Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả đệm của Tris (Tris-hydroxymethylaminomethane) trong môi trường pha loãng và bảo quản tinh dịch lợn. Tris được bổ sung vào môi trường bảo quản tinh dịch lợn với lượng 4,5 g/lít môi trường.
ĐỘNG VẬT ĐỀ VÀ KHÁC CÁC VẤN ĐỀ KHÁC CHĂN NUÔI CHĂN ĐỘNGNUÔI VẬT VÀ CÁC VẤN CẢI TIẾN MÔI TRƯỜNG PHA LOÃNG VÀ BẢO QUẢN TINH DỊCH LỢN Nguyễn Công Toản1*, Nguyễn Thị Hải Yến1, Phạm Văn Tiềm2, Phùng Thế Hải3, Nguyễn Huy Đăng4 Sử Thanh Long1 Ngày nhận báo: 22/07/2020 - Ngày nhận phản biện: 10/08/2020 Ngày báo chấp nhận đăng: 24/08/2020 TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm đánh giá hiệu đệm Tris (Tris-hydroxymethylaminomethane) môi trường pha loãng bảo quản tinh dịch lợn Tris bổ sung vào môi trường bảo quản tinh dịch lợn với lượng 4,5 g/lít mơi trường Các thơng số mơi trường NGS có bổ sung Tris làm chất đệm bao gồm pH 6,95, áp suất thẩm thấu 312 (mOsm), tỷ trọng 1.021 Tinh dịch lợn ngoại pha với môi trường NGS bảo quản 170C sau thời gian ngày giữ hoạt lực tốt (0,70±0,10) cao hoạt lực tinh trùng bảo quản mơi trường BTS khơng có bổ sung Tris làm chất đệm (0,50±0,09) tương đương với chất lượng môi trường L-VCN (0,71±0,09) Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình ngày thứ tinh dịch bảo quản môi trường NGS (6,58±0,33) thấp tinh dịch bảo quản môi trường BTS (7,42±0,18) Đồng thời, độ pH tinh dịch pha với môi trường NGS ngày thứ (6,76±0,02) biến đổi so với pH tinh dịch bảo quản môi trường BTS (6,34±0,03) Kết cho thấy bổ sung Tris vào môi trường bảo quản tinh dịch lợn cho hiệu tốt Từ khóa: Tinh dịch lợn, mơi trường pha lỗng bảo quản tinh lợn, hoạt lực, tinh trùng kỳ hình, độ pH ABSTRACT Experimental research on boar semen extender using Tris as a buffer This study was conducted to evaluate the buffer effect of Tris (Tris-hydroxymethylaminomethane) in the semen extender of boar semen Tris was added to boar semen extender with an amount of 4.5 g/l medium The parameters of NGS semen extender supplemented with Tris as buffers include pH of 6.95, osmotic pressure of 312 (mOsm), density of 1,021 Boar semen is mixed with NGS medium stored at 170C during the 3-day time remained good motility (A=0.70±0.10) and higher than sperm motility which was preserved by BTS medium without Tris supplement as buffers (A=0.50±0.09) and equivalent to the quality of L-VCN long-term medium (A=0.71±0.09) Abnormal sperm morphology percentage of sperm stored by NGS at day of preservation (6.58±0.33) is also lower than that of sperm stored by short term medium-BTS (7.42±0.18) Also, the pH of semen diluted with NGS medium (6.76±0.02 at day is less changed over time of storage compared to the pH of semen preserved by BTS medium (6.34±0.03) The results showed that adding Tris to boar semen extender as a buffer showed good effect Keywords: Boar semen, semen extender, motility, abnormal sperm, pH ĐẶT VẤN ĐỀ Học viện Nông nghiệp Việt Nam Bộ khoa học Công nghệ Trung tâm Giống gia súc lớn Trung ương Sở Nông nghiệp & PTNT Hà Nội * Tác giả liên hệ: ThS Nguyễn Công Toản, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; ĐT: 0904171336; Email: toan hua@gmail.com xu giảm quy mô nông hộ chuyển sang trang trại gia trại với quy mô từ vài chục tới hàng ngàn lợn nái Giống lợn nuôi trang trại gia trại chủ yếu lợn ngoại Trong sinh sản, hầu hết trang trại ứng dụng thụ tinh nhân tạo nhằm nâng cao suất sinh sản, khai thác tận dụng tối đa sức sản xuất tiềm đực giống tốt, hạn chế ngăn ngừa bệnh lây lan thông qua giao phối tự nhiên Trong thụ tinh nhân tạo, với mục đích kéo dài thời gian sống 40 KHKT Chăn nuôi số 261 - tháng 12 năm 2020 Chăn nuôi lợn nước ta phát triển chiếm tỷ trọng cao ngành chăn ni Những năm gần đây, chăn ni lợn có CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC khả thụ tinh tinh trùng bên cần phải có mơi trường pha tinh dịch Trong thành phần mơi trường pha tinh, chất đệm đóng vai trị quan trọng đến việc kéo dài thời gian sống khả thụ tinh tinh trùng nhờ vào chức ổn định độ pH cho mơi trường Q trình trao đổi chất tinh trùng sinh sản phẩm mang tính axít axít lactic, axít cacbonic,… điều làm giảm pH tinh dịch, mơi trường có pH thấp gây độc làm tinh trùng nhanh chết Các mơi trường pha lỗng bảo quản tinh lợn dạng ngắn môi trường BTS, IVT, Kiev,… thường sử dụng natri xitrat làm chất đệm Trong đó, mơi trường pha lỗng bảo quản tinh dịch lợn dài ngày môi trường Zorlesco, Zorpva, Reading, Modena, L-VCN… sử dụng kết hợp natri xitrat Tris với mục đích làm tăng hiệu đệm cho môi trường Xuất phát từ lý trên, hỗ trợ kinh phí Học viện Nông nghiệp Việt Nam tiến hành nghiên cứu thử nghiệm mơi trường pha lỗng bảo quản tinh dịch lợn có bổ sung Tris (Tris-hydroxymethylaminomethane) làm chất đệm Bảng Thành phần hóa chất mơi trường Hóa chất Nước cất, l Glucose, g Natri citrate, g EDTA, g Natri bicacbonat, g Kali clorua, g Tris, g Citrate, g Gentamycine, g Khối lượng 25 8,25 1,85 1,65 0,75 4,5 3,75 0,2 2.2 Phương pháp 2.2.1 Đánh giá số tiêu lý, hóa mơi trường pha loãng bảo quản tinh dịch lợn Sử dụng loại mơi trường pha lỗng bảo quản tinh dịch lợn BTS; L-VCN NGS BTS môi trường pha loãng bảo quản tinh dịch lợn hãng Minitub-Đức (mơi trường khơng có Tris); L-VCN mơi trường pha loãng bảo quản tinh dịch lợn Viện Chăn ni NGS mơi trường pha lỗng bảo quản tinh dịch lợn nghiên cứu nhóm tác giả Học Viện Nơng nghiệp Việt Nam có thành phần hóa học nêu Bảng Mơi trường BTS L-VCN mua sở kinh doanh có uy tín huyện Gia Lâm, thành phố Hà Nội bảo quản theo hướng dẫn nhà sản xuất Mỗi loại môi trường sau pha để sử dụng theo khuyến cáo nhà sản xuất, lấy lượng nhau, thời điểm, bảo quản điều kiện để đánh giá số tiêu lý, hóa: a Áp suất thẩm thấu môi trường nghiên cứu: Áp suất thẩm thấu môi trường pha chế bảo quản tinh dịch lợn, thí nghiệm chúng tơi sử dụng máy đo áp suất thẩm thấu Osmolmeter Minitube (Đức) b Tỷ trọng môi trường nghiên cứu: Tỷ trọng môi trường pha chế bảo quản tinh dịch lợn sử dụng tỷ trọng kế quy ước tỷ trọng nước 1.000 c Độ pH mơi trường thí nghiệm: Xác định độ pH môi trường pha chế bảo quản tinh dịch lợn thí nghiệm máy đo pH Metler hãng Toledo, Thụy Sỹ 2.2.2 Đánh giá chất lượng tinh dịch sau pha loãng với môi trường theo thời gian bảo quản Mỗi giống cá thể, 1,5-4 năm tuổi, ni chuồng kín, sử dụng thức ăn công nghiệp dạng viên dành riêng cho đực giống khai thác tinh chăm sóc, ni dưỡng theo quy trình kỹ thuật Trung tâm giống chất lượng cao-Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tinh dịch lợn cá thể sau khai thác đánh giá số tiêu số lượng, chất lượng tinh dịch theo tiêu chuẩn quốc gia KHKT Chăn nuôi số 261 - tháng 12 năm 2020 41 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, địa điểm thời gian Thí nghiệm thực tinh dịch lợn Landrace, Pietrain; môi trường pha loãng; bảo quản tinh dịch lợn NGS, BTS, L-VCN, Khoa thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, từ tháng 01/2017-12/2017 CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC TCVN 11841:2017 chia thành ba phần Lấy ngẫu nhiên phần tương ứng để pha lỗng với loại mơi trường nêu Sau đó, bảo quản điều kiện nhiệt độ 170C kiểm tra, đánh giá hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình pH thời điểm: (ngay sau pha loãng), 1, ngày sau Phương đánh giá số tiêu chất lượng tinh dịch: a Xác định hoạt lực tinh trùng (A-%): Dùng đũa thủy tinh sạch, lấy giọt tinh dịch nhỏ lên phiến kính khơ, sạch, ấm (35-37°C), đặt lamen lên đưa soi kính hiển vi quang học có độ phóng đại 100-400 lần xác định Đánh giá hoạt lực tinh trùng thông qua tỷ lệ % tinh trùng tiến thẳng số tinh trùng có chuyển động tiến thẳng quan sát vi trường Ví dụ: Số lượng tinh trùng tồn vi trường xem 100, cách phân loại hoạt lực sau: Nếu 100% tinh trùng vi trường hoạt động tiến thẳng hoạt lực (A) Nếu 80% tinh trùng vi trường hoạt động tiến thẳng hoạt lực (A) 0,8 Nếu 50% tinh trùng vi trường hoạt động tiến thẳng hoạt lực (A) 0,5 Nếu 30% tinh trùng vi trường hoạt động tiến thẳng hoạt lực (A) 0,3 Nếu 0% tinh trùng vi trường hoạt động tiến thẳng hoạt lực (A) b Xác định tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K-%): Nhỏ giọt tinh dịch lên phiến kính sạch, nhẵn, ấm sau dùng lamen sạch, nhẵn dàn tinh dịch phiến kính (nếu đặc pha vài ba giọt nước sinh lý); để tự khơ khơng khí sau hơ qua phiến kính lửa đèn cồn Nhuộm màu tinh trùng cách nhỏ dung dịch đỏ Fucsin 5%, lên mặt lớp tinh dịch khô đợi 5-7 phút Sau đó, rửa nhẹ cách nhỏ giọt nước cất đầu phiến kính có tiêu bản, nước cất tự loang trôi dần thuốc nhuộm đến mức độ tiêu giữ màu nhạt thuốc nhuộm Đợi tiêu khơ, đặt tiêu lên kính hiển vi độ phóng đại 400-600 lần Đếm tổng số 300- 500 tinh trùng (đếm tinh trùng bình thường tinh trùng kỳ hình) 42 KHKT Chăn ni số 261 - tháng 12 năm 2020 Cơng thức tính: x 100 Trong đó, K (%) tỷ lệ tinh trùng kỳ hình; n số tinh trùng kỳ hình; N tổng số tinh trùng đếm (N khoảng 300-500) c Xác định độ pH tinh dịch: pH tinh dịch xác định máy đo pH Metler hãng Toledo, Thụy Sỹ Tinh dịch lợn đực giống Pietrain Landrace khai thác đánh giá số lượng, chất lượng thu kết (Bảng 2) Bảng Phẩm chất tinh dịch lợn (Mean±SD) Chỉ tiêu V, ml A C, triệu/ml K, % pH Pietrain (n=5) 239,56±2,76 0,85±0,012 247,87±2,03 5,12±0,143 7,11±0,015 Landrace (n=5) 232,03±1,72 0,82±0,24 231,65±3,45 5,34±0,068 7,21±0,024 2.3 Xử lý số liệu Các số liệu thu thập xử lý theo phương pháp thống kê sinh học phầm mềm Microsoft Excel 2013 Để so sánh tiêu tinh dịch thời điểm ngày 0, 1, sau bảo quản, sử dụng phương pháp kiểm định t-test so sánh hai trung bình với liệu cặp Sự sai khác có ý nghĩa thống kê P7,0, đặc biệt mơi trường BTS có pH cao (7,2) 3.2 Chất lượng tinh dịch sau pha lỗng với mơi trường theo thời gian bảo quản Tinh dịch lợn đực giống Pietrain Landrace sau khai thác chuyển phịng thí nghiệm đánh giá tiêu số lượng, chất lượng Nếu tất tiêu đạt tiêu chuẩn theo quy định Việt Nam TCVN 9111:2011 chúng tơi pha lỗng với tỷ lệ 1/5 với môi trường pha chế theo hướng dẫn nhà sản xuất, bảo quản 170C 3.2.1 Hoạt lực tinh trùng Hoạt lực tinh trùng tỷ lệ tinh trùng sống hoạt động tiến thẳng có tinh dịch Tỷ lệ phụ thuộc vào sức hoạt động cá thể tinh trùng, quần thể tinh trùng tinh dịch điều kiện định Sau pha lỗng tinh dịch lợn với mơi trường nghiên cứu theo dõi kết thay 43 CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC đổi hoạt lực tinh trùng ngày 0, 1, sau bảo quản Bảng Sự thay đổi hoạt lực tinh trùng (n=10) Bảo quản ngày ngày BTS 0,81±0,04a 0,70±0,01a 0,64±0,07a 0,50±0,09a NGS 0.83±0,12a 0.77±0,09a 0.74±0,07b 0.70±0,10b L-VCN 0,82±0,08a 0,78±0,10a 0,74±0,07b 0,71±0,09b Ghi chú: Trong hàng ngang số liệu có chữ khác khác có ý nghĩa thống kê (P