Luận văn thạc sĩ xác định đồng thời nisin a và nisin z trong sản phẩm dinh dưỡng bằng sắc kí lỏng khối phổ​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Trần Thị Hƣờng XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI NISIN A VÀ NISIN Z TRONG SẢN PHẨM DINH DƢỠNG BẰNG SẮC KÍ LỎNG KHỐI PHỔ Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440112.03 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo PGS.TS Nguyễn Thị Ánh Hƣờng Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Lời cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cô PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia – Bộ Y tế, cô PGS.TS Nguyễn Thị Ánh Hƣờng, Trường Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu, tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài viết luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy giáo giảng dạy khoa Hố học, đặc biệt thầy cô môn Hố Phân Tích, cho em kiến thức q giá, tạo điều kiện cho em học tập nghiên cứu môi trường đại Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Trung tâm kiểm soát Bệnh tật tỉnh Nam Định tạo điều kiện thuận lợi để học tập hồn thành đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới TS.Vũ Thị Trang ThS Lê Thị Thúy đồng nghiệp khoa Dinh dưỡng phụ gia thực phẩm – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, đồng nghiệp labo Hóa – Trung tâm kiểm sốt Bệnh tật tỉnh Nam Định giúp đỡ nhiều q trình làm thực nghiệm Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln động viên, chia sẻ khó khăn MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG : TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung chất bảo quản .3 1.1.1 Định nghĩa chất bảo quản 1.1.2 Phân loại chất bảo quản 1.2 Giới thiệu chất bảo quản nhóm Nisin (E234) .3 1.2.1 Lịch sử phát 1.2.2 Giới thiệu Nisin 1.2.3 Tính chất Nisin .8 1.2.4 Phân loại Nisin 1.2.5 Cơ chế hoạt động Nisin 10 1.2.6 Độc tính ứng dụng nisin bảo quản thực phẩm 12 1.2.7 Giới hạn cho phép Nisin thực phẩm 14 1.3 Các phƣơng pháp xác định Nisin A Nisin Z 16 1.3.1 Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 16 1.3.2 Phương pháp sắc kí lỏng kết nối với detector UV 18 1.3.3 Phương pháp điện di mao quản 19 1.3.4 Phương pháp sắc kí lỏng với detector khối phổ LC – MS/MS 20 CHƢƠNG : NỘI DUNG VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 26 2.2 Nội dung nghiên cứu 26 2.2.1 Khảo sát điều kiện phân tích thiết bị LC-MS/MS 26 2.2.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 26 2.2.3 Thẩm định phương pháp 27 2.2.4 Phân tích hàm lượng Nisin A Nisin Z số mẫu sản phẩm dinh dưỡng 27 2.3 Thiết bị, dụng cụ 27 2.3.1 Thiết bị 27 2.3.2 Dụng cụ 28 2.4 Hóa chất, chất chuẩn 29 2.4.1 Chất chuẩn 29 2.4.2 Các loại hóa chất, dung mơi khác 30 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 30 2.5.2 Phương pháp xử lý mẫu 3031 2.5.3 Phương pháp phân tích 32 2.5.4 Phương pháp xử lý số liệu 34 2.5.5 Phương pháp thẩm định: theo quy định ISO 17025, AOAC .34 2.5.6 Phương pháp định lượng 3738 CHƢƠNG : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Tối ƣu hóa điều kiện phân tích Nisin A Nisin Z thiết bị LC-MS/MS 39 3.1.1 Tối ưu thông số detector (MS/MS) 39 3.1.2 Tối ưu hóa điều kiện sắc kí lỏng 40 3.2 Khảo sát trình xử lý mẫu 46 3.2.1 Khảo sát nồng độ dung dịch amoni acetate - NaCl dung môi chiết 47 3.2.2 Lựa chọn pH dung dịch đệm 48 3.2.3 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết 49 3.2.4 Khảo sát thời gian rung siêu âm 50 3.2.5 Khảo sát số lần chiết mẫu 51 3.2.6 Tối ưu hóa quy trình làm mẫu 52 3.2.7 Khảo sát tốc độ rửa giải qua cột chiết pha rắn 53 3.2.8 Khảo sát thể tích dung mơi rửa giải qua cột chiết pha rắn 54 3.3 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 56 3.3.1 Độ đặc hiệu phương pháp 56 3.3.2 Xây dựng đường chuẩn 5758 3.3.3 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp 59 3.3.4 Độ lặp lại 5960 3.3.5 Độ (độ thu hồi) 61 3.4 Phân tích mẫu thực tế 6364 KẾT LUẬN 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 TIẾNG VIỆT 67 TIẾNG ANH 6768 PHỤ LỤC 74 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Association of Official Analytical Chemmist Tiếng Việt Hiệp hội nhà phân tích thức ACN Acetonitrile Acetonitril CE Collision energy Năng lượng va chạm ESI Eelectrospray ionization Chế độ ion hóa phun điện tử IP Identification point Điểm nhận dạng IPA Isopropanol Isopropanol IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry Liên minh quốc tế hóa học ứng dụng LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantitative Giới hạn định lượng MRL Maximum Residue Limit Giới hạn dư lượng tối đa MeOH Methanol Metanol UHPLC Ultra high performance liquid chromatography Sắc ký lỏng siêu hiệu cao SD Standard deviation Độ lệch chuẩn RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối TFA Acid Triflouroacetic Acid Triflouroacetic UHPLC-MS/MS Ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry Sắc ký lỏng siêu hiệu kết nối khối phổ hai lần AOAC DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu tạo chung Nisin .5 Hình 1.2 Cấu trúc phân tử Nisin A Hình 1.3 Cấu trúc phân tử Nisin Z Hình 1.4 Cơ chế hoạt động Nisin lên tế bào chất 12 Hình 2.1 Hệ thống thiết bị UPLC – MS/MS 28 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến để xác định Nisin A Nisin Z .32 Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ acid formic 43 Hình 3.2 Sắc đồ chương trình gradient 45 Hình 3.3 Sắc đồ chương trình gradient 45 Hình 3.4 Sắc đồ chương trình gradient 45 Hình 3.5 Đồ thị ảnh hưởng nồng độ dung dịch chiết mẫu 47 Hình 3.6 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng pH dung dịch đệm 48 Hình 3.7 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung dịch đệm MeOH .4950 Hình 3.8 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết 5051 Hình 3.9 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng số lần chiết 5152 Hình 3.10 Ảnh hưởng quy trình làm 5253 Hình 3.11 Ảnh hưởng tốc độ rửa giải 5354 Hình 3.12 Đồ thị khảo sát thể tích dung dịch rửa giải 5455 Hình 3.13 Sơ đồ quy trình tối ưu phân tích Nisin 5556 Hình 3.14 Phổ khối Nisin A Nisin Z mẫu trắng 5657 Hình 3.15 Phổ khối Nisin A Nisin Z mẫu chuẩn 5657 Hình 3.16 Phổ khối Nisin A Nisin Z mẫu trắng thêm chuẩn .5657 Hình 3.17 Đường chuẩn Nisin A 58 Hình 3.18 Đường chuẩn Nisin Z 5859 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Giới hạn tối đa cho phép Nisin thực phẩm 15 Bảng 1.2 Bảng tóm tắt số nghiên cứu xác định Nisin A Nisin Z phương pháp khác 23 Bảng 2.1 Yêu cầu số điểm IP đạt kỹ thuật khối phổ khác 35 Bảng 3.1 Các thơng số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh 40 Bảng 3.2 Chương trình gradient lựa chọn 42 Bảng 3.3 Chương trình rửa giải gradient 44 Bảng 3.4 Điều kiện tách, định lượng Nisin A Nisin Z thiết bị LC-MS/MS 45 Bảng 3.5 Số điểm IP Nisin A Nisin Z 5657 Bảng 3.6 Phương trình đường chuẩn Nisin A Nisin Z 5758 Bảng 3.7 Giới hạn phát giới hạn định lượng Nisin A Nisin Z 59 Bảng 3.8 Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp 60 Bảng 3.9 Độ thu hồi Nisin A mẫu khác 61 Bảng 3.10 Độ thu hồi phương pháp với Nisin Z mẫu khác 62 Bảng 3.11 Kết phân tích 64 MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm thu hút quan tâm toàn xã hội, quốc gia giới Cùng với phát triển khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật mới, đại áp dụng để tạo sản phẩm với chất lượng đáp ứng nhu cầu ngày cao người tiêu dùng Tuy nhiên để tạo nhiều sản phẩm phù hợp với sở thích vị người tiêu dùng mà giữ chất lượng toàn vẹn thực phẩm sử dụng, trình chế biến, nhà sản xuất sử dụng nhóm chất bảo quản để tăng giá trị thương phẩm kéo dài thời gian sử dụng thực phẩm Trên thị trường nay, có nhiều loại chất bảo quản dùng để kéo dài thời gian sử dụng thực phẩm, đa số chất tổng hợp nhân tạo gây nhiều tác dụng phụ khơng mong muốn khó bị phân huỷ, để lại dư lượng thực phẩm Gây ngộ độc cấp tính liều lượng dùng giới hạn cho phép, gây ngộ độc mãn tính dùng với thời gian kéo dài, liên tục, nguy gây hình thành khối u, đột biến gen… [21, 22, 62] Do đó, nhà nghiên cứu nhà sản xuất ngày có xu hướng sử dụng chất bảo quản có nguồn gốc sinh học, tự nhiên để dần thay chất bảo quản có nguồn gốc hóa học, mà đáp ứng nhu cầu tiêu dùng loại thực phẩm an toàn, đảm bảo chất lượng, kéo dài thời gian sử dụng Việc sử dụng chất kháng khuẩn có nguồn gốc sinh học bacteriocin, đặc biệt Nisin A Nisin Z bảo quản, chế biến thực phẩm quan tâm nhiều Ngoài khắc phục nhược điểm phương pháp sử dụng hố chất, nhiệt độ, chiếu xạ, Nisin cịn có nhiều ưu điểm khác phạm vi ứng dụng rộng, giảm thời gian nhiệt độ trùng sản phẩm, đảm bảo chất lượng, giá trị dinh dưỡng, cảm quan vị sản phẩm Mặc dù nhóm chất bảo quản Nisin coi an toàn sức khỏe người không gây ảnh hưởng đến môi trường, cần tuân thủ theo quy định khác quốc gia mức cho phép Nisin thực phẩm Hiện giới nước có số nghiên cứu công bố phương pháp xác định riêng rẽ đồng thời Nisin A Nisin Z bao gồm: phương pháp sinh học [48] [63], sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với detector UV-Vis [41], điện di mao quản (CE) [58] [59], sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) [3] [25] [38] [57] Tuy nhiên, phương pháp HPLC, CE hay sinh học thường phức tạp xác ảnh hưởng mẫu kích thước lớn phân tử Nisin Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm phân tích nhanh, tiết kiệm thời gian dung môi, độ nhạy cao nhận diện đồng thời hợp chất có tính chất cấu trúc tương đồng nên lựa chọn để xác định đồng thời Nisin A Nisin Z nghiên cứu Trên sở đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xác định đồng thời hàm lượng Nisin A Nisin Z sản phẩm dinh dưỡng sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC – MS/MS)” với mục tiêu sau:  Xây dựng phương pháp xác định đồng thời Nisin A Nisin Z sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC – MS/MS)  Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng Nisin A Nisin Z số sản phẩm dinh dưỡng 59 Sonomoto, K., et al (2000), ''Biosynthetic production of nisin Z by immobilized Lactococcus lactis IO-1'', Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 10(1-3), p.325-334 60 Stanley, B., et al (2009), ''Separation and determination of closely related lantibiotics by micellar electrokinetic chromatography'', Journal of separation science, 32(17), p.2993-3000 61 Suárez, A.M., et al (1996), ''Development of monoclonal antibodies to the lantibiotic nisin A'', Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44(9), p.2936-2940 62 TODD, E.C (1996), ''Worldwide surveillance of foodborne disease: the need to improve'', Journal of food protection, 59(1), p.82-92 63 Tramer, J and G Fowler (1964), ''Estimation of nisin in foods'', Journal of the Science of Food and Agriculture, 15(8), p.522-528 64 Twomey, D., et al (2002), ''Lantibiotics produced by lactic acid bacteria: structure, function and applications'', Antonie Van Leeuwenhoek, 82(1-4), p.165-185 65 Vandenbergh, P.A (1993), ''Lactic acid bacteria, their metabolic products and interference with microbial growth'', FEMS Microbiology Reviews, 12(1-3), p.221237 66 Wirawan, R.E., et al (2006), ''Molecular and genetic characterization of a novel nisin variant produced by Streptococcus uberis'', Applied and Environmental Microbiology, 72(2), p.1148-1156 67 Wolf, C and W Gibbons (1996), ''Improved method for quantification of the bacteriocin nisin'', Journal of applied bacteriology, 80(4), p.453-457 68 Zendo, T., et al (2003), ''Identification of the lantibiotic nisin Q, a new natural nisin variant produced by Lactococcus lactis 61-14 isolated from a river in Japan'', Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 67(7), p.1616-1619 73 PHỤ LỤC Phụ lục A: Quy định AOAC độ lặp lại độ thu hồi Phụ lục A1 Độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác (theo AOAC) Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%) 0,01 10 -4 100 ppm 5,3 0,001 10 -5 10 ppm 7,3 0,0001 10 -6 ppm 11 0,00001 10 -7 100 ppb 15 0,000001 10 -8 10 ppb 21 0,0000001 10 -9 1ppb 30 Phụ lục A2 Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác (theo AOAC) Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi [%] 0,01 10 -4 100 ppm 90 - 107 0,001 10 -5 10 ppm 80 - 110 0,0001 10 -6 ppm 80 - 110 0,00001 10 -7 100 ppb 80 - 110 0,000001 10 -8 10 ppb 60 - 115 0,0000001 10 -9 1ppb 40 - 120 74 Phụ lục B: Sắc đồ Nisin A Nisin Z Phụ lục Sắc đồ chuẩn Nisin A Nisin Z Hình P.1.1 Sắc đồ chuẩn Nisin A Hình P.1.2 Sắc đồ chuẩn Nisin Z 75 Phụ lục 2: Sắc đồ khảo sát thành phần acid formic pha động Hình P2.1 Sắc đồ Nisin A, Z acid formic 0% Hình P2.2 Sắc đồ Nisin A, Z acid formic 0,05% Hình P2.3 Sắc đồ Nisin A, Z acid formic 0,1% Hình P2.4 Sắc đồ Nisin A, Z acid formic 0,2% 76 Hình P2.5 Sắc đồ Nisin A, Z acid formic 0,3% Phụ lục 3: Sắc đồ khảo sát nồng độ dung dịch đệm Hình P 3.1 Sắc đồ Nisin A, Z nồng độ đệm CH3COONH4 – NaCl: 0,05 – 0,5 M Hình P 3.2 Sắc đồ Nisin A, Z nồng độ đệm CH3COONH4 – NaCl: 0,1 – M Hình P 3.3 Sắc đồ Nisin A, Z nồng độ đệm CH3COONH4 – NaCl: 0,2 – M 77 Hình P 3.4 Sắc đồ Nisin A, Z nồng độ đệm CH3COONH4 – NaCl: 0,4 – 4M Phụ lục 4: Sắc đồ khảo sát pH dung dịch đệm Hình P 4.1 Sắc đồ Nisin A, Z pH = 2,0 Hình P 4.2 Sắc đồ Nisin A, Z pH = 2,5 Hình P 4.3 Sắc đồ Nisin A, Z pH = 3,0 78 Hình P 4.4 Sắc đồ Nisin A, Z pH = 4,0 Hình P 4.5 Sắc đồ Nisin A, Z pH = 5,0 Hình P 4.6 Sắc đồ Nisin A, Z pH = 6,6 Phụ lục 5: Sắc đồ khảo sát tỉ lệ dung mơi chiết Hình P 5.1 Sắc đồ Nisin A, Z với tỷ lệ dung mơi chiết 2/1 79 Hình P 5.2 Sắc đồ Nisin A, Z với tỷ lệ dung mơi chiết 1/1 Hình P 5.3 Sắc đồ Nisin A, Z với tỷ lệ dung môi chiết 1/2 Phụ lục 6: Sắc đồ khảo sát số lần chiết Hình P 6.1 Sắc đồ Nisin A, Z khảo sát với lần chiết Hình P 6.2 Sắc đồ Nisin A, Z khảo sát với lần chiết 80 Hình P 6.3 Sắc đồ Nisin A, Z khảo sát với lần chiết Phụ lục : Sắc đồ khảo sát quy trình làm Hình P 7.1 Sắc đồ Nisin A, Z với quy trình Hình P 7.2 Sắc đồ Nisin A, Z với quy trình 81 Phụ lục : Sắc đồ khảo sát tốc độ rửa giải Hình P 8.1 Sắc đồ Nisin A, Z 6ml Hình P 8.2 Sắc đồ Nisin A, Z 4ml Hình P 8.3 Sắc đồ Nisin A, Z 2ml Phụ lục 9: Sắc đồ độ lặp lại Hình P9.1 Sắc đồ Nisin A, Nisin Z mẫu sữa lỏng lần 82 Hình P9.2 Sắc đồ Nisin A, Nisin Z mẫu sữa lỏng lần Hình P9.3 Sắc đồ Nisin A, Nisin Z mẫu sữa lỏng lần Hình P9.4 Sắc đồ Nisin A, Nisin Z mẫu sữa lỏng lần Hình P9.5 Sắc đồ Nisin A, Nisin Z mẫu sữa lỏng lần 83 Hình P9.6 Sắc đồ Nisin A, Nisin Z mẫu sữa lỏng lần Hình P9.7 Sắc đồ Nisin A, Nisin Z mẫu sữa bột lần Hình P9.8 Sắc đồ Nisin A, Nisin Z mẫu sữa bột lần Hình P9.9 Sắc đồ Nisin A, Nisin Z mẫu sữa bột lần 84 Hình P9.10 Sắc đồ Nisin A, Nisin Z mẫu sữa bột lần Hình P9.11 Sắc đồ Nisin A, Nisin Z mẫu sữa bột lần Hình P9.12 Sắc đồ Nisin A, Nisin Z mẫu sữa bột lần Phụ lục 10: Sắc đồ độ thu hồi 85 Hình P10.1 Sắc đồ Nisin A, Nisin Z mẫu sữa lỏng nồng độ 10ppb Hình P10.2 Sắc đồ Nisin A, Nisin Z mẫu sữa lỏng nồng độ 20ppb Hình P10.3 Sắc đồ Nisin A, Nisin Z mẫu sữa lỏng nồng độ 50ppb 86 Phụ lục 11: Sắc đồ số mẫu thực tế Hình P11.1 Sắc đồ mẫu sữa lỏng không phát Nisin A, Nisin Z Hình P11.2 Sắc đồ mẫu sữa bột khơng phát Nisin A, Nisin Z Hình P11.3 Sắc đồ mẫu phomai không phát Nisin A, Nisin Z 87 ... đồng nên l? ?a chọn để xác định đồng thời Nisin A Nisin Z nghiên cứu Trên sở đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài ? ?Xác định đồng thời hàm lượng Nisin A Nisin Z sản phẩm dinh dưỡng sắc kí lỏng. .. F, H, U Nisin A [27], Nisin Z [43], Nisin Q [68] Nisin F [14] Nisin U [66], Nisin H [45] Nisin A Nisin Z khác vị trí acid amin thứ 27 (Nisin A - histidin; Nisin Z –asparagin) Nisin A Nisin F... giới khối phô mai sau (WHO) kết đông sản phẩm làm từ phô MRL (mg/kg) 6,25 12 mai Italia Phô mai 12,5 Australia New Zealand Sản phẩm thịt chế biến gia cầm 12,5 Pháp Phô mai thương mại 12,5 15 Nga