Thiết kế, tổng hợp một số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất của cyanine và coumarin để xác định biothiol và Hg(II) tt

24 (c) Các sensor huỳnh quang Hg2L2 AMC phát Cys dung dịch với lượng nhỏ dung môi hữu cơ, thời gian phản ứng xảy nhanh, phát Cys với nồng độ thấp nội bào thấp so với sensor công bố Đã sử dụng phương pháp TD-DFT để nghiên cứu đặc tính huỳnh quang chất dựa hình học tối ưu trạng thái trạng thái kích thích; kết hợp với sử dụng phương pháp phân tích NBO để xem xét biến đổi đặc tính huỳnh quang chất dựa nghiên cứu chất liên kết Kết tính tốn cho thấy, ion Hg(II) gây nên phản ứng tạo phức với L dẫn đến làm giảm khoảng cách lượng HOMO LUMO, đồng thời làm thay đổi hệ liên hợp electron π, nguyên nhân dẫn đến dập tắt huỳnh quang phức Hg2L2 Sự phát xạ huỳnh quang AMC, AMCCys, AMC-Hcy AMC-GSH xuất phát từ trạng thái kích thích electron mức cao (S2, S4) trạng thái S0 Đây trường hợp ngoại lệ quy tắc Kasha MỞ ĐẦU Glutathione (GSH), Cysteine (Cys) Homocysteine (Hcy) là hợp chất thiol, đóng vai trị quan trọng q trình sinh học Mức độ bất thường biothiol có liên quan đến nhiều loại bệnh Thủy ngân chất gây ô nhiễm nguy hiểm phổ biến, ảnh hưởng nghiêm trọng sức khỏe người Vì vậy, việc xác định biothiol tế bào, hàm lượng thủy ngân nguồn nước quan trọng chẩn đoán sớm bệnh liên quan, bảo vệ môi trường sống thu hút quan tâm nhà khoa học ngồi nước Có nhiều phương pháp áp dụng phát biothiol ion Hg(II) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), phương pháp phổ khối lượng (MS),…,và phương pháp huỳnh quang Trong đó, phương pháp huỳnh quang có nhiều ưu điểm hơn, khơng địi hỏi thiết bị máy móc đắt tiền, dễ thực hiện, tốn kém, áp dụng phân tích cho nhiều đối tượng, đặc biệt phân tích chất tế bào sống Phương pháp huỳnh quang Giáo sư Anthony W Czarnik Đại học Quốc gia Ohio nghiên cứu đề xuất cách tiếp cận lĩnh vực sensor quang học vào năm 1992 Với ưu phương pháp huỳnh quang, nên nhiều năm qua, nghiên cứu sensor huỳnh quang nhằm phát ion kim loại, anion, đặc biệt phân tử sinh học thu hút quan tâm nhà khoa học nước với số lượng sensor huỳnh quang công bố ngày nhiều giới Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sensor huỳnh quang năm 2007 tác giả Dương Tuấn Quang Để xác định biothiol, nghiên cứu thiết kế sensor huỳnh quang dựa phản ứng đặc trưng biothiol, phản ứng trao đổi phức (phức chất huỳnh quang với ion Cu(II)…) Các nghiên cứu sensor huỳnh quang phát ion Hg(II) dựa phản ứng đặc trưng ion Hg(II) dựa phản ứng tạo phức ion Hg(II) với phối tử -O, -N, -S vòng mạch hở 2 Tuy nhiên, đa phần sensor tồn số hạn chế sử dụng lượng lớn dung mơi hữu cơ, giới hạn phát cịn cao, có bước sóng phát xạ ngắn gây ảnh hưởng đến tế bào, phản ứng sensor với chất phân tích xảy chậm Hiện nay, nhà khoa học giới tiếp tục nghiên cứu thiết kế sensor huỳnh quang có độ nhạy độ chọn lọc cao để phát biothiol ion Hg(II) Hiện nay, hố tính tốn trở thành cơng cụ quan trọng nghiên cứu hố học nói chung nghiên cứu sensor huỳnh quang nói riêng Sự kết hợp hóa tính tốn với nghiên cứu thực nghiệm hướng nghiên cứu đại Tuy nhiên, cịn sensor huỳnh quang nghiên cứu theo hướng công bố Trước thực trạng trên, thực đề tài: "Thiết kế, tổng hợp số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất cyanine coumarin để xác định biothiol Hg(II) " Những đóng góp luận án: - Sensor L thiết kế từ dẫn xuất cyanine công bố, phát chọn lọc ion Hg(II) dựa phản ứng tạo phức, hoạt động theo kiểu ON-OFF; phức chất Hg(II) với L (Hg2 L2) phát chọn lọc Cys dựa phản ứng trao đổi phức, hoạt động theo kiểu tắt-bật (OFF-ON) Giới hạn phát giới hạn định lượng ion Hg(II) L tương ứng 11,8 μg/L 39,3 μg/L hay 0,059 μM 0,19 μM; giới hạn phát giới hạn định lượng Cys Hg2 L2 tương ứng 0,2 μM 0,66 μM - Sensor AMC thiết kế từ dẫn xuất coumarin công bố, phát chọn lọc Cys dựa phản ứng cộng Michael, hoạt động theo kiểu dựa biến đổi tỷ lệ cường độ huỳnh quang hai bước sóng Giới hạn phát giới hạn định lượng Cys xác định tương ứng 0,5 μM 1,65 μM - L AMC nghiên cứu kết hợp linh hoạt nghiên cứu tính tốn hóa lượng tử với nghiên cứu thực nghiệm CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nghiên cứu sensor huỳnh quang 1.1.1 Tình hình nghiên cứu sensor huỳnh quang 23 NHỮNG KẾT LUẬN CHÍNH CỦA LUẬN ÁN Đã kết hợp linh hoạt tính tốn hóa học lượng tử nghiên cứu thực nghiệm để nghiên cứu phát triển thành công hai sensor huỳnh quang L AMC Sự kết hợp linh hoạt giảm đáng kể khối lượng tính toán lý thuyết thực nghiệm, tiết kiệm thời gian chi phí hóa chất sử dụng, tăng khả thành công, làm sáng tỏ chất trình, tạo sở khoa học cho nghiên cứu Các phản ứng tổng hợp sensor L sensor AMC nghiên cứu dự đoán từ tính tốn khẳng định từ kết tổng hợp thực nghiệm sau Cấu trúc, đặc tính sensor L sensor AMC xác định mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ với kết đáng tin cậy, thông qua kiểm tra, đối chiếu khẳng định từ kết thực nghiệm (a) Sensor L phát chọn lọc ion Hg(II) có mặt ion kim loại khác, hoạt động theo kiểu bật-tắt huỳnh quang Giới hạn phát giới hạn định lượng ion Hg(II) theo phương pháp trắc quang 0,076 μM 0,25 μM; theo phương pháp huỳnh quang 0,059 μM 0,19 μM Phức Hg2L2 phát chọn lọc Cys diện amino acids khơng có nhóm thiol, hoạt động theo kiểu tắt-bật huỳnh quang Giới hạn phát giới hạn định lượng Cys tương ứng 0,2 μM 0,66 μM Sensor L phát ion Hg(II) phức Hg2L2 phát Cys dựa phản ứng trao đổi phức ion trung tâm Hg(II) với hai phối tử L Cys (b) Sensor AMC phát chọn lọc biothiol (Cys, GSH, Hcy) diện amino acids khơng có nhóm thiol, hoạt động dựa biến đổi tỉ lệ cường độ huỳnh quang hai bước sóng Giới hạn phát giới hạn định lượng Cys tương ứng 0,5 μM 1,65 μM Sensor AMC phản ứng với biothiol (Cys, GSH, Hcy) theo chế phản ứng AMC cộng Michael 22 Đối với AMC-Cys, trình chuyển electron từ S1 S0 cấu hình REES1 cấu hình REES2 bị cấm Trong đó, trình chuyển electron từ S2 S0 cấu hình REES1 cấu hình REES2 AMC-Cys xảy Thêm vào đó, cường độ dao động (f) hai trình lớn, cường độ dao động (f) bước sóng 340,3 nm 0,5122, lớn bước sóng 324,5 nm 0,3171; điều dẫn đến cường độ huỳnh quang AMC-Cys quan sát thực nghiệm mạnh, bước sóng dài 340,3 nm mạnh nhiều so với bước sóng ngắn 324,5 nm Ngồi ra, q trình chuyển electron từ S2 S1 cấu hình REES1, với cấu hình S2 tương ứng khơng phải cấu hình có lượng cực tiểu, nên q trình (6) Hình 3.48b chiếm ưu so với trình (4) Hình 3.48b Đó nguyên nhân khác dẫn đến cường độ huỳnh quang bước sóng dài (340,3 nm) mạnh nhiều so với bước sóng ngắn (324,5 nm) quan sát thực nghiệm Đối với AMC-Hcy AMC-GSH (tương tự AMC-Cys) Như trình bày, kết nghiên cứu hình học tối ưu trạng thái kích thích AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy AMCGSH cho thấy, sensor AMC, có xoắn góc mạnh tiểu phần coumarin tiểu phần acryloxy cấu hình REES1 REES2, điều dẫn đến phá vỡ hệ thống electron π liên hợp hai tiểu phần, kéo theo mật độ electron tiểu phần coumarin tiểu phần acryloxy bị phân tách mạnh Kết có xen phủ MO bước chuyển đổi electron trạng thái kích thích sensor AMC Ngược lại, REES2 AMC-Cys, AMC-Hcy AMC-GSH, tiểu phần coumarin tiểu phần acryloxy nằm mặt phẳng Đây yếu tố thuận lợi cho xen phủ MO bước chuyển đổi trạng thái Những phân tích cho thấy, phát huỳnh quang sensor AMC sản phẩm cộng với biothiol khơng bắt nguồn từ trạng thái S1 Đây trường hợp ngoại lệ quy tắc Kasha 1.1.2 Nguyên lý hoạt động sensor huỳnh quang 1.1.3 Cấu tạo sensor huỳnh quang 1.1.4 Nguyên tắc thiết kế sensor huỳnh quang 1.2 Vai trò biothiol tế bào phương pháp phát 1.2.1 Các biothiol vai trò chúng 1.2.2 Phương pháp phát biothiol 1.3 Nguồn ô nhiễm, độc tính, phương pháp phát ion Hg(II) 1.3.1 Nguồn nhiễm, độc tính ion Hg(II) 1.3.2 Phương pháp phát ion Hg (II) 1.4 Sensor huỳnh quang phát biothiol 1.4.1 Dựa phản ứng tạo vòng với aldehyde 1.4.2 Dựa phản ứng cộng Michael 1.4.3 Dựa phản ứng ghép nối peptide 1.4.4 Dựa phản ứng xếp lại nhóm nhân thơm 1.4.5 Dựa phản ứng phân tách sulfonamide ester sulfonate ester thiol 1.4.6 Dựa phản ứng phân tách disulfides thiol 1.4.7 Dựa phản ứng hình thành phân hủy phức 1.4.8 Dựa chế khác 1.5 Sensor huỳnh quang phát ion Hg(II) 1.5.1 Dựa phản ứng tạo phức với ion Hg(II) 1.5.2 Dựa phản ứng đặc trưng ion Hg(II) 1.6 Sensor huỳnh quang phát biothiol ion Hg(II) dựa fluorophore cyanine coumarin 1.7 Tổng quan ứng dụng hóa học tính toán nghiên cứu sensor huỳnh quang CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 2.2 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng ứng dụng sensor huỳnh quang L từ dẫn xuất cyanine để phát chọn lọc biothiol ion Hg(II): 21 + Nghiên cứu lý thuyết thiết kế, tổng hợp đặc trưng sensor L + Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng ứng dụng sensor L + Nghiên cứu lý thuyết ứng dụng sensor L phát ion Hg(II) + Nghiên cứu sử dụng phức (tạo ion Hg(II) với sensor L) phát biothiol Trong đó, nghiên cứu lý thuyết tiến hành trước để định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng phức - Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng ứng dụng sensor AMC từ dẫn xuất coumarin để phát chọn lọc biothiol: + Nghiên cứu lý thuyết thiết kế, tổng hợp sensor AMC phản ứng sensor AMC với biothiol + Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng ứng dụng sensor AMC + Nghiên cứu lý thuyết đặc tính ứng dụng sensor AMC 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu tính tốn lý thuyết - Việc xác định cấu trúc hình học bền, lượng điểm đơn thực phương pháp DFT B3LYP/LanL2DZ, sử dụng phần mềm Gaussian 03 - Các thông số lượng tương tác hiệu chỉnh ZPE gồm biến thiên entanpi biến thiên lượng tự Gibbs phản ứng tính tốn dựa khác biệt tổng lượng sản phẩm tổng lượng chất tham gia - Tính tốn trạng thái kích thích yếu tố phụ thuộc thời gian thực phương pháp TD-DFT mức lý thuyết - Các phân tích AIM NBO tiến hành mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm quang AMC nhỏ quan sát thực nghiệm Ngồi ra, q trình kích thích từ S0→S1 (q trình (1) Hình 3.48a) có cường độ dao động lớn nhiều so với q trình kích thích từ S0→S2 (quá trình (2) Hình 3.48a), nên trình chuyển electron từ S1 S0 (quá trình (3) Hình 3.48a) chiếm ưu từ S2 S0 (q trình (4) Hình 3.48a) Điều nguyên nhân dẫn đến cường độ huỳnh quang bước sóng dài (469,5 nm) mạnh cường độ huỳnh quang bước sóng ngắn (417,4 nm) quan sát thực nghiệm (a) (b) (c) (d) Hình 3.48 Giản đồ lượng q trình kích thích giải phóng lượng kích thích hình học bền trạng thái (RGS) trạng thái kích thích electron (REES1, REES2, ) mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ: (a) AMC; (b) AMC-Cys; (c) AMC-Hcy; (d) AMC-GSH (d) 20 3.2.3.2 Nghiên cứu lý thuyết phổ kích thích phổ huỳnh quang a Nghiên cứu lý thuyết phổ kích thích Từ kết tính tốn cho thấy, sensor AMC, bước chuyển electron singlet từ trạng thái S0 lên trạng thái kích thích S1 bước chuyển chính, với cường độ dao động (f) lớn 0,5348, bước sóng 320,9 nm Bước chuyển trạng thái S0→S1 chủ yếu đóng góp bước chuyển electron từ HOMO→LUMO, với tỷ lệ đóng góp lên đến 96,21% Bên cạnh đó, xen phủ HOMO LUMO lớn, điều cho thấy việc chuyển electron từ HOMO sang LUMO thuận lợi Các bước chuyển trạng thái khác có cường độ dao động (f) nhỏ khơng đáng kể Trong đó, với AMC-Cys, AMC-Hcy, AMC-GSH, số liệu tính tốn cho thấy, bước chuyển electron singlet từ trạng thái S0 lên trạng thái kích thích S2 bước chuyển chính, với cường độ dao động (f) 0,3723; 0,3694 0,3801 (lớn nhiều so với bước chuyển khác), bước sóng tương ứng 300,6; 300,4 300,7 nm Trong bước chuyển trạng thái này, bước chuyển electron từ HOMO-1→LUMO bước chuyển chính, với tỷ lệ đóng góp tương ứng 89,17; 89,05 89,24% Mặt khác, xen phủ HOMO-1 LUMO lớn, nên việc chuyển electron từ HOMO-1 lên LUMO thuận lợi Các bước chuyển trạng thái khác có cường độ dao động (f) nhỏ khơng đáng kể Kết phân tích MO biên cho thấy, khơng có xen phủ HOMO HOMO-1 Do đó, AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy AMC-GSH khơng xảy q trình PET từ HOMO đến HOMO-1 Kết quả, chất AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy AMCGSH phát huỳnh quang trình bày thực nghiệm b Nghiên cứu lý thuyết phổ huỳnh quang Đối với sensor AMC, cấu hình REES1, trình chuyển electron từ S1 S2 S0 bị cấm Tại cấu hình REES2, trình chuyển electron từ S1 S2 S0 xảy Thêm vào đó, cường độ dao động (f) hai trình (3) (4) lớn khơng đáng kể (0,0137 0,0152), điều dẫn đến cường độ huỳnh - Đặc trưng cấu trúc chất khẳng định phổ 1H -NMR, phổ 13C- NMR, phổ khối MS - Đặc tính, ứng dụng sensor thực phương pháp quang phổ huỳnh quang UV-Vis - Các điều kiện tổng hợp sensor nghiên cứu dựa kết dự đốn từ tính tốn lý thuyết kết thực nghiệm công bố trước phản ứng tương tự [2], [3], [29] Quy trình tổng hợp sensor tóm tắt sau: a Tổng hợp sensor L * Tổng hợp CBZT 2-methylbenzothiazole (3,0 g, 0,02 mol) acid bromoacetic (4,18 g, 0,03 mol) hòa tan 50 mL ethanol tuyệt đối Hỗn hợp phản ứng đun hồi lưu Sau để nguội đến nhiệt độ phòng thu kết tủa Rửa kết tủa nhiều lần với ethanol môi trường kiềm, sau làm khơ thu chất rắn CBTZ (khoảng 4,0 g với hiệu suất 75%) * Tổng hợp sensor L CBTZ (290mg,1mmol) 4-diethylamino-2hydroxybenzaldehyde (190 mg, mmol) hòa tan 30 mL ethanol tuyệt đối Thêm giọt piperidine, dung dịch phản ứng chuyển sang màu đỏ Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng 10 giờ, sau làm ngi đến nhiệt độ phịng Lọc lấy kết tủa, rửa nhiều lần diethyl ether sau làm khơ thu sản phẩm L (khoảng 3,0 g, với hiệu suất khoảng 38%) b Tổng hợp AMC Hòa tan 4-methyl-7-hydroxylcoumarin (1,7 g, 9,4 mmol) Et3N (7,9 mL, 56,4 mmol) CH2Cl2 (20 mL), thêm lượng nhỏ chất xúc tác 4-dimethylaminopyridine, thu dung dịch Làm lạnh giữ dung dịch phản ứng nhiệt độ oC Thêm từ từ (trong khoảng thời gian giờ) vào dung dịch phản ứng giọt dung dịch acryloyl chloride (1,9 mL, 23,5 mmol) CH2Cl2 (20 mL) Sau đó, khuấy dung dịch phản ứng nhiệt độ phòng Thêm nước vào dung dịch thu để hòa tan muối amine Tiếp tục rửa pha hữu thu nước, sau làm khơ pha hữu 19 muối MgSO4 khan Làm bay dung môi hữu máy quay chân khơng Sản phẩm sau tinh chế cách kết tinh lại ethanol, thu chất rắn kết tinh màu trắng, khối lượng khoảng gam, hiệu suất khoảng 45% CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng ứng dụng sensor L từ dẫn xuất cyanine phát biothiol ion Hg(II) dựa phản ứng tạo phức 3.1.1 Nghiên cứu lý thuyết thiết kế, tổng hợp, đặc trưng sensor L 3.1.1.1 Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor L Mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ áp dụng cho hệ nghiên cứu Các dẫn xuất cyanine bao gồm R2N+=CH[CH=CH]n-NR2, + Aryl=N =CH[CH=CH]n-NR2, Aryl=N+=CH[CH=CH]n-N=Aryl, dạng có cấu trúc donor - hệ liên hợp π - acceptor Trong đó, donor (nhóm đẩy electron) nhóm amino; aceptor (nhóm rút electron) ion amoni Chúng biết đến hợp chất màu, phát huỳnh quang mạnh [40] Sensor L dự kiến thiết kế theo sơ đồ tổng hợp sau: huỳnh quang dung dịch gồm AMC + biothiol + amino acids với dung dịch gồm AMC + biothiol (Hình 3.38b) Fluorophore HO HO S BZT S BrCH2COOH N (I) OHC - O2C CBZT N S N N N (II) - O2C L Receptor Hình 3.1 Sơ đồ thiết kế tổng hợp sensor L Trong fluorophore cyanine, receptor nhóm -COO-, nhóm có lực mạnh với ion Hg(II); phản ứng tổng hợp L thực qua hai giai đoạn: giai đoạn (I) giai đoạn (II) Hình 3.38 (a) Phổ huỳnh quang AMC (10 μM, C H5 OH/HEPES, pH =7,4, 1/4, v/v, 25 o C) thêm Cys, Hcy, GSH, amino acids khác (bao gồm Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr and Val); (b)Phổ huỳnh quang AMC (10 μM, C 2H5 OH/HEPES, pH =7,4, 1/4, v/v, 25 oC) diện hỗn hợp amino acids (bao gồm Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr Val) thêm Cys, Hcy GSH d Khảo sát sử dụng sensor AMC phát định lượng Cys Trong khoảng nồng độ Cys từ đến 10 μM, tỷ lệ cường độ huỳnh quang hai bước sóng 450 375 nm (F450/375) có quan hệ tuyến tính với nồng độ Cys theo phương trình: F450/375 = 1,5431 + 2,257 × [Cys], với R = 0,982 Giới hạn phát giới hạn định lượng Cys xác định tương ứng 0,5 μM 1,65 μM 3.2.3 Nghiên cứu lý thuyết đặc tính ứng dụng AMC 3.2.3.1 Hình học tối ưu AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy AMC-GSH trạng thái trạng thái kích thích electron Đối với sensor AMC, trạng thái S0, tiểu phần coumarin acryloxy gần đồng phẳng Trong đó, trạng thái kích thích electron S1(REES1) S2(REES2), tiểu phần coumarin Fluorophore acryloxy gần hai mặt phẳng vng góc với Đối với AMC-Cys, AMC-Hcy AMC-GSH, cấu hình S0(RGS) S1(REES1), có xoắn góc tiểu phần coumarin acryloxy Trong đó, cấu hình S2(REES2), tiểu phần coumarin acryloxy gần đồng phẳng 18 Trong đó, dung dịch sensor AMC tự hiển thị dải phát xạ huỳnh quang vai với hai đỉnh cực đại bước sóng 375 nm 450 nm (Hình 3.33b) Hiệu suất lượng tử huỳnh quang (Φ) sensor AMC xác định 0,05 Khi thêm Cys vào dung dịch sensor AMC, cường độ huỳnh quang tăng dần hai đỉnh phát xạ Trong đó, cường độ phát xạ huỳnh quang bước sóng dài tăng mạnh cường độ phát xạ huỳnh quang bước sóng ngắn Sự thay đổi cường độ huỳnh quang hai bước sóng 375 450 nm dẫn đến khả sử dụng AMC để làm sensor huỳnh quang hoạt động dựa biến đổi tỷ lệ cường độ huỳnh quang hai bước sóng để xác định Cys b Khảo sát phản ứng sensor AMC với Cys Khi thêm Cys từ đến 10 μM vào dung dịch AMC (10 μM), tỷ lệ cường độ huỳnh quang hai bước sóng 450 375 nm (F450/375) có quan hệ tuyến tính chặt chẽ với nồng độ Cys Sau đó, tỷ lệ thay đổi không đáng kể tiếp tục tăng nồng độ Cys Điều cho thấy phản ứng AMC với Cys xảy theo tỷ lệ mol 1:1 (tương tự Hcy GSH) Kết phù hợp với kết thu xác định hệ số tỷ lượng phản ứng AMC với Cys phương pháp đồng phân tử gam phân tích phổ khối lượng sản phẩm phản ứng AMC Cys c Khảo sát ảnh hưởng amino axit cạnh tranh Kết khảo sát cho thấy, bổ sung amino acids có chứa thiol, cường độ huỳnh quang dung dịch AMC tăng lên rõ rệt hai dải phát xạ, tăng mạnh mẽ bước sóng 450 nm tăng vừa phải bước sóng phát xạ 375 nm Tuy nhiên, mức độ gia tăng cường độ huỳnh quang theo thứ tự sau: Cys> GSH> Hcy (Hình 3.38a) Đối với amino acids khác khơng có chứa nhóm thiol khơng làm thay đổi cường độ huỳnh quang dung dịch sensor AMC (Hình 3.38a) Sự có mặt amino acids không làm ảnh hưởng đến phản ứng biothiol (Cys, GSH Hcy) với AMC, chứng không xuất khác biệt đáng kể phổ Phản ứng ghép nối receptor vào fluorophore, phản ứng số (I) dựa phản ứng 4-metyl quinoline dẫn xuất acid carboxylic [29], phản ứng ghép nối tạo fluorophore, phản ứng số (II) dựa phản ứng phản ứng cộng andol ngưng tụ croton [3] a Khảo sát phản ứng giai đoạn (I) S S S Br- BrCH2 COOH BZT CH3CH2 OH S (1) Br- (6) CH3CH2 OH2+ N+ N + N+ N CBZT-1 COOH COOH Br- S S COO- CBZT-3 HBr (2) BrCH2 COOH CBZT + N N S BZT N+ S S COOH Br- N+ N H3O+ Br- (7) H2O Br- (8) CBZT S S S COO- CBZT-3 CBZT-3 COOH Br OH- S (4) BrCH2 COOH N+ N N+ Br- CBZT-4 COOH BZT S N+ (3) BrCH2 COOH BZT H 2O COO- CBZT-2 COOH Br- Br S S N+ CBZT-3 (5) BrCH2 COOH COOCBZT N N CBZT-5 COOH BZT Hình 3.3 Các phản ứng hình thành CBZT từ CBZT-3 Hình 3.2 Các sản phẩm có từ phản Phản ứng hình thành CBZT từ BZT acid bromoacetic trình bày Hình 3.2 3.3 Kết tính tốn cho thấy, phản ứng BZT với acid bromoacetic để hình thành CBZT-3 phản ứng CBZT-3 dung dịch kiềm để hình thành CBZT thuận lợi mặt nhiệt động b Khảo sát phản ứng giai đoạn (II) Phản ứng hình thành L từ CBZT với DHB tạo (9) sản phẩm (Hình 3.5) Kết L-1 tính tốn cho thấy, biến (10) thiên lượng tự Gibbs L-2 (∆G298) phản ứng (12) âm Theo đó, phản ứng CBZT với DHB theo CBZT DHB (11) hướng hình thành sản phẩm L L-3 thuận lợi mặt nhiệt động ứng BZT với acid bromoacetic HO S N H2O N H2O N H2O N H2O (12) N+ COO- S HO N+ S OHC N COO- N+ COO- HO HO S N+ COO- S N+ COO- HO L Hình 3.5 Các sản phẩm phản ứng hình thành CBZT với DHB 17 3.1.1.2 Nghiên cứu lý thuyết đặc tính L a Cấu trúc phân tử L Chiều dài liên kết, số đo góc liên kết, góc nhị diện L tính tốn Trong đó, tiểu phần BZT, acid bromacetic DHB thay đổi so với ban đầu Trong L có hình thành liên kết N7 C11 Hình 3.6 Hình học bền L mức lý thuyết liên kết đôi nguyên B3LYP/LanL2DZ tử C10 nguyên tử C12 b Phân tích phổ UV-Vis sensor Phổ UV-Vis sensor L đạt cực đại bước sóng 452,6 nm Trong cơng bố trước đây, chất BZTVPA có cấu trúc tương tự sensor L có bước sóng hấp thụ cực đại 405 nm, chất phát xạ huỳnh quang mạnh bước sóng 495 nm Kết dẫn đến kỳ vọng đặc tính huỳnh quang L tương tự BZTVPA c Phân tích đặc tính huỳnh quang sensor L ester tạo acid acrylic ancol (thường fluorophore), ban đầu tạo thioether, hình thành hợp chất dị vịng trường hợp Cys Hcy Trong đó, thioether GSH thường bền, khơng xảy q trình tạo hợp chất vịng sau Khác với nghiên cứu trên, kết tính tốn mặt nhiệt động cho thấy, phản ứng sensor AMC với biothiol (bao gồm Cys, Hcy GSH) để hình thành thioether theo tỉ lệ mol 1:1 thuận lợi mặt nhiệt động 3.2.2 Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng ứng dụng AMC 3.2.2.1 Thực nghiệm tổng hợp sensor AMC Sau tổng hợp, cấu trúc sản phẩm AMC khẳng định phổ 1H-NMR phổ FAB-MS 3.2.2.2 Nghiên cứu thực nghiệm đặc tính ứng dụng sensor AMC a Khảo sát phổ hấp thụ phổ huỳnh quang sensor AMC Bảng 3.5 Năng lượng kích thích, cường độ dao động MO có liên quan đến q trình kích thích L mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ Bước MO Năng lượng Bước sóng f Tỷ lệ % chuyển (eV) (nm) đóng góp S0→S1 95→97 2,53 489,8 0,2566 56,44 96→97 S0→S2 S0→S3 S0→S4 93→97 35,80 2,74 452,6 0,5626 29,22 95→97 28,63 96→97 28,66 92→97 2,86 432,9 0,0097 5,90 93→97 8,83 94→97 77,56 92→97 93→97 3,00 413,2 0,5815 5,42 49,94 Hình 3.33 Phổ hấp thụ phổ huỳnh quang sensor AMC: (a) Phổ hấp thụ, AMC (10 μM) C 2H 5OH/HEPES (pH=7,4, 1/4, v/v) 25 C thêm 20 μM Cys; (b) Phổ huỳnh quang, AMC (10 μM) thêm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 μM Cys C2H 5OH/HEPES (pH =7,4, 1/4, v/v) 25 C, bước sóng kích thích 320 nm Hình 3.33a cho thấy, phổ hấp thụ dung dịch sensor AMC tự đạt cực đại bước sóng 275 320 nm Khi thêm Cys vào dung dịch sensor AMC, phổ hấp thụ thay đổi không đáng kể 16 0,998 Giới hạn phát giới hạn định lượng xác định tương ứng 0,2 μM 0,66 μM 3.2 Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng ứng dựng sensor huỳnh quang AMC từ dẫn xuất coumarin phát biothiol dựa phản ứng cộng Michael 3.2.1 Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor AMC phản ứng sensor AMC với biothiol 3.2.1.1 Nghiên cứu lý thuyết thiết kế tổng hợp sensor AMC Hợp chất 4-methyl-7-hydroxycoumarin hấp thụ cực đại bước sóng 359 nm phát xạ cực đại bước sóng 449 nm [159] Để thiết kế sensor huỳnh quang AMC (7- acryloyl -4metylcouramin) từ dẫn xuất coumarin dùng để phát biothiol dựa phản ứng cộng Michael, hợp chất 4-methyl-7hydroxylcoumarin chọn làm fluorophore, cịn receptor acryloyl chloride, phản ứng gắn receptor lên fluorophore dễ dàng thực thơng qua phản ứng ester hóa nhóm phenol với dẫn xuất axit [2] receptor gây phản ứng cộng với biothiol Sensor AMC dự kiến thiết kế theo sơ đồ tổng hợp sau: + Fluorophore Cl O O (B) O O OH (A) O O O + HCl Bước chuyển MO Năng lượng (eV) Bước sóng (nm) f 94→97 S0→S5 95→97 9,35 96→97 11,07 92→97 3,05 406,0 0,0060 86,61 3,92 316,7 0,0051 44,35 93→97 S0→S6 Tỷ lệ % đóng góp 10,62 90→97 7,68 91→97 41,32 96→97 8,40 Kết tính tốn (Bảng 3.5) cho thấy, trạng thái kích thích có cường độ dao động lớn S0→S1, S0→S2 bước sóng tương ứng 489,8 nm 452,6 nm có đóng góp lớn (tương ứng 35,80% 28,66%) bước chuyển electron từ MO-96 lên MO-97 Do MO liên tiếp, nên khơng có trình PET can thiệp đến bước chuyển Kết dẫn đến kỳ vọng L hợp chất phát huỳnh quang 3.1.2 Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng ứng dụng sensor L 3.1.2.1 Thực nghiệm tổng hợp L Sau tổng hợp, cấu trúc sản phẩm CBZT L khẳng định phổ 1H-NMR, 13C-NMR phổ FAB-MS 3.1.2.2 Khảo sát thực nghiệm ứng dụng sensor L phát ion Hg(II) a Khảo sát phổ UV-Vis phổ huỳnh quang sensor L AMC Receptor Hình 3.29 Sơ đồ thiết kế tổng hợp sensor AMC Kết tính tốn cho thấy, ΔG298 phản ứng tổng hợp sensor AMC âm, theo phản ứng tổng hợp sensor AMC thuận lợi mặt nhiệt động 3.2.1.2 Nghiên cứu lý thuyết phản ứng sensor AMC với biothiol Theo kết nghiên cứu công bố trước đây, phản ứng cộng Michael biothiol (Cys, Hcy GSH) với Hình 3.10 Phổ hấp thụ UV-Vis phổ huỳnh quang L: (a) Phổ UV-Vis, L (5,0 μM) C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4; (b) Phổ huỳnh quang, L (5 μM) C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, bước sóng kích thích 540 nm 10 15 Như dự đốn từ tính tốn, L phát huỳnh quang màu đỏ, với hiệu suất lượng tử huỳnh quang 0,175; bước sóng huỳnh quang cực đại 585 nm, bước sóng hấp thụ cực đại 540 nm b Khảo sát phổ chuẩn độ UV-Vis phổ huỳnh quang sensor L phát ion Hg(II) Hình 3.24 cho thấy, tăng dần Cys vào dung dịch phức Hg2L2: phổ UV-Vis, đỉnh hấp thụ cực đại bước sóng 460 nm biến mất, đồng thời xuất đỉnh hấp thụ cực đại với cường độ hấp thụ mạnh bước sóng 540 nm; phổ huỳnh quang, cường độ huỳnh quang tăng dần trở lại b Khảo sát ảnh hưởng amino acids cạnh tranh phản ứng Hg2L2 với biothiol (b) Hình 3.11 Phổ chuẩn độ UV-Vis phổ huỳnh quang L ion Hg(II): (a) Phổ UV-Vis, L (5,0 μM) C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0 -5,0 μM); (b) Phổ huỳnh quang, L (5,0 μM) C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0 -5,0 μM), bước sóng kích thích 540 nm Hình 3.11 cho thấy, Hg(II) phản ứng làm thay đổi phổ UV-Vis phổ huỳnh quang L Cường độ huỳnh quang dung dịch L giảm dần tăng nồng độ Hg(II) c Khảo sát phản ứng sensor L với ion Hg(II) Hình 3.12 cho thấy, cường độ huỳnh quang dung dịch L giảm mạnh nồng độ ion Hg(II) tăng từ đến 5,0 M; sau giảm khơng đáng kể tiếp tục tăng nồng độ ion Hg(II) Điều cho thấy L phản ứng với Hình 3.12 Đồ thị xác định quan hệ tỷ lượng phản Hg(II) theo tỷ lệ mol 1:1 ứng ion Hg(II) với L (L (5,0 M) C2H5OH/H2O (1/9, v/v) pH ~7,4, bước sóng huỳnh quang 585 nm, bước sóng kích thích 540 nm Hình 3.25 (a) Phổ huỳnh quang Hg2L2 (2,5 μM) C 2H5OH/HEPES (pH =7,4, 1/9, v/v) 25 oC thêm amino acids khác (mỗi loại 10 μM), bao gồm Cys, Hcy, GSH, Ala, Asp, Arg, Gly, Glu, ILe, Leu, Lys, Met, Thr, Ser, Tyr, Trp, Val, His (Others: hỗn hợp gồm tất amino acids kể ngoại trừ Cys, Hcy GSH) (b) Cường độ huỳnh quang (ở bước sóng phát quang 585 nm) dung dịch Hg 2L2 (2,5 μM) với nồng độ khác Cys, GSH, Hcy, amino acids khác Kết trình bày Hình 3.25a cho thấy, amino acids có chứa nhóm thiol làm thay đổi mạnh mẽ cường độ huỳnh quang dung dịch Các amino acids khác không chứa nhóm thiol khơng làm thay đổi tín hiệu huỳnh quang dung dịch phức Hg2L2 Điều cho thấy, phức Hg2L2 sensor huỳnh quang để phát chọn lọc biothiol diện amino acids khơng chứa nhóm thiol Kết thí nghiệm Hình 3.25b cho thấy, cường độ huỳnh quang tăng mạnh Cys, tiếp đến GSH, Hcy c Khảo sát sử dụng Hg2L2 phát định lượng Cys Trong khoảng nồng độ Cys từ đến μM, biến thiên cường độ huỳnh quang (F585) quan hệ tuyến tính với nồng độ Cys, thể phương trình F585 = (11,1 ± 5,9) + (133,3 ± 2,0) × [Cys], với R = 14 11 d Khảo sát ảnh hưởng ion kim loại cạnh tranh Mật độ quang 3.1.4 Nghiên cứu sử dụng phức Hg2L2 phát biothiol 3.1.4.1 Nghiên cứu tính tốn lý thuyết từ phản ứng tạo phức Hằng số bền phức xác định phương pháp chuẩn độ huỳnh quang Kết tính tốn xác định số bền phức Hg2L2 1017,45 (M-3) Trong đó, số cân (a) RSH, (2Hg(II) tạo phức Hg(RS)2 từ ion Hg(II) với biothiol + 2RSH = Hg(SR)2 + 2H+, Ka) Cys, GSH, Hcy tương ứng 1020,1; 1020,2 1019,7 Vì vậy, phản ứng Hg2L2 với biothiol (Cys, GSH, Hcy) để tạo thành phức Hg(II) với biothiol giải phóng L tự xảy Kết nghiên cứu mặt nhiệt động tương tác ion Hg(II) với Cysteine (H2Cys) cho thấy, phản ứng (14) xảy có ΔG298 âm (ΔG298 = -821,6 kcal.mol-1) Bước sóng (nm) 2Hg2Cys + Hg(II) + 4OH- [Hg(Cys)2]2+ + 4H2O (14) Sự biến thiên lượng tự phản ứng tạo Hg2L2 từ ion Hg(II) sensor L -410,2 kcal.mol‾1 Do đó, phản ứng sau xảy (vì có ΔG298 -1232 kcal.mol-1): Hg2L2 + H2Cys + 80H- 2Hg(Cys)2 + H20 + 2L 3.1.4.2 Khảo sát thực nghiệm sử dụng phức Hg2L2 làm sensor huỳnh quang phát biothiol a Khảo sát phổ chuẩn độ UV-Vis phổ huỳnh quang Hg2L2 Hình 3.24 Phổ chuẩn độ UV-Vis (a) phổ huỳnh quang (b) dung dịch Hg2 L2 (2,5 μM) C2 H5OH/HEPES (1/9, v/v), pH ~7,4, 25 C thêm 0-10 μM Cys, bước sóng kích thích 540 nm, bước sóng phát huỳnh quang 585 nm Hình 3.13 Phổ UV-Vis (a) phổ huỳnh quang (b) L (1,5 μM) với diện ion kim loại Hg(II), Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I), K(I) (7,5 μM cho ion kim loại) C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, bước sóng kích thích 540 nm Hình 3.13 cho thấy, khơng có thay đổi đáng kể phổ UV-Vis phổ huỳnh quang thêm ion kim loại Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I), K(I) với nồng độ gấp lần so với L Như vậy, L phát chọn lọc ion Hg(II) diện ion e Khảo sát sử dụng sensor L phát định lượng ion Hg(II) Trong khoảng nồng độ ion Hg(II) từ đến 400 μg/L: biến thiên mật độ quang (ΔA540) biến thiên cường độ huỳnh quang (∆I585 ) quan hệ tuyến tính với nồng độ ion Hg(II) phương trình tương ứng: ΔA540= (0,01 ± 0,01) + (0,0011 ± 0,0000) × [Hg(II)], ∆I585= (-1,0 ± 0,4) + (0,3 ± 0,0) × [Hg(II)], với R=0,999 Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp trắc quang tương ứng 15,3 μg/L 51,2 μg/L hay 0,076 μM 0,25 μM phương pháp huỳnh quang tương ứng 11,8 μg/L 39,3 μg/L hay 0,059 μM 0,19 μM 3.1.3 Nghiên cứu lý thuyết ứng dụng sensor L phát ion Hg(II) Hình 3.16 Hình học bền phức Hg2L2 mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ 12 a Nghiên cứu cấu trúc phân tử phức Hg2L2 Kết tính tốn hình thành phức ion Hg(II) L theo tỷ lệ mol 1:1 mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ cho thấy, có cấu trúc hình học bền tìm thấy Hg2L2 thể Hình 3.16 Sự hình thành phức Hg2L2 thuận lợi mặt nhiệt động, với giá trị ∆G298 -410,2 kcal mol-1 Các liên kết tạo phức gồm O25Hg93, O71Hg93, S55Hg93, O26O71 Các liên kết hình thành cho dựa kết tính tốn khoảng cách ngun tử nhỏ đáng kể so với tổng bán kính Van der Waals nguyên tử tham gia liên kết Để khẳng định cấu trúc phức Hg2L2, phân tích AIM tiến hành Kết phân tích cho thấy: có tồn điểm tới hạn liên kết (BCPs) điểm tiếp xúc phối tử O, S với Hg(II), liên kết liên kết cộng hóa trị có tồn điểm tới hạn vòng RCPs tiếp xúc O, S, N, Hg (phức có cấu trúc vịng) Nhằm giải thích tính chất huỳnh quang dựa vào chất electron liên kết, phân tích NBO tiến hành Kết cho thấy, L tự có cấu trúc kiểu: D-hệ liên hợp π-A (phát huỳnh quang); L phức: cặp electron N7 khơng cịn liên hợp vào hệ liên hợp π (cấu trúc D-hệ liên hợp π-A bị phá vỡ), nên có chuyển dịch electron dẫn đến dập tắt huỳnh quang phức b Phân tích đặc tính huỳnh quang phức Hg2L2 Kết tính tốn Bảng 3.8 cho thấy, hình thành phức Hg2L2 dẫn đến chuyển dịch đáng kể mật độ electron từ phối tử L đến ion kim loại Hg(II) trung tâm thu hẹp khoảng cách lượng HOMO LUMO Kết quả, trạng thái kích thích (cường độ dao động lớn 0,5913) từ S0→S2, với đóng góp chủ yếu từ bước chuyển HOMO→LUMO (53,12%), có lượng kích thích nhỏ 1,37 eV Điều dẫn đến bước sóng phát xạ huỳnh quang phức chuyển vùng bước sóng dài, lớn 900 nm Vì vậy, thực tế khơng phát huỳnh quang từ phức Hg2L2 13 Bảng 3.8 Năng lượng kích thích, cường độ dao động MO có liên quan đến q trình kích thích Hg2L2 mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ Bước chuyển MO Năng lượng (eV) S0→S1 201→203 1,29 S0→S2 S0→S3 Bước sóng (nm) 961,2 f 0,0838 S0→S5 4,63 202→203 30,06 202→204 59,58 201→203 1,37 903,4 0,5913 2,41 201→204 3,99 202→203 53,12 202→204 24,77 201→203 1,57 788,7 0,1063 201→204 S0→S4 Tỷ lệ % đóng góp 201→203 38,83 39,46 1,59 778,5 0,0647 32,24 201→204 43,20 202→204 3,52 197→203 1,93 642,3 0,0183 2,66 199→203 50,52 199→204 10,31 200→203 25,64 S0→S5 201→205 2,29 S0→S6 198→204 199→203 1,95 636,4 0,0121 2,30 19,80 199→204 2,57 200→204 27,67 ... hợp số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất cyanine coumarin để xác định biothiol Hg(II) " Những đóng góp luận án: - Sensor L thiết kế từ dẫn xuất cyanine công bố, phát chọn lọc ion Hg(II) dựa phản... Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng ứng dụng sensor AMC từ dẫn xuất coumarin để phát chọn lọc biothiol: + Nghiên cứu lý thuyết thiết kế, tổng hợp sensor AMC phản ứng sensor AMC với biothiol. .. μM 3.2 Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng ứng dựng sensor huỳnh quang AMC từ dẫn xuất coumarin phát biothiol dựa phản ứng cộng Michael 3.2.1 Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor AMC phản ứng sensor