics and Biochemistry of Pseudomonas 1975 p 170-175 87 Stover K., Pham Q., Erwin L., Mizoguchi D., Warrener P., Hickey J., Brinkman L., Hufnagle O., Kowalid D., M Lagrou, R.L Garber, L Goltry, E Tolentino, S Westbrock-Wadman, Y Yuan, L.L Brody, S.N Coulter, Folger,R., Kas A., Larbig K., Lim R., Smith K., Spencer D., Wong K.,Wu Z., Paulsenk J., Reizer Z., Saier H., Hancock R., Lory S., and Olson V (2000) “Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PA01, an opportunistic pathogen” Nature 2000 Volume 406 p 961-964 88 Sudhakar T., Karpagam S., Shiyama S (2013) “Antifungal efficacy of Pyocyanin produced from bioindicators of nosocomial hazards” Int J ChemTech Res 5:1101–1106 89 Sweden E.G (2010) Study the effect of “Antibiotics on Pyocyanin production from Pseudomonas aeruginosa and Pyocyanin as antibiotic against different pathogenic bacteria” J Univ Anbar Pure Sci 4:15–18 90 Tom Defoirdt, Peter Bossier, Patrick Sorgeloos and Willy Verstraete (2004) “The impact of mutation in quorum sensing systems of Aeromonas hydrophila, Vibrioanguillarum and Vibrioharveyi on their virulence towards gnotobiotically culture Artemia franciscana” Ghent University, Belgium 91 Valls M., Cases I., and Lorenzo V (2004) “Transcription Mediated by rpoN- Dependent Promoters” Pseudomonas 2004 p 398-302 92 Waksman S.A., Woodruff H.B (1940) “The soil as a source of microorganisms antagonistic to disease producing bacteria” J Bacteriol 40:581– 600 93 Wiehlmann L., Wagner G., Cramer N., Siebert B., GudowiusP., Morales G., Ko T., Delden C., Weinel C., Slickers P., and Tu B (2007) “Population structure 72 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang of Pseudomonas aeruginosa ” Preceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2007 Volume 104 p 8101–8106 94 Williams H.D., Zlosnik J.E., Ryall B (2007) “Oxygen, cyanide and energy generation in the cystic fibrosis pathogen Pseudomonas aeruginosa” Adv Microb Physiol 52: 1–71 doi:10.1016/S0065-2911(06)52001-6 95 Worlitzsch D., Tarran R., Ulrich M., et al (2002) “Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonasinfections of cystic fibrosis patients” J Clin Invest 109 (3): 317–25 doi:10.1172/JCI13870 96 Young C (1947) “Pigment production and antibiotic activity in cultures of Pseudomonas aeruginosa” J Bact 54, 109 Tài liệu Web 97 http://aquanetviet.org/post/1885627/t-ng-quan-v-s-d-ng-ch-ph-m-sinh-h-c- probiotics-ki-m-so-t-d-ch-b 98 http://www.framelco.com/eng/products/feed-additives-monoglycerides The Netherlands 1-Monoglycerides May Prevent EMS June 21, 2013 99 http://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_aeruginosa#cite_ref-7 73 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang Phụ lục LOCUS DEFINITION sequence ACCESSION VERSION SOURCE ORGANISM KJ579 Pseud KJ579953 KJ579953.1 GI: Pseudomonas aer Pseudomonas aer Bacteria; Proteob Pseudomonadacea (bas Thuan,N.C., Uye Pseudomonas aer Unpublished (bas Thuan,N.C., Uye Direct Submissi Submitted (14-M Biotechnology, REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL FEATURES source rRNA ORIGIN 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 agagtttgat ggatgaaggg gcctggtagt gaaagtgggg ggtggggtaa cactggaact atgggcgaaa cactttaagt gaataagcac atcggaatta cgggctcaac gaatttcctg accacctgga accctggtag tggcgcagct aatgaattga aagaacctta gagctcagac gtcccgtaac gagactgccg cggccagggc gagctaatcc gtcggaatcg acacaccgcc cctggctcag agcttgctcc gggggataac gatcttcgga aggcctacca gagacacggt gcctgatcca tgggaggaag cggctaactt ctgggcgtaa ctgggaactg tgtagcggtg ctgatactga tccacgccgt aacgcgataa cgggggcccg cctggccttg acaggtgctg gagcgcaacc gtgacaaacc tacacacgtg cataaaaccg ctagtaatcg cgtcacacca attgaacgct tggattcagc gtccggaaac cctcacgcta aggcgacgat ccagactcct gccatgccgc ggcagtaagt cgtgccagca agcgcgcgta catccaaaac aaatgcgtag cactgaggtg aaacgatgtc gtcgaccgcc cacaagcggt acatgctgag catggctgtc cttgtcctta ggaggaaggt ctacaatggt atcgtagtcc tgaatcagaa tgggagtggg ggcggcaggc ggcggacggg gggcgctaat tcagatgagc ccgtaactgg acggggggca gtgtgtgaag taataccttg gccgcggtaa ggtggttcag tactgagcta atataggaag cgaaagcgtg gactagccgt tggggagtac ggagcatgtg aactttccag gtcagctcgt gttaccagca ggggatgacg cggtacaaag ggatcgcagt tgtcacggtg ttgctccaga ctaacacatg tgagtaatgc accgcatacg ctaggtcgga tctgagagga gcagtgggga aaggtcttcg ctgttttgac tacgaagggt caagttggat gagtacggta gaacaccagt gggagcaaac tgggatcctt ggccgcaagg gtttaattcg agatggattg gccgtgagat cctcgggtgg tcaagtcatc ggttgccaag ctgcaactcg aatacgttcc agtagctagt caagtcgagc ctaggaatct tcctgaggga ttagctagtt tgatcagtca atattggaca gattgtaaag gttaccaaca gcaagcgtta gtgaaatccc gagggtggtg ggcgaaggcg aggattagat gagatcttag ttaaaactca aagcaacgcg gtgccttcgg gttgggttaa gcactctaag atggccctta ccgcgaggtg actgcgtgaa cgggccttgt ctaaccgcaa 1441 gggggacggt taccacggag tgattcatga ctggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta 1501 ggggaacctg cggctggatc acctcctta 74 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang Phụ lục So sánh trình tự gen 16s rRNA chủng PS39 với trình tự gen chủng vi khuẩn lấy ngân hàng gen: * KJ579953 : AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGAT AF125317 : JN003625 : HQ288928 : JF708186 : GQ180117 : GU566322 : EF432565 : JQ249910 : - NR_074828 : 100 KJ579953 : GGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATA AF125317 : JN003625 : HQ288928 : JF708186 : GQ180117 : GU566322 : EF432565 : JQ249910 : NR_074828 : 200 KJ579953 : TTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTAC AF125317 : JN003625 : HQ288928 : JF708186 : GQ180117 : GU566322 : EF432565 : JQ249910 : NR_074828 : 300 KJ579953 : GATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGGGGCAGCAGTGGGGAATATT AF125317 : JN003625 : HQ288928 : JF708186 : GQ180117 : GU566322 : EF432565 : JQ249910 : NR_074828 : 75 Luận văn thạc sỹ * KJ579953 : GCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATT AF125317 JN003625 HQ288928 JF708186 GQ180117 GU566322 EF432565 JQ249910 NR_074828 KJ579953 : AGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAG AF125317 JN003625 HQ288928 JF708186 GQ180117 GU566322 EF432565 JQ249910 NR_074828 KJ579953 : AGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCA AF125317 JN003625 HQ288928 JF708186 GQ180117 GU566322 EF432565 JQ249910 NR_074828 KJ579953 : GAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACA AF125317 JN003625 HQ288928 JF708186 GQ180117 GU566322 EF432565 JQ249910 NR_074828 780 KJ579953 : AGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAA AF125317 JN003625 HQ288928 JF708186 GQ180117 GU566322 EF432565 JQ249910 NR_074828 Luận văn thạc sỹ 880 KJ579953 : GGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTC AF125317 : JN003625 : HQ288928 : JF708186 : GQ180117 : GU566322 : EF432565 : JQ249910 : NR_074828 : KJ579953 : CCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTT AF125317 : JN003625 : HQ288928 : JF708186 : GQ180117 : GU566322 : EF432565 : JQ249910 : NR_074828 : KJ579953 : GATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAG AF125317 : JN003625 : HQ288928 : JF708186 : GQ180117 : GU566322 : EF432565 : JQ249910 : NR_074828 : KJ579953 : GAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATC AF125317 : JN003625 : HQ288928 : JF708186 : GQ180117 : GU566322 : EF432565 : JQ249910 : NR_074828 : KJ579953 : AGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAG AF125317 : JN003625 : HQ288928 : JF708186 : GQ180117 : GU566322 : EF432565 : JQ249910 : NR_074828 : * * 7 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 60 KJ579953 : TGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGT AF125317 : JN003625 : HQ288928 : JF708186 : GQ180117 : GU566322 : EF432565 : JQ249910 : NR_074828 : KJ579953 : CGGAGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACC-TGCGGCTGGA AF125317 : JN003625 : HQ288928 : JF708186 : GQ180117 : GU566322 : EF432565 : JQ249910 : NR_074828 : 1460 78 ... phẩm sinh học nuôi trồng thủy sản Đề tài nghiên cứu: ? ?Phân lập tuyển chọn chủng Pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng Vibrio sp gây bệnh tơm ni” thực nhằm mục đích phân lập chủng Pseudomonas sp có... DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG PSEUDOMONAS SP SINH HOẠT CHẤT KHÁNG VIBRIO SP GÂY BỆNH... quan Vibrio sp gây bệnh tôm nuôi 15 1.3.1.Đặc điểm phân loại chủng Vibrio sp gây bệnh tôm nuôi 15 1.3.2 Bệnh vi khuẩn Vibrio sp gây tôm 15 1.3.2.1 Lịch sử phát triển bệnh: