Thiết kế, tổng hợp một số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất của cyanine và coumarin để xác định biothiol và Hg(II) tt

24 (c) Các sensor huỳnh quang Hg2L2 AMC phát Cys dung dịch với lượng nhỏ dung môi hữu cơ, thời gian phản ứng xảy nhanh, phát Cys với nồng độ thấp nội bào thấp so với sensor công bố Đã sử dụng phương pháp TD-DFT để nghiên cứu đặc tính huỳnh quang chất dựa hình học tối ưu trạng thái trạng thái kích thích; kết hợp với sử dụng phương pháp phân tích NBO để xem xét biến đổi đặc tính huỳnh quang chất dựa nghiên cứu chất liên kết Kết tính tốn cho thấy, ion Hg(II) gây nên phản ứng tạo phức với L dẫn đến làm giảm khoảng cách lượng HOMO LUMO, đồng thời làm thay đổi hệ liên hợp electron π, nguyên nhân dẫn đến dập tắt huỳnh quang phức Hg2L2 Sự phát xạ huỳnh quang AMC, AMCCys, AMC-Hcy AMC-GSH xuất phát từ trạng thái kích thích electron mức cao (S2, S4) trạng thái S0 Đây trường hợp ngoại lệ quy tắc Kasha MỞ ĐẦU Glutathione (GSH), Cysteine (Cys) Homocysteine (Hcy) là hợp chất thiol, đóng vai trị quan trọng q trình sinh học Mức độ bất thường biothiol có liên quan đến nhiều loại bệnh Thủy ngân chất gây ô nhiễm nguy hiểm phổ biến, ảnh hưởng nghiêm trọng sức khỏe người Vì vậy, việc xác định biothiol tế bào, hàm lượng thủy ngân nguồn nước quan trọng chẩn đoán sớm bệnh liên quan, bảo vệ môi trường sống thu hút quan tâm nhà khoa học ngồi nước Có nhiều phương pháp áp dụng phát biothiol ion Hg(II) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), phương pháp phổ khối lượng (MS),…,và phương pháp huỳnh quang Trong đó, phương pháp huỳnh quang có nhiều ưu điểm hơn, khơng địi hỏi thiết bị máy móc đắt tiền, dễ thực hiện, tốn kém, áp dụng phân tích cho nhiều đối tượng, đặc biệt phân tích chất tế bào sống Phương pháp huỳnh quang Giáo sư Anthony W Czarnik Đại học Quốc gia Ohio nghiên cứu đề xuất cách tiếp cận lĩnh vực sensor quang học vào năm 1992 Với ưu phương pháp huỳnh quang, nên nhiều năm qua, nghiên cứu sensor huỳnh quang nhằm phát ion kim loại, anion, đặc biệt phân tử sinh học thu hút quan tâm nhà khoa học nước với số lượng sensor huỳnh quang công bố ngày nhiều giới Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sensor huỳnh quang năm 2007 tác giả Dương Tuấn Quang Để xác định biothiol, nghiên cứu thiết kế sensor huỳnh quang dựa phản ứng đặc trưng biothiol, phản ứng trao đổi phức (phức chất huỳnh quang với ion Cu(II)…) Các nghiên cứu sensor huỳnh quang phát ion Hg(II) dựa phản ứng đặc trưng ion Hg(II) dựa phản ứng tạo phức ion Hg(II) với phối tử -O, -N, -S vòng mạch hở 2 Tuy nhiên, đa phần sensor tồn số hạn chế sử dụng lượng lớn dung mơi hữu cơ, giới hạn phát cịn cao, có bước sóng phát xạ ngắn gây ảnh hưởng đến tế bào, phản ứng sensor với chất phân tích xảy chậm Hiện nay, nhà khoa học giới tiếp tục nghiên cứu thiết kế sensor huỳnh quang có độ nhạy độ chọn lọc cao để phát biothiol ion Hg(II) Hiện nay, hố tính tốn trở thành cơng cụ quan trọng nghiên cứu hố học nói chung nghiên cứu sensor huỳnh quang nói riêng Sự kết hợp hóa tính tốn với nghiên cứu thực nghiệm hướng nghiên cứu đại Tuy nhiên, cịn sensor huỳnh quang nghiên cứu theo hướng công bố Trước thực trạng trên, thực đề tài: "Thiết kế, tổng hợp số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất cyanine coumarin để xác định biothiol Hg(II) " Những đóng góp luận án: - Sensor L thiết kế từ dẫn xuất cyanine công bố, phát chọn lọc ion Hg(II) dựa phản ứng tạo phức, hoạt động theo kiểu ON-OFF; phức chất Hg(II) với L (Hg2 L2) phát chọn lọc Cys dựa phản ứng trao đổi phức, hoạt động theo kiểu tắt-bật (OFF-ON) Giới hạn phát giới hạn định lượng ion Hg(II) L tương ứng 11,8 μg/L 39,3 μg/L hay 0,059 μM 0,19 μM; giới hạn phát giới hạn định lượng Cys Hg2 L2 tương ứng 0,2 μM 0,66 μM - Sensor AMC thiết kế từ dẫn xuất coumarin công bố, phát chọn lọc Cys dựa phản ứng cộng Michael, hoạt động theo kiểu dựa biến đổi tỷ lệ cường độ huỳnh quang hai bước sóng Giới hạn phát giới hạn định lượng Cys xác định tương ứng 0,5 μM 1,65 μM - L AMC nghiên cứu kết hợp linh hoạt nghiên cứu tính tốn hóa lượng tử với nghiên cứu thực nghiệm CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nghiên cứu sensor huỳnh quang 1.1.1 Tình hình nghiên cứu sensor huỳnh quang 23 NHỮNG KẾT LUẬN CHÍNH CỦA LUẬN ÁN Đã kết hợp linh hoạt tính tốn hóa học lượng tử nghiên cứu thực nghiệm để nghiên cứu phát triển thành công hai sensor huỳnh quang L AMC Sự kết hợp linh hoạt giảm đáng kể khối lượng tính toán lý thuyết thực nghiệm, tiết kiệm thời gian chi phí hóa chất sử dụng, tăng khả thành công, làm sáng tỏ chất trình, tạo sở khoa học cho nghiên cứu Các phản ứng tổng hợp sensor L sensor AMC nghiên cứu dự đoán từ tính tốn khẳng định từ kết tổng hợp thực nghiệm sau Cấu trúc, đặc tính sensor L sensor AMC xác định mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ với kết đáng tin cậy, thông qua kiểm tra, đối chiếu khẳng định từ kết thực nghiệm (a) Sensor L phát chọn lọc ion Hg(II) có mặt ion kim loại khác, hoạt động theo kiểu bật-tắt huỳnh quang Giới hạn phát giới hạn định lượng ion Hg(II) theo phương pháp trắc quang 0,076 μM 0,25 μM; theo phương pháp huỳnh quang 0,059 μM 0,19 μM Phức Hg2L2 phát chọn lọc Cys diện amino acids khơng có nhóm thiol, hoạt động theo kiểu tắt-bật huỳnh quang Giới hạn phát giới hạn định lượng Cys tương ứng 0,2 μM 0,66 μM Sensor L phát ion Hg(II) phức Hg2L2 phát Cys dựa phản ứng trao đổi phức ion trung tâm Hg(II) với hai phối tử L Cys (b) Sensor AMC phát chọn lọc biothiol (Cys, GSH, Hcy) diện amino acids khơng có nhóm thiol, hoạt động dựa biến đổi tỉ lệ cường độ huỳnh quang hai bước sóng Giới hạn phát giới hạn định lượng Cys tương ứng 0,5 μM 1,65 μM Sensor AMC phản ứng với biothiol (Cys, GSH, Hcy) theo chế phản ứng AMC cộng Michael 22 Đối với AMC-Cys, trình chuyển electron từ S1 S0 cấu hình REES1 cấu hình REES2 bị cấm Trong đó, trình chuyển electron từ S2 S0 cấu hình REES1 cấu hình REES2 AMC-Cys xảy Thêm vào đó, cường độ dao động (f) hai trình lớn, cường độ dao động (f) bước sóng 340,3 nm 0,5122, lớn bước sóng 324,5 nm 0,3171; điều dẫn đến cường độ huỳnh quang AMC-Cys quan sát thực nghiệm mạnh, bước sóng dài 340,3 nm mạnh nhiều so với bước sóng ngắn 324,5 nm Ngồi ra, q trình chuyển electron từ S2 S1 cấu hình REES1, với cấu hình S2 tương ứng khơng phải cấu hình có lượng cực tiểu, nên q trình (6) Hình 3.48b chiếm ưu so với trình (4) Hình 3.48b Đó nguyên nhân khác dẫn đến cường độ huỳnh quang bước sóng dài (340,3 nm) mạnh nhiều so với bước sóng ngắn (324,5 nm) quan sát thực nghiệm Đối với AMC-Hcy AMC-GSH (tương tự AMC-Cys) Như trình bày, kết nghiên cứu hình học tối ưu trạng thái kích thích AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy AMCGSH cho thấy, sensor AMC, có xoắn góc mạnh tiểu phần coumarin tiểu phần acryloxy cấu hình REES1 REES2, điều dẫn đến phá vỡ hệ thống electron π liên hợp hai tiểu phần, kéo theo mật độ electron tiểu phần coumarin tiểu phần acryloxy bị phân tách mạnh Kết có xen phủ MO bước chuyển đổi electron trạng thái kích thích sensor AMC Ngược lại, REES2 AMC-Cys, AMC-Hcy AMC-GSH, tiểu phần coumarin tiểu phần acryloxy nằm mặt phẳng Đây yếu tố thuận lợi cho xen phủ MO bước chuyển đổi trạng thái Những phân tích cho thấy, phát huỳnh quang sensor AMC sản phẩm cộng với biothiol khơng bắt nguồn từ trạng thái S1 Đây trường hợp ngoại lệ quy tắc Kasha 1.1.2 Nguyên lý hoạt động sensor huỳnh quang 1.1.3 Cấu tạo sensor huỳnh quang 1.1.4 Nguyên tắc thiết kế sensor huỳnh quang 1.2 Vai trò biothiol tế bào phương pháp phát 1.2.1 Các biothiol vai trò chúng 1.2.2 Phương pháp phát biothiol 1.3 Nguồn ô nhiễm, độc tính, phương pháp phát ion Hg(II) 1.3.1 Nguồn nhiễm, độc tính ion Hg(II) 1.3.2 Phương pháp phát ion Hg (II) 1.4 Sensor huỳnh quang phát biothiol 1.4.1 Dựa phản ứng tạo vòng với aldehyde 1.4.2 Dựa phản ứng cộng Michael 1.4.3 Dựa phản ứng ghép nối peptide 1.4.4 Dựa phản ứng xếp lại nhóm nhân thơm 1.4.5 Dựa phản ứng phân tách sulfonamide ester sulfonate ester thiol 1.4.6 Dựa phản ứng phân tách disulfides thiol 1.4.7 Dựa phản ứng hình thành phân hủy phức 1.4.8 Dựa chế khác 1.5 Sensor huỳnh quang phát ion Hg(II) 1.5.1 Dựa phản ứng tạo phức với ion Hg(II) 1.5.2 Dựa phản ứng đặc trưng ion Hg(II) 1.6 Sensor huỳnh quang phát biothiol ion Hg(II) dựa fluorophore cyanine coumarin 1.7 Tổng quan ứng dụng hóa học tính toán nghiên cứu sensor huỳnh quang CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 2.2 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng ứng dụng sensor huỳnh quang L từ dẫn xuất cyanine để phát chọn lọc biothiol ion Hg(II): 21 + Nghiên cứu lý thuyết thiết kế, tổng hợp đặc trưng sensor L + Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng ứng dụng sensor L + Nghiên cứu lý thuyết ứng dụng sensor L phát ion Hg(II) + Nghiên cứu sử dụng phức (tạo ion Hg(II) với sensor L) phát biothiol Trong đó, nghiên cứu lý thuyết tiến hành trước để định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng phức - Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng ứng dụng sensor AMC từ dẫn xuất coumarin để phát chọn lọc biothiol: + Nghiên cứu lý thuyết thiết kế, tổng hợp sensor AMC phản ứng sensor AMC với biothiol + Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng ứng dụng sensor AMC + Nghiên cứu lý thuyết đặc tính ứng dụng sensor AMC 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu tính tốn lý thuyết - Việc xác định cấu trúc hình học bền, lượng điểm đơn thực phương pháp DFT B3LYP/LanL2DZ, sử dụng phần mềm Gaussian 03 - Các thông số lượng tương tác hiệu chỉnh ZPE gồm biến thiên entanpi biến thiên lượng tự Gibbs phản ứng tính tốn dựa khác biệt tổng lượng sản phẩm tổng lượng chất tham gia - Tính tốn trạng thái kích thích yếu tố phụ thuộc thời gian thực phương pháp TD-DFT mức lý thuyết - Các phân tích AIM NBO tiến hành mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm quang AMC nhỏ quan sát thực nghiệm Ngồi ra, q trình kích thích từ S0→S1 (q trình (1) Hình 3.48a) có cường độ dao động lớn nhiều so với q trình kích thích từ S0→S2 (quá trình (2) Hình 3.48a), nên trình chuyển electron từ S1 S0 (quá trình (3) Hình 3.48a) chiếm ưu từ S2 S0 (q trình (4) Hình 3.48a) Điều nguyên nhân dẫn đến cường độ huỳnh quang bước sóng dài (469,5 nm) mạnh cường độ huỳnh quang bước sóng ngắn (417,4 nm) quan sát thực nghiệm (a) (b) (c) (d) Hình 3.48 Giản đồ lượng q trình kích thích giải phóng lượng kích thích hình học bền trạng thái (RGS) trạng thái kích thích electron (REES1, REES2, ) mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ: (a) AMC; (b) AMC-Cys; (c) AMC-Hcy; (d) AMC-GSH 20 3.2.3.2 Nghiên cứu lý thuyết phổ kích thích phổ huỳnh quang a Nghiên cứu lý thuyết phổ kích thích Từ kết tính tốn cho thấy, sensor AMC, bước chuyển electron singlet từ trạng thái S0 lên trạng thái kích thích S1 bước chuyển chính, với cường độ dao động (f) lớn 0,5348, bước sóng 320,9 nm Bước chuyển trạng thái S0→S1 chủ yếu đóng góp bước chuyển electron từ HOMO→LUMO, với tỷ lệ đóng góp lên đến 96,21% Bên cạnh đó, xen phủ HOMO LUMO lớn, điều cho thấy việc chuyển electron từ HOMO sang LUMO thuận lợi Các bước chuyển trạng thái khác có cường độ dao động (f) nhỏ khơng đáng kể Trong đó, với AMC-Cys, AMC-Hcy, AMC-GSH, số liệu tính tốn cho thấy, bước chuyển electron singlet từ trạng thái S0 lên trạng thái kích thích S2 bước chuyển chính, với cường độ dao động (f) 0,3723; 0,3694 0,3801 (lớn nhiều so với bước chuyển khác), bước sóng tương ứng 300,6; 300,4 300,7 nm Trong bước chuyển trạng thái này, bước chuyển electron từ HOMO-1→LUMO bước chuyển chính, với tỷ lệ đóng góp tương ứng 89,17; 89,05 89,24% Mặt khác, xen phủ HOMO-1 LUMO lớn, nên việc chuyển electron từ HOMO-1 lên LUMO thuận lợi Các bước chuyển trạng thái khác có cường độ dao động (f) nhỏ khơng đáng kể Kết phân tích MO biên cho thấy, khơng có xen phủ HOMO HOMO-1 Do đó, AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy AMC-GSH khơng xảy trình PET từ HOMO đến HOMO-1 Kết quả, chất AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy AMCGSH phát huỳnh quang trình bày thực nghiệm b Nghiên cứu lý thuyết phổ huỳnh quang Đối với sensor AMC, cấu hình REES1, trình chuyển electron từ S1 S2 S0 bị cấm Tại cấu hình REES2, trình chuyển electron từ S1 S2 S0 xảy Thêm vào đó, cường độ dao động (f) hai trình (3) (4) lớn không đáng kể (0,0137 0,0152), điều dẫn đến cường độ huỳnh - Đặc trưng cấu trúc chất khẳng định phổ 1H -NMR, phổ 13C- NMR, phổ khối MS - Đặc tính, ứng dụng sensor thực phương pháp quang phổ huỳnh quang UV-Vis - Các điều kiện tổng hợp sensor nghiên cứu dựa kết dự đoán từ tính tốn lý thuyết kết thực nghiệm công bố trước phản ứng tương tự [2], [3], [29] Quy trình tổng hợp sensor tóm tắt sau: a Tổng hợp sensor L * Tổng hợp CBZT 2-methylbenzothiazole (3,0 g, 0,02 mol) acid bromoacetic (4,18 g, 0,03 mol) hòa tan 50 mL ethanol tuyệt đối Hỗn hợp phản ứng đun hồi lưu Sau để nguội đến nhiệt độ phòng thu kết tủa Rửa kết tủa nhiều lần với ethanol môi trường kiềm, sau làm khơ thu chất rắn CBTZ (khoảng 4,0 g với hiệu suất 75%) * Tổng hợp sensor L CBTZ (290mg,1mmol) 4-diethylamino-2hydroxybenzaldehyde (190 mg, mmol) hòa tan 30 mL ethanol tuyệt đối Thêm giọt piperidine, dung dịch phản ứng chuyển sang màu đỏ Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng 10 giờ, sau làm ngi đến nhiệt độ phịng Lọc lấy kết tủa, rửa nhiều lần diethyl ether sau làm khơ thu sản phẩm L (khoảng 3,0 g, với hiệu suất khoảng 38%) b Tổng hợp AMC Hòa tan 4-methyl-7-hydroxylcoumarin (1,7 g, 9,4 mmol) Et3N (7,9 mL, 56,4 mmol) CH2Cl2 (20 mL), thêm lượng nhỏ chất xúc tác 4-dimethylaminopyridine, thu dung dịch Làm lạnh giữ dung dịch phản ứng nhiệt độ oC Thêm từ từ (trong khoảng thời gian giờ) vào dung dịch phản ứng giọt dung dịch acryloyl chloride (1,9 mL, 23,5 mmol) CH2Cl2 (20 mL) Sau đó, khuấy dung dịch phản ứng nhiệt độ phòng Thêm nước vào dung dịch thu để hòa tan muối amine Tiếp tục rửa pha hữu thu nước, sau làm khô pha hữu 19 muối MgSO4 khan Làm bay dung môi hữu máy quay chân khơng Sản phẩm sau tinh chế cách kết tinh lại ethanol, thu chất rắn kết tinh màu trắng, khối lượng khoảng gam, hiệu suất khoảng 45% CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng ứng dụng sensor L từ dẫn xuất cyanine phát biothiol ion Hg(II) dựa phản ứng tạo phức 3.1.1 Nghiên cứu lý thuyết thiết kế, tổng hợp, đặc trưng sensor L 3.1.1.1 Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor L Mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ áp dụng cho hệ nghiên cứu Các dẫn xuất cyanine bao gồm R2N+=CH[CH=CH]n-NR2, + Aryl=N =CH[CH=CH]n-NR2, Aryl=N+=CH[CH=CH]n-N=Aryl, dạng có cấu trúc donor - hệ liên hợp π - acceptor Trong đó, donor (nhóm đẩy electron) nhóm amino; aceptor (nhóm rút electron) ion amoni Chúng biết đến hợp chất màu, phát huỳnh quang mạnh [40] Sensor L dự kiến thiết kế theo sơ đồ tổng hợp sau: huỳnh quang dung dịch gồm AMC + biothiol + amino acids với dung dịch gồm AMC + biothiol (Hình 3.38b) Fluorophore HO HO S BZT S BrCH2COOH N (I) OHC - O2C CBZT N S N N N (II) - O2C L Receptor Hình 3.1 Sơ đồ thiết kế tổng hợp sensor L Trong fluorophore cyanine, receptor nhóm -COO-, nhóm có lực mạnh với ion Hg(II); phản ứng tổng hợp L thực qua hai giai đoạn: giai đoạn (I) giai đoạn (II) Hình 3.38 (a) Phổ huỳnh quang AMC (10 μM, C H5 OH/HEPES, pH =7,4, 1/4, v/v, 25 o C) thêm Cys, Hcy, GSH, amino acids khác (bao gồm Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr and Val); (b)Phổ huỳnh quang AMC (10 μM, C 2H5 OH/HEPES, pH =7,4, 1/4, v/v, 25 oC) diện hỗn hợp amino acids (bao gồm Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr Val) thêm Cys, Hcy GSH d Khảo sát sử dụng sensor AMC phát định lượng Cys Trong khoảng nồng độ Cys từ đến 10 μM, tỷ lệ cường độ huỳnh quang hai bước sóng 450 375 nm (F450/375) có quan hệ tuyến tính với nồng độ Cys theo phương trình: F450/375 = 1,5431 + 2,257 × [Cys], với R = 0,982 Giới hạn phát giới hạn định lượng Cys xác định tương ứng 0,5 μM 1,65 μM 3.2.3 Nghiên cứu lý thuyết đặc tính ứng dụng AMC 3.2.3.1 Hình học tối ưu AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy AMC-GSH trạng thái trạng thái kích thích electron Đối với sensor AMC, trạng thái S0, tiểu phần coumarin acryloxy gần đồng phẳng Trong đó, trạng thái kích thích electron S1(REES1) S2(REES2), tiểu phần coumarin acryloxy gần hai mặt phẳng vng góc với Đối với AMC-Cys, AMC-Hcy AMC-GSH, cấu hình S0(RGS) S1(REES1), có xoắn góc tiểu phần coumarin acryloxy Trong đó, cấu hình S2(REES2), tiểu phần coumarin acryloxy gần đồng phẳng 18 Trong đó, dung dịch sensor AMC tự hiển thị dải phát xạ huỳnh quang vai với hai đỉnh cực đại bước sóng 375 nm 450 nm (Hình 3.33b) Hiệu suất lượng tử huỳnh quang (Φ) sensor AMC xác định 0,05 Khi thêm Cys vào dung dịch sensor AMC, cường độ huỳnh quang tăng dần hai đỉnh phát xạ Trong đó, cường độ phát xạ huỳnh quang bước sóng dài tăng mạnh cường độ phát xạ huỳnh quang bước sóng ngắn Sự thay đổi cường độ huỳnh quang hai bước sóng 375 450 nm dẫn đến khả sử dụng AMC để làm sensor huỳnh quang hoạt động dựa biến đổi tỷ lệ cường độ huỳnh quang hai bước sóng để xác định Cys b Khảo sát phản ứng sensor AMC với Cys Khi thêm Cys từ đến 10 μM vào dung dịch AMC (10 μM), tỷ lệ cường độ huỳnh quang hai bước sóng 450 375 nm (F450/375) có quan hệ tuyến tính chặt chẽ với nồng độ Cys Sau đó, tỷ lệ thay đổi không đáng kể tiếp tục tăng nồng độ Cys Điều cho thấy phản ứng AMC với Cys xảy theo tỷ lệ mol 1:1 (tương tự Hcy GSH) Kết phù hợp với kết thu xác định hệ số tỷ lượng phản ứng AMC với Cys phương pháp đồng phân tử gam phân tích phổ khối lượng sản phẩm phản ứng AMC Cys c Khảo sát ảnh hưởng amino axit cạnh tranh Kết khảo sát cho thấy, bổ sung amino acids có chứa thiol, cường độ huỳnh quang dung dịch AMC tăng lên rõ rệt hai dải phát xạ, tăng mạnh mẽ bước sóng 450 nm tăng vừa phải bước sóng phát xạ 375 nm Tuy nhiên, mức độ gia tăng cường độ huỳnh quang theo thứ tự sau: Cys> GSH> Hcy (Hình 3.38a) Đối với amino acids khác khơng có chứa nhóm thiol khơng làm thay đổi cường độ huỳnh quang dung dịch sensor AMC (Hình 3.38a) Sự có mặt amino acids khơng làm ảnh hưởng đến phản ứng biothiol (Cys, GSH Hcy) với AMC, chứng không xuất khác biệt đáng kể phổ Phản ứng ghép nối receptor vào fluorophore, phản ứng số (I) dựa phản ứng 4-metyl quinoline dẫn xuất acid carboxylic [29], phản ứng ghép nối tạo fluorophore, phản ứng số (II) dựa phản ứng phản ứng cộng andol ngưng tụ croton [3] a Khảo sát phản ứng giai đoạn (I) S S S Br- BrCH2 COOH BZT CH3CH2 OH S (1) Br- (6) CH3CH2 OH2+ N+ N + N+ N CBZT-1 COOH COOH Br- S S COO- CBZT-3 HBr (2) BrCH2 COOH CBZT + N N S BZT N+ S S COOH Br- N+ N H3O+ Br- (7) H2O Br- (8) CBZT S S S COO- CBZT-3 CBZT-3 COOH Br OH- S (4) BrCH2 COOH N+ N N+ Br- CBZT-4 COOH BZT S N+ (3) BrCH2 COOH BZT H 2O COO- CBZT-2 COOH Br- Br S S N+ CBZT-3 (5) BrCH2 COOH COOCBZT N N CBZT-5 COOH BZT Hình 3.3 Các phản ứng hình thành CBZT từ CBZT-3 Hình 3.2 Các sản phẩm có từ phản Phản ứng hình thành CBZT từ BZT acid bromoacetic trình bày Hình 3.2 3.3 Kết tính tốn cho thấy, phản ứng BZT với acid bromoacetic để hình thành CBZT-3 phản ứng CBZT-3 dung dịch kiềm để hình thành CBZT thuận lợi mặt nhiệt động b Khảo sát phản ứng giai đoạn (II) Phản ứng hình thành L từ CBZT với DHB tạo (9) sản phẩm (Hình 3.5) Kết L-1 tính tốn cho thấy, biến (10) thiên lượng tự Gibbs L-2 (∆G298) phản ứng (12) âm Theo đó, phản ứng CBZT với DHB theo CBZT DHB (11) hướng hình thành sản phẩm L L-3 thuận lợi mặt nhiệt động ứng BZT với acid bromoacetic HO S N H2O N H2O N H2O N H2O (12) N+ COO- S HO N+ S OHC N COO- N+ COO- HO HO S N+ COO- S N+ COO- HO L Hình 3.5 Các sản phẩm phản ứng hình thành CBZT với DHB 17 3.1.1.2 Nghiên cứu lý thuyết đặc tính L a Cấu trúc phân tử L Chiều dài liên kết, số đo góc liên kết, góc nhị diện L tính tốn Trong đó, tiểu phần BZT, acid bromacetic DHB thay đổi so với ban đầu Trong L có hình thành liên kết N7 C11 Hình 3.6 Hình học bền L mức lý thuyết liên kết đôi nguyên B3LYP/LanL2DZ tử C10 nguyên tử C12 b Phân tích phổ UV-Vis sensor Phổ UV-Vis sensor L đạt cực đại bước sóng 452,6 nm Trong công bố trước đây, chất BZTVPA có cấu trúc tương tự sensor L có bước sóng hấp thụ cực đại 405 nm, chất phát xạ huỳnh quang mạnh bước sóng 495 nm Kết dẫn đến kỳ vọng đặc tính huỳnh quang L tương tự BZTVPA c Phân tích đặc tính huỳnh quang sensor L ester tạo acid acrylic ancol (thường fluorophore), ban đầu tạo thioether, hình thành hợp chất dị vòng trường hợp Cys Hcy Trong đó, thioether GSH thường bền, khơng xảy q trình tạo hợp chất vịng sau Khác với nghiên cứu trên, kết tính tốn mặt nhiệt động cho thấy, phản ứng sensor AMC với biothiol (bao gồm Cys, Hcy GSH) để hình thành thioether theo tỉ lệ mol 1:1 thuận lợi mặt nhiệt động 3.2.2 Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng ứng dụng AMC 3.2.2.1 Thực nghiệm tổng hợp sensor AMC Sau tổng hợp, cấu trúc sản phẩm AMC khẳng định phổ 1H-NMR phổ FAB-MS 3.2.2.2 Nghiên cứu thực nghiệm đặc tính ứng dụng sensor AMC a Khảo sát phổ hấp thụ phổ huỳnh quang sensor AMC Bảng 3.5 Năng lượng kích thích, cường độ dao động MO có liên quan đến q trình kích thích L mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ Bước MO Năng lượng Bước sóng f Tỷ lệ % chuyển (eV) (nm) đóng góp S0→S1 95→97 2,53 489,8 0,2566 56,44 96→97 S0→S2 S0→S3 S0→S4 93→97 35,80 2,74 452,6 0,5626 29,22 95→97 28,63 96→97 28,66 92→97 2,86 432,9 0,0097 5,90 93→97 8,83 94→97 77,56 92→97 93→97 3,00 413,2 0,5815 5,42 49,94 Hình 3.33 Phổ hấp thụ phổ huỳnh quang sensor AMC: (a) Phổ hấp thụ, AMC (10 μM) C 2H 5OH/HEPES (pH=7,4, 1/4, v/v) 25 C thêm 20 μM Cys; (b) Phổ huỳnh quang, AMC (10 μM) thêm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 μM Cys C2H 5OH/HEPES (pH =7,4, 1/4, v/v) 25 C, bước sóng kích thích 320 nm Hình 3.33a cho thấy, phổ hấp thụ dung dịch sensor AMC tự đạt cực đại bước sóng 275 320 nm Khi thêm Cys vào dung dịch sensor AMC, phổ hấp thụ thay đổi không đáng kể 16 0,998 Giới hạn phát giới hạn định lượng xác định tương ứng 0,2 μM 0,66 μM 3.2 Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng ứng dựng sensor huỳnh quang AMC từ dẫn xuất coumarin phát biothiol dựa phản ứng cộng Michael 3.2.1 Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor AMC phản ứng sensor AMC với biothiol 3.2.1.1 Nghiên cứu lý thuyết thiết kế tổng hợp sensor AMC Hợp chất 4-methyl-7-hydroxycoumarin hấp thụ cực đại bước sóng 359 nm phát xạ cực đại bước sóng 449 nm [159] Để thiết kế sensor huỳnh quang AMC (7- acryloyl -4metylcouramin) từ dẫn xuất coumarin dùng để phát biothiol dựa phản ứng cộng Michael, hợp chất 4-methyl-7hydroxylcoumarin chọn làm fluorophore, cịn receptor acryloyl chloride, phản ứng gắn receptor lên fluorophore dễ dàng thực thông qua phản ứng ester hóa nhóm phenol với dẫn xuất axit [2] receptor gây phản ứng cộng với biothiol Sensor AMC dự kiến thiết kế theo sơ đồ tổng hợp sau: + Fluorophore Cl O O (B) O O OH (A) O O O + HCl Bước chuyển MO Năng lượng (eV) Bước sóng (nm) f 94→97 S0→S5 95→97 9,35 96→97 11,07 92→97 3,05 406,0 0,0060 86,61 3,92 316,7 0,0051 44,35 93→97 S0→S6 Tỷ lệ % đóng góp 10,62 90→97 7,68 91→97 41,32 96→97 8,40 Kết tính tốn (Bảng 3.5) cho thấy, trạng thái kích thích có cường độ dao động lớn S0→S1, S0→S2 bước sóng tương ứng 489,8 nm 452,6 nm có đóng góp lớn (tương ứng 35,80% 28,66%) bước chuyển electron từ MO-96 lên MO-97 Do MO liên tiếp, nên khơng có q trình PET can thiệp đến bước chuyển Kết dẫn đến kỳ vọng L hợp chất phát huỳnh quang 3.1.2 Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng ứng dụng sensor L 3.1.2.1 Thực nghiệm tổng hợp L Sau tổng hợp, cấu trúc sản phẩm CBZT L khẳng định phổ 1H-NMR, 13C-NMR phổ FAB-MS 3.1.2.2 Khảo sát thực nghiệm ứng dụng sensor L phát ion Hg(II) a Khảo sát phổ UV-Vis phổ huỳnh quang sensor L AMC Receptor Hình 3.29 Sơ đồ thiết kế tổng hợp sensor AMC Kết tính tốn cho thấy, ΔG298 phản ứng tổng hợp sensor AMC âm, theo phản ứng tổng hợp sensor AMC thuận lợi mặt nhiệt động 3.2.1.2 Nghiên cứu lý thuyết phản ứng sensor AMC với biothiol Theo kết nghiên cứu công bố trước đây, phản ứng cộng Michael biothiol (Cys, Hcy GSH) với Hình 3.10 Phổ hấp thụ UV-Vis phổ huỳnh quang L: (a) Phổ UV-Vis, L (5,0 μM) C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4; (b) Phổ huỳnh quang, L (5 μM) C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, bước sóng kích thích 540 nm 10 15 Như dự đốn từ tính tốn, L phát huỳnh quang màu đỏ, với hiệu suất lượng tử huỳnh quang 0,175; bước sóng huỳnh quang cực đại 585 nm, bước sóng hấp thụ cực đại 540 nm b Khảo sát phổ chuẩn độ UV-Vis phổ huỳnh quang sensor L phát ion Hg(II) Hình 3.24 cho thấy, tăng dần Cys vào dung dịch phức Hg2L2: phổ UV-Vis, đỉnh hấp thụ cực đại bước sóng 460 nm biến mất, đồng thời xuất đỉnh hấp thụ cực đại với cường độ hấp thụ mạnh bước sóng 540 nm; phổ huỳnh quang, cường độ huỳnh quang tăng dần trở lại b Khảo sát ảnh hưởng amino acids cạnh tranh phản ứng Hg2L2 với biothiol Hình 3.11 Phổ chuẩn độ UV-Vis phổ huỳnh quang L ion Hg(II): (a) Phổ UV-Vis, L (5,0 μM) C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0 -5,0 μM); (b) Phổ huỳnh quang, L (5,0 μM) C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0 -5,0 μM), bước sóng kích thích 540 nm Hình 3.11 cho thấy, Hg(II) phản ứng làm thay đổi phổ UV-Vis phổ huỳnh quang L Cường độ huỳnh quang dung dịch L giảm dần tăng nồng độ Hg(II) c Khảo sát phản ứng sensor L với ion Hg(II) Hình 3.12 cho thấy, cường độ huỳnh quang dung dịch L giảm mạnh nồng độ ion Hg(II) tăng từ đến 5,0 M; sau giảm khơng đáng kể tiếp tục tăng nồng độ ion Hg(II) Điều cho thấy L phản ứng với Hình 3.12 Đồ thị xác định quan hệ tỷ lượng phản Hg(II) theo tỷ lệ mol 1:1 ứng ion Hg(II) với L (L (5,0 M) C2H5OH/H2O (1/9, v/v) pH ~7,4, bước sóng huỳnh quang 585 nm, bước sóng kích thích 540 nm Hình 3.25 (a) Phổ huỳnh quang Hg2L2 (2,5 μM) C 2H5OH/HEPES (pH =7,4, 1/9, v/v) 25 oC thêm amino acids khác (mỗi loại 10 μM), bao gồm Cys, Hcy, GSH, Ala, Asp, Arg, Gly, Glu, ILe, Leu, Lys, Met, Thr, Ser, Tyr, Trp, Val, His (Others: hỗn hợp gồm tất amino acids kể ngoại trừ Cys, Hcy GSH) (b) Cường độ huỳnh quang (ở bước sóng phát quang 585 nm) dung dịch Hg 2L2 (2,5 μM) với nồng độ khác Cys, GSH, Hcy, amino acids khác Kết trình bày Hình 3.25a cho thấy, amino acids có chứa nhóm thiol làm thay đổi mạnh mẽ cường độ huỳnh quang dung dịch Các amino acids khác khơng chứa nhóm thiol khơng làm thay đổi tín hiệu huỳnh quang dung dịch phức Hg2L2 Điều cho thấy, phức Hg2L2 sensor huỳnh quang để phát chọn lọc biothiol diện amino acids khơng chứa nhóm thiol Kết thí nghiệm Hình 3.25b cho thấy, cường độ huỳnh quang tăng mạnh Cys, tiếp đến GSH, Hcy c Khảo sát sử dụng Hg2L2 phát định lượng Cys Trong khoảng nồng độ Cys từ đến μM, biến thiên cường độ huỳnh quang (F585) quan hệ tuyến tính với nồng độ Cys, thể phương trình F585 = (11,1 ± 5,9) + (133,3 ± 2,0) × [Cys], với R = 14 11 3.1.4 Nghiên cứu sử dụng phức Hg2L2 phát biothiol 3.1.4.1 Nghiên cứu tính toán lý thuyết từ phản ứng tạo phức Hằng số bền phức xác định phương pháp chuẩn độ huỳnh quang Kết tính tốn xác định số bền phức Hg2L2 1017,45 (M-3) Trong đó, số cân tạo phức Hg(RS)2 từ ion Hg(II) với biothiol RSH, (2Hg(II) + 2RSH = Hg(SR)2 + 2H+, Ka) Cys, GSH, Hcy tương ứng 1020,1; 1020,2 1019,7 Vì vậy, phản ứng Hg2L2 với biothiol (Cys, GSH, Hcy) để tạo thành phức Hg(II) với biothiol giải phóng L tự xảy Kết nghiên cứu mặt nhiệt động tương tác ion Hg(II) với Cysteine (H2Cys) cho thấy, phản ứng (14) xảy có ΔG298 âm (ΔG298 = -821,6 kcal.mol-1) 2Hg2Cys + Hg(II) + 4OH- [Hg(Cys)2]2+ + 4H2O (14) Sự biến thiên lượng tự phản ứng tạo Hg2L2 từ ion Hg(II) sensor L -410,2 kcal.mol‾1 Do đó, phản ứng sau xảy (vì có ΔG298 -1232 kcal.mol-1): Hg2L2 + H2Cys + 80H- 2Hg(Cys)2 + H20 + 2L 3.1.4.2 Khảo sát thực nghiệm sử dụng phức Hg2L2 làm sensor huỳnh quang phát biothiol a Khảo sát phổ chuẩn độ UV-Vis phổ huỳnh quang Hg2L2 Hình 3.24 Phổ chuẩn độ UV-Vis (a) phổ huỳnh quang (b) dung dịch Hg2 L2 (2,5 μM) C2 H5OH/HEPES (1/9, v/v), pH ~7,4, 25 C thêm 0-10 μM Cys, bước sóng kích thích 540 nm, bước sóng phát huỳnh quang 585 nm d Khảo sát ảnh hưởng ion kim loại cạnh tranh Hình 3.13 Phổ UV-Vis (a) phổ huỳnh quang (b) L (1,5 μM) với diện ion kim loại Hg(II), Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I), K(I) (7,5 μM cho ion kim loại) C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, bước sóng kích thích 540 nm Hình 3.13 cho thấy, khơng có thay đổi đáng kể phổ UV-Vis phổ huỳnh quang thêm ion kim loại Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I), K(I) với nồng độ gấp lần so với L Như vậy, L phát chọn lọc ion Hg(II) diện ion e Khảo sát sử dụng sensor L phát định lượng ion Hg(II) Trong khoảng nồng độ ion Hg(II) từ đến 400 μg/L: biến thiên mật độ quang (ΔA540) biến thiên cường độ huỳnh quang (∆I585 ) quan hệ tuyến tính với nồng độ ion Hg(II) phương trình tương ứng: ΔA540= (0,01 ± 0,01) + (0,0011 ± 0,0000) × [Hg(II)], ∆I585= (-1,0 ± 0,4) + (0,3 ± 0,0) × [Hg(II)], với R=0,999 Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp trắc quang tương ứng 15,3 μg/L 51,2 μg/L hay 0,076 μM 0,25 μM phương pháp huỳnh quang tương ứng 11,8 μg/L 39,3 μg/L hay 0,059 μM 0,19 μM 3.1.3 Nghiên cứu lý thuyết ứng dụng sensor L phát ion Hg(II) Hình 3.16 Hình học bền phức Hg2L2 mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ 12 a Nghiên cứu cấu trúc phân tử phức Hg2L2 Kết tính tốn hình thành phức ion Hg(II) L theo tỷ lệ mol 1:1 mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ cho thấy, có cấu trúc hình học bền tìm thấy Hg2L2 thể Hình 3.16 Sự hình thành phức Hg2L2 thuận lợi mặt nhiệt động, với giá trị ∆G298 -410,2 kcal mol-1 Các liên kết tạo phức gồm O25Hg93, O71Hg93, S55Hg93, O26O71 Các liên kết hình thành cho dựa kết tính tốn khoảng cách ngun tử nhỏ đáng kể so với tổng bán kính Van der Waals nguyên tử tham gia liên kết Để khẳng định cấu trúc phức Hg2L2, phân tích AIM tiến hành Kết phân tích cho thấy: có tồn điểm tới hạn liên kết (BCPs) điểm tiếp xúc phối tử O, S với Hg(II), liên kết liên kết cộng hóa trị có tồn điểm tới hạn vòng RCPs tiếp xúc O, S, N, Hg (phức có cấu trúc vịng) Nhằm giải thích tính chất huỳnh quang dựa vào chất electron liên kết, phân tích NBO tiến hành Kết cho thấy, L tự có cấu trúc kiểu: D-hệ liên hợp π-A (phát huỳnh quang); L phức: cặp electron N7 khơng cịn liên hợp vào hệ liên hợp π (cấu trúc D-hệ liên hợp π-A bị phá vỡ), nên có chuyển dịch electron dẫn đến dập tắt huỳnh quang phức b Phân tích đặc tính huỳnh quang phức Hg2L2 Kết tính tốn Bảng 3.8 cho thấy, hình thành phức Hg2L2 dẫn đến chuyển dịch đáng kể mật độ electron từ phối tử L đến ion kim loại Hg(II) trung tâm thu hẹp khoảng cách lượng HOMO LUMO Kết quả, trạng thái kích thích (cường độ dao động lớn 0,5913) từ S0→S2, với đóng góp chủ yếu từ bước chuyển HOMO→LUMO (53,12%), có lượng kích thích nhỏ 1,37 eV Điều dẫn đến bước sóng phát xạ huỳnh quang phức chuyển vùng bước sóng dài, lớn 900 nm Vì vậy, thực tế khơng phát huỳnh quang từ phức Hg2L2 13 Bảng 3.8 Năng lượng kích thích, cường độ dao động MO có liên quan đến q trình kích thích Hg2L2 mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ Bước chuyển MO Năng lượng (eV) S0→S1 201→203 1,29 S0→S2 S0→S3 Bước sóng (nm) 961,2 f 0,0838 S0→S5 4,63 202→203 30,06 202→204 59,58 201→203 1,37 903,4 0,5913 2,41 201→204 3,99 202→203 53,12 202→204 24,77 201→203 1,57 788,7 0,1063 201→204 S0→S4 Tỷ lệ % đóng góp 201→203 38,83 39,46 1,59 778,5 0,0647 32,24 201→204 43,20 202→204 3,52 197→203 1,93 642,3 0,0183 2,66 199→203 50,52 199→204 10,31 200→203 25,64 S0→S5 201→205 2,29 S0→S6 198→204 199→203 1,95 636,4 0,0121 2,30 19,80 199→204 2,57 200→204 27,67 24 (c) Sensors Hg2L2 and AMC is for the detection of Cys in a small amount of organic solvent, the reaction time occurs fast can detect Cys with lower concentration than that in the intracellular and lower than that in the similar sensors of previous studies TD-DFT method is used to study the fluorescent properties of substances based on the optimized geometry at the ground state and the excited one in the combination with NBO analysis to consider the the change of the fluorescent properties of substances, based on the nature of bondings The results of calcuations shows that ion Hg(II) creates complexion reactions with L, leading to the decrease in the energy distance between HOMO and LUMO in the meantime change the conjugated π-electron system, which is the cause for the fluorescence quenching in the complextion of Hg2L2 All the fluorescent emission of AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH comes from the higher-lying electron excited states (S2, S4) to the ground state S0 This is an exceptional case of Kasha rule INTRODUCTION Cysteine (Cys), glutathione (GSH), and homocysteine (Hcy) are thiol compounds play vital roles in many biological processes Mercury is one of popular dangerous pollutants which can cause serious effects to human’s health Therefore, that the determination of biothiol in living cells and water sources helps diagnose related diseases and protect habitats and has caught much attention from local and oversea scientists Many methods have been used for the detection of different biothiols and Hg(II) ions like high-performance liquid chromatography, mass spectrometry,…,and fluorescent method Among them, fluorescent method has outstanding benefits than other optical methods in term of investment of less expensive equipments and its simplicity Furthermore, it can be applied to analyze many diffrent substances especially those in living cells Professor Czarnik at Ohio University studied Fluorescent method and proposed a new approach to the field of sphere optical sensor in 1992 With advantages of fluorescent method, studies of fluorescent sensors to detect metal ions, anion, especially biomolecules is paid much attention by many local and oversea scientists, that have announced more and more Fluorescent sensors all over the world In Vietnam, the study of the fluorescent sensors has been conducted by Duong Tuan Quang since 2007 To detect biothiols, the studies have designed fluorescent sensors based on the characterized reaction of biothiol, complex reactions (complex between fluorescence and ion Cu(II) ) The studies of fluorescent sensors detect Hg(II) based on the characterized reaction of ion Hg(II) and complex reactions between ion Hg(II) and legands O,-N,-S in closed and opened circuit However, most of these sensors have shortcomings like the use of a large amount of organic solvents, the limited detection just for high concentration, short excitation/emission wavelengths causing bad effects to living cells and slow reaction between sensors and analytes Now, scientists are 23 continuing to study and design fluorescent sensors with high sensitivity and selectivity to detect biothiols and ions Hg(II) At present, quantum chemical calculations have been become an important tool in chemical studies in general and fluorescent sensors in particular The combination between quantum chemical calculations and experimental studies is a modern trend in which, however, the numbers of studies announced in fluorescent sensors is still limited From demand and situation of studies in the fluorescent sensors in the world and Vietnam, we have conducted the project “Design, synthesis of fluorescent sensors from cyanine and coumarin derivatives to detect biothiol and Hg(II)” New findings of the thesis: - A new fluorescent sensor L designed from derivatives of cyanine which has been reported, selective detection of Hg(II) ions, based on complexation reaction, ON-OFF mechanism; the complex of Hg(II) with L (Hg2L2) selective detection of Cys, based on decomplexation reaction and OFF-ON mechanism The limit of detection and the limit of quantification for Hg(II) ions by L is 11,8 μg/L and 39,3 μg/L or 0,059 μM and 0,19 μM, respectively; limit of detection and limit of quantification Cys by Hg2L2 is 0,2 μM and 0,66 μM, respectively - A new fluorescent sensor AMC designed from derivatives of coumarin which has been reported, selective detection of Cys based on Michael addition reaction, based on the change of ratiometry of fluorescent intensity at two different wavelengths The limit of detection and limit of quantification Cys is 0,5 μM and 1,65 μM, respectively - L and AMC studyed by flexible combination quantum chemical calculations and experimental studies Chapter OVERVIEW 1.1 Overview of fluorescent sensors 1.1.1 Current situation of fluorescent sensors 1.1.2 Operating principles of fluorescent sensors 1.1.3 Structure of fluorescent sensors 1.1.4 Design principles of fluorescent sensors CONCLUSIONS Flexible combination between quantum chemical calculations and experimental studies has been successfully applied for research and development of two new fluorescent sensors including L and AMC This decreases the calculations of the theory and experiment, saving the time and expense for the chemicals, increase the possibility of success, clarify the nature of the proccesses and set ground for the further study Synthesis reactions sensor L and sensor AMC are studied, anticipated from calculations and afterwards verified from the synthesis results The structures, characteristics of sensor L and sensor AMC are determined at theoretical levels of B3LYP/LanL2DZ bringing about reliable results through contrastive tests and verification from experiment results (a) Sensor L is for selective detection of Hg(II) ions, in the presence of ther metal ions, based on fluorescent ON-OFF mechanism The limit of detection and the limit of quantification for Hg(II) ions by colorimetric method is 0,076 μM and 0,25 μM; and by fluorescent method is 0,059 μM and 0,19 μM Complextion of Hg2L2 is for selective detection of Cys in the presence amino acids without thiol groups based on decomplexation reaction and OFF-ON mechanism The limit of detection and the limit of quantification Cys is 0,2 μM and 0,66 μM, respectively Sensor L for the detection of ion Hg(II) and complextion Hg2L2 for the detection of Cys, based on complexation reaction between core ions Hg(II) with two ligands of L and Cys (b) Sensor AMC is for the selective detection of biothiols (Cys, GSH, Hcy) in the presence of amino acids without thiol groups, based on the change of ratiometry of fluorescent intensity at two different wavelengths The limit of detection and limit of quantification Cys is 0,5 μM and 1,65 μM, respectively Sensor AMC reacts with biothiols (Cys, GSH, Hcy) based on Michael addition reaction 22 For AMC-Cys, electron transitions from S1 to S0 at REES1 and R are forbid Meanwhile, electron transitions from S2 to S0 at REES1 and REES2 occur In addition, because the oscillator intensity (f) of both processes are very large, while the oscillator intensity (f) at the wavelength of 340,3 nm is 0,5122, and obviously 0,3171 larger than that at the wavelength of 324,5 nm This leads to the fact that fluorescence intensity of AMC-Cys observed in experiment is very strong, and that at the long wavelengths of 340,3 nm is stronger than short wavelengths of 324,5 nm Besides, because the transitions processes of electron from S2 to S1 at REES1, with the S2 respectively not have minimum energy, so processes (6) at Fig.3.48b is less dominant than processes (4) at Fig.3.48b That may be another cause leading to fluorescence intensity at long wavelengths (340,3 nm) which is very stronger than the fluorescence intensity at short wavelengths (324,5 nm) as observed in experiment This may be another cause to make fluorescence intensity at long wavelengths (469,5 nm) stronger than that at short wavelengths (417,4 nm), as observed in the experiment For AMC-Hcy and AMC-GSH (similarly, AMC-Cys) As presented, the research results on optimum geometry with excited states of AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH show that for AMC, there are twist angles between the coumarin moieties and acryloxy moieties at REES1 and REES2, causing the breakdown of the πelectron conjugate system between two moieties, which in turn leads to the fact that the electron density between the coumarin moieties and acryloxy moieties is strongly fragmented As a result, there is very little overlap between the MOs in electron transfer at the excitation state of the sensor AMC In contrast, at REES2 of AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH, the coumarin moiety and acryloxy moiety are almost in the same plane This is a favorable factor for the overlap between MOs in the state transitions The above analysis shows that the fluorescence of the sensor AMC and its additive products with the biothiolis are not derived from the S1 state This is an exceptional case of Kasha rule 1.2 Roles of biothiols in cells and methods for detection 1.2.1 Biothiol and roles of them 1.2.2 Method for detection of biothiols 1.3 The sources of pollution, toxicities and methods for detection of Hg(II) ions 1.3.1 The sources of pollution, toxicities of Hg(II) ions 1.3.2 Method for detection of Hg(II) ions 1.4 Fluorescent sensors for detection of biothiols 1.4.1 Based on the cyclization reactions with aldehydes 1.4.2 Based on the Michael addition reactions 1.4.3 Based on the native chemical ligation of peptide reactions 1.4.4 Based on the aromatic substitution-rearrangement reactions 1.4.5 Based on the cleavage of sulfonamide or sulfonate ester reactions by thiols 1.4.6 Based on the cleavage of disulfides reactions by thiols 1.4.7 Based on the reactions complexation and decomplexation 1.4.8 Based on the mechanisms 1.5 Fluorescent sensors for detection of Hg(II) ions 1.5.1 Based on the reactions complexation with Hg(II) 1.5.2 Based on the characteristic reactions of Hg(II) ions 1.6 Fluorescent sensors for detection of biothiol and Hg(II) ions based on the fluorophore are cyanine and coumarin 1.7 Overview of application of computational chemistry in the study on fluorescent sensors Chapter RESEARCH CONTENTS AND METHODS 2.1 Research objectives 2.2 Research contents - Study on the design, synthesis, characteristics, and applications of cyanine derivatives based on sensor L for selective detection of biothiols and Hg(II) ions: + Theoretical study on design, synthesis and characteristics of sensor L EES2 21 + Experimental research on characteristics and application of sensor L + Theoretical research on the application of the sensor L detects Hg (II) processes (3) and (4) above is not large enough (0,0137 and 0,0152), this results leads to the fact that fluorescence intensity of AMC is as small as observed in experiment Moreover, because the excitation process from S0→S1 (process (1) in Figure 3.48a) has much greater oscillator intensity than that from from S0→S1 (2) in Fig 3.48a), so the transfer process of electrons from S1→S0 (process (3) in Fig 3.48a) will be more dominant than that from S2→S0 (process (4) in Fig.3.48a) This may mainly cause the fluorescence intensity at long wavelengths (469,5 nm) stronger than that at short wavelengths (417,4 nm) as observed in the experiment + Study the use of complex (form by Hg(II) ions with sensor L) detection of biothiol In particular, theoretical research is conducted first to guide the study of the application of the next complex - Study on the design, synthesis, characteristics, and application of coumarin derivatives based on sensor AMC for selective detection of biothiols: + Study of design theory, synthesis of sensor AMC and reaction of sensor AMC with biothiols + Experimental research on the synthesis, characteristics and applications of sensor AMC + Theoretical study on characteristics and applications of sensor AMC 2.3 Research methods 2.3.1 Theoretical calculation methods - The determination of the structure of geometry optimizations and single point energy was carried out by the density functional theory (DFT) method with the software of Gaussian 03 - The interaction energies adjusted for ZPE includesthe variation of enthalpy and variation of Gibbs free energy were derived as the differences between the total energy of the reaction products and the energy of the reactant substances - The calculation of the excited state and the time-dependent factors was carried out using time-dependent density functional theory (TD-DFT) at the same theory level as the geometry optimisation procedure - The analysis of AIM and NBO was executed at the B3LYP/LanL2DZ level of theory 2.3.2 The experimental investigation methods - The structures of compounds were confirmed by 1H -NMR and 13C- NMR spectrum, mass spectrometry (a) (b) (c) (d) Fig.3.48 Energy diagrams of excitation processes and excitation energy release at geometry in ground state (RGS) and electron excitation states (REES1, REES2, ) at theoretical level B3LYP/LanL2DZ: (a) AMC; (b) AMC-Cys; (c) AMC-Hcy; (d) AMC-GSH (d) 20 state S1 (REES1), S2 (REES2), the coumarin moiety and acryloxy moiety are almost in two planes perpendicular to each other For AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH have twist angles between the coumarin moieties and acryloxy moieties in the RGS and REES1 In REES2 and the coumarin moiety and acryloxy moiety are almost in the same plane 3.2.3.2 Research theories of spectral excitation and fluorescence spectrum a Theoretical study on excitation and fluorescents pectra The calculated results show that in the sensor AMC, the singlet electronic transition from S0 ground state to S1 excited state is the main transition with the greatest oscillator strength (f) of 0,5348 at 320,9 nm wavelength The S0→S1 transition is the main contribution to transition from HOMO→LUMO, with a percentage contribution up to 96,21% Besides, the overlap between HOMO and LUMO is very large, which shows that the transfer of electrons from HOMO to LUMO is favorable The transition of other states have a small unnoticeable oscillator intensity (f) Meanwhile, with AMC-Cys, AMC-Hcy, and AMC-GSH, calculated data show that the singlet electronic transition from S0 to S2 is the main transition with oscillator intensity (f) of 0,3723; 0,3694 and 0,3801, respectively (much larger than other transfers) at the wavelength of 300,6; 300,4 and 300,7 nm, respectively In the transition of the states, the transfer of electrons from HOMO-1→ LUMO is the main transition with a percentage contribution of 89,17; 89,05 and 89,24%, respectively On the other hand, the overlap between HOMO-1 and LUMO is very large so the transfer of electrons from HOMO-1 to LUMO is very favorable Other transitions of states have small, unnoticiable oscillator strength (f) The analyzed results of the MO frontier also show that there is no overlap between HOMO and HOMO-1 Thus in AMC-Cys, AMCHcy and AMC-GSH not occur in the PET process from HOMO to HOMO-1 As a result, AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH are fluorescents as presented in the experiment b Theoretical study on fluorescent spectra For sensor AMC, at REES1, the electron transition from S1 and S2 to S0 are forbidden At REES1, the lectron transition from S1 and S2 to S0 occur In addition, because the oscillator intensity (f) of both - The characteristics and applications of the sensors were performed by fluorescence spectroscopy and UV-Vis spectroscopy - The conditions of sensors synthesis have been studied based on the predicted results from theoretical calculations and previous experimental results [2], [3], [29] on similar reactions The synthesis process is summarized as follows: a Sensor L synthesis: * The synthesis of CBTZ 2-methylbenzothiazole (3,0 g, 0,02 mol) and bromoacetic acid (4,18 g, 0,03 mol) were dissolved in 50 mL absolute ethanol The mixture was boiled for hours to, then cooled to room temperature until the precipitation was formed This precipitation was washed with ethanol in alkali solution for several times, then dried to get the solid CBTZ (4,0 g, 75% yield) * The synthesis of L CBTZ (290 mg, mmol) and 4-diethylamino-2hydroxybenzaldehyde (190 mg, mmol) were dissolved in 30 mL of absolute ethanol With the addition of one drop of piperidine, the reaction solution turns red immediately The reaction was kept boiling for 10 hours to cool to room temperature The precipitation was formed and filtered, washed for several times with diethyl ether and then dried for the desired product L (3,0 g, 38% yield) b Sensor AMC synthesis: 4-Methyl-7-hydroxylcoumarin (1,7 g, 9,4 mmol) and Et3N (7.9 mL, 56,4 mmol) were dissolved in CH2Cl2 (20 mL) with small addition of a catalyst amount of 4-dimethylaminopyridine to get a solution The solution is made cool and keep at oC Each drop of acryloyl chloride (1,9 mL, 23,5 mmol) in CH2Cl2 (20 mL) is gradually added to the reaction solution in an hour Then, the solution was stirred for hours at room temperature and water was added to dissolve the amine salt The organic phase was washed with aqueous solution and then dried over MgSO4 After the solvent was 19 evaporated, the product was purified by recrystallization from ethanol to form a white crystalline solid (1,0 g, 45%, yield) Chapter RESULTS AND DISCUSSION 3.1 Design, synthesis, characteristics, and application of sensor L from cyanine derivatives for detection of biothiols and Hg(II) ions based on the reactions complexation 3.1.1 Theoretical study on design, synthesis, characteristics of sensor L 3.1.1.1 Theoretical study on design, synthesis of sensor L B3LYP/LanL2DZ levels of theory was applied for of research Cyanine derivatives including R2N+=CH[CH=CH]nNR2,Aryl=N+=CH[CH=CH]n-NR2, Aryl=N+=CH[CH=CH]n-N=Aryl, which all have the same structure, donor - π conjugated system acceptor Here, donor (the electron of push group) is an amino group; aceptor (the electron of withdrawal group) is amoni ions They are known as color compounds with strong fluorescence [40] Sensor L the design is planned as shown in the following synthesis diagram: For other amino acids without thiol groups not change distinct fluorescence variations of sensor AMC solution (Fig.3.38a) The presence of this miscellaneous amino acids also not have effect on the reation between AMC and biothiols (Cys, GSH and Hcy) with the clue that there is no significant difference between the fluorescence spectrum of solutions (AMC + biothiol + amino acids) with solutions (AMC + biothiol) (shown in Fig.3.38b) HO HO S BZT S BrCH2COOH N (I) OHC N - O2C N S N N (II) - O2C L CBZT Receptor Fluorophore Fig 3.1 Schematic design and synthesis sensor L Here, the fluorophore is cyanine, receptor is -COO- group, a strong affinity group with Hg(II) ion; The sensor L synthesis reaction occurs in two phases: phase (I) and phase (II) Reaction pairing the receptor to the fluorophore, the reaction (I) is based on the reaction between 4-methyl quinoline and carboxylic acid fluorescence intensity (a.u) fluorescence intensity (a.u) Wavelength/nm Wavelength/nm Wavelength/nm Fig.3.38 (a) Fluorescence spectra of AMC (10 μM, ethanol/HEPES, pH 7,4, 1/4, v/v, at 25 o C) upon addition of Cys, Hcy, GSH, others amino acids (including Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr and Val) (b) Fluorescence spectra of AMC (10 μM, ethanol/HEPES, pH 7.4, 1/4, v/v, at 25 oC) in the presence of others amino acids mixture (including Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr and Val) when upon addition of Cys, Hcy, and GSH d The survey on the use of sensor AMC to detect Cys In the concentration range of Cys from to 10 μM, The ratiometric fluorescent intensity at two different wavelengths sóng 450 375 nm (F450/375) has a good linear relationship with Cys concentration in the equation: F450/375 = 1,5431 + 2,257 × [Cys], R = 0,982 The limit of detection and limit of quantitation for Cys are 0,5 μM and 1,65 μM, respectively 3.2.3 Theoretical study on characteristics and application of sensor AMC 3.2.3.1 Optimized geometries (RGS, REES1, REES2) of AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy, and AMC-GSH at electronically ground state and excited state In the ground state (S0) of sensor AMC, the coumarin moiety and acryloxy moiety are almost in the same plane, but at the excited 18 increases more strongly than that of fluorescent emission at short wavelength The fluorescence intensity change at both 375 and 450 nm wavelengths above leads to an ability to use AMC as a fluorescence sensor based on rate variation in fluorescence intensity at two wavelengths to detect Cys derivative [29] while reaction pairing to form fluorophore, the reaction (II) is based on the adol addition reaction ethanol and croton condensate [3] a Survey of the reactions of the phase (I) S S S Br- BrCH2 COOH BZT CBZT N N S fluorescence intensity (a.u) Absorbance COO- CBZT-3 HBr (2) + BZT CBZT-2 N+ COOH Br- N+ N N+ N+ Br- CBZT-4 COOH (7) H2O Br- (8) S CBZT-3 (5) BrCH2 COOH N+ COOH Br- Br S S OH- (4) BrCH2 COOH BZT Br- CBZT S S S H3O+ COO- CBZT-3 CBZT-3 COOH Br N S N+ (3) BrCH2 COOH BZT H 2O COO- S S COOCBZT N N CBZT-5 COOH BZT Fig 3.3 The reactions formed CBZT from CBZT-3 Wavelength/nm b Survey on reaction between sensor AMC and Cys When Cys were added from to 10 μM to the sensor AMC solution (10 μM), the fluorescent ratio (F450/375) has a good linear relationship with the concentration of Cys Then, this ratio has unnoticeable change if the concentration of Cys continues to increase This shows that the reaction beween AMC and Cys occurs with 1:1 stoichiometry (similar for Hcy and GSH) This result is consistent with the result when determining the ratio of the reaction between AMC and Cys ratio with Job’s plot method and mass analysis of product reation betweent AMC and Cys c The survey on effects of the competitive amino acids These results of the survey reveal that when adding thiolcontaining amino acids, the fluorescence intensity of AMC solution also increased markedly in both emission bands, in which the emission at 450 nm gave more fluorescent enhancement, whereas the emission at 375 nm produces a moderate increase However, the the level of fluroescence enhancement is in this order: Cys>GSH> Hcy (Fig.3.38a) Br- (6) N+ COOH Br- S BrCH2 COOH Fig.3.33 (a) Absorbance spectra of the sensor AMC (10 μM) in C2H5OH/HEPES (pH 7.4, 1/4, v/v) at 25 C upon addition of 20 μM of Cys (b) Fluorescence spectra of AMC (10 μM) upon addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 equiv of Cys in C2H5OH/HEPES (pH 7.4, 1/4, v/v) at 25 C, excitation wavelength at 320 nm S CH3CH2 OH2+ N+ CBZT-1 COOH S Wavelength/nm CH3CH2 OH (1) N+ N Fig 3.2 The possible products formed from the reaction between BZT and bromoacetic acid The reaction to form CBZT from BZT and bromoacetic acid is shown in Figures 3.2 and 3.3 The calculated results show that reaction between BZT and bromoacetic acid forms CBZT-3 and reaction between CBZT-3 and alkali solution forms CBZT, which is thermodynamically favorable b Survey of the reaction of phase (II) The reactions to form L HO from CBTZ and DHB can H O (9) N S N create four products (Fig.3.5) L-1 COO The calculated results have H O (10) N S showed that the free energy HO N HO S L-2 OHC N (∆G298) of reaction (12) is COO N negative Accordingly, the COO HO S CBZT DHB N H O (11) N reaction between CBZT and COO L-3 DHB in the trend to form L S is clearly thermodynamically H O (12) N N favorable HO COO L + - + - + - + - + - Fig.3.5 The possible products formed from the reaction between CBTZ and DHB 17 3.1.1.2 Theoretical study on characteristics of L a The molecular structure of L The bond lengths, bond angles, and dihedral angles of L were calculated In particular, these values of BZT, bromacetic acid and DHB have little change compared with that from the beginning In L, there is the formation of new bond between N7 and C11 and double one of bond C10 and C12 b UV-Vis spectral analysis of sensor L The UV-Vis spectra of L at gains the maximum value at 452,6 nm In a previous Fig 3.6 The optimized geometry of L at the announcement, BZTVPA had B3LYP/LanL2DZ level of theory the same structure as the sensor L with a maximum absorption wavelength of 405 nm, which is a strong fluorescent emission at 495 nm This result led to an expectation that the fluorescent properties of L would be similar to BZTVPA fluorescence c The analysis of Fluorescent properties of sensor L The calculated results show that the free energy (∆298) of sensor AMC synthesis reaction is negative Accordingly, its reaction is thermodynamically favorable 3.2.1.2 Theoretical study on the reation between sensor AMC and biothiols According to the previously published works, the Michael addition reactions beween biothiols (Cys, Hcy and GSH) and esters created by acrylic acid and alcols (usually the fluorophore) initially generates thioethers, then followed by the formation of heterocycles compounds in the case of Cys and Hcy Meanwhile, the thioether of GSH is usually stable with no subsequent ring formation Different from the above study, the calculated results in term of the thermodynamics show that reactions between the sensor AMC and biothiols (including Cys, Hcy and GSH) to form thioether with the 1: molar ratio is thermodynamically advantageous 3.2.2 Experimental study on synthesis, characterization and application of sensor AMC 3.2.2.1 Experimental synthesis of sensor AMC After synthesis, the structure of AMC products was obtained with 1H- NMR and FAB-MS spectra 3.2.2.2 Experimental study on the characteristics and application of sensor AMC a Absorption and the fluorescence spectrum of the AMC sensor As shown in Fig.3.33a, the free sensor AMC shows a characteristic absorption band peaked at 275 and 320 nm When Cys were added to the solution of sensor AMC, the absorption spectrum was negligibly changed Meanwhile, the free sensor AMC displays fluorescence emission band peaked at 375 nm and 450 nm (Fig.3.33b) Fluorescence quantum yield (Φ) of sensor AMC was determined to be 0,05 When Cys were added to the solution of sensor AMC fluorescence tensity increases gradually at both emission bands In particular, the intensity of fluorescent emission at long wavelength Table 3.5 Calculated excitation energy (E), wavelength (λ), and oscillator strength (f) for low-laying singlet state of L at B3LYP/LanL2DZ λ State MO E f Percentage S0→S1 95→97 (eV) 2,53 (nm) 489,8 0,2566 96→97 S0→S2 S0→S3 93→97 contribution(%) 56,44 35,80 2,74 452,6 0,5626 29,22 95→97 28,63 96→97 28,66 92→97 2,86 432,9 0,0097 5,90 93→97 8,83 94→97 77,56 16 not change the signals of the Hg2L2 solution’s fluorescence This proves that the ensemble Hg2L2 complex is like a fluorescent sensor for the selective detection in the presence of amino acids without the thiol group As shown in Fig.3.25b, fluorescence intensity gain strongest increase is Cys, then GSH and Hcy c Survey on the use of Hg2L2 for quantitative detection of Cys In the concentration range of Cys from to μM, there is a good linear relationship between the variation of fluorescence intensity (F585) of Hg2L2 and Cys concentration, shown in the following equation: F585 = (11,1 ± 5,9) + (133,3 ± 2,0) × [Cys], R = 0,998 The limit of detection and limit of quantitation for Cys are 0,2 μM and 0,66 μM, respectively 3.2 Design, synthesis, characteristics, and application of sensor AMC from coumarin derivatives for the detection of biothiols based on the Michael addition reactions 3.2.1 Theoretical design, synthesis sensor AMC and reaction between AMC sensor with biothiols 3.2.1.1 Study on design, synthesis of sensor AMC 4-methyl-7-hydroxycoumarin compound gains maximum absorbance at 359 nm wavelength and maximum emission at 449 nm wavelength [159] To design AMC fluorescence sensor (7- acryloyl -4metylcouramin) from coumarin-based derivatives to detect biothiols based on the Michael addition reactions, 4-methyl-7-hydroxylcoumarin compounds are chosen as fluorophore and receptor as acryloyl chloride, because reaction of receptor to fluorophore is conducted easily with ester reation among phenol groups with the acid derivative [2] and this receptor can cause an addition reaction with the biothiols The sensor AMC is designed in the following synthesis scheme: + Fluorophore Cl O O (B) O O OH (A) + O O HCl O AMC Receptor Fig 3.29 Schematic design and synthesis sensor AMC State S0→S4 S0→S5 MO 92→97 E (eV) 3,00 λ f (nm) 413,2 0,5815 93→97 49,94 94→97 10,62 95→97 9,35 96→97 11,07 92→97 3,05 406,0 0,0060 93→97 S0→S6 Percentage contribution(%) 5,42 90→97 86,61 7,68 3,92 316,7 0,0051 44,35 91→97 41,32 96→97 8,40 Calculated results (Table 3.5) showed that, excited states have great oscillator strength namely S0→S1, S0→S2 at wavelengths 489,8 nm and 452,6 nm, respectively to make a significant contribution (35,80% and 28,66%, respectively) to transition from MO-96 to MO97 Because of continuous MOs, there is no PET to intervene this transition This result led to an expectation that the L is fluorescence emission compound 3.1.2 Experimental study on synthesis, characteristics and application of sensor L 3.1.2.1 Experimental study on synthesis of L After synthesis, the structure of CBZT and L products was obtained with 1H- NMR, 13C-NMR and FAB-MS spectra 3.1.2.2 The experiamental survey of application of L for the detection of Hg(II) ions a The survey of UV-Vis and fluorescence spectra of As expected from calculations, L performs red fluorescence with a quantum yield of 0,175 The maximum fluorescence wavelength is 585 nm and the maximum absorption wavelength is 540 nm (Fig.3.10) 15 Wavelength/nm fluorescence intensity (a.u) Wavelength/nm 540 nm wavelength appears; in the fluorescence spectrum, the intensity of the fluorescence increases gradually again Absorbance Absorbance fluorescence intensity (a.u) 10 Fig.3.10 UV-Vis and fluorescence spectra of L: (a) UV-Vis spectra, L (5 µM) in C2H5OH /H2O (1/9, v/v), pH ~ 7.4; (b) fluorescence spectra, L (5 µM) in C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~ 7.4, excitation wavelength at 540 nm Fig.3.11 showed that Hg (II) ions reacted and changed the UVVis, and fluorescence spectra of L The fluorescence intensity of L was decreased gradually while the concentration of Hg(II) ions is increased c The survey on the reaction between L and Hg(II) ions Fig 3.12 shows that, the fluorescence intensity of solution L decreases noticeably when the concentration of Hg (II) ions increases from to 5.0 μM; and then decrease unsignificantly when we continue to decrease concentration of Hg (II) ions This shows that L reacts with Hg (II) ions in a molar ratio of 1:1 Fig.3.24 Absorbance spectra (a) and emission spectra (b) of Hg2L2 (2,5 μM) in C2H5OH/HEPES (1/9, v/v), pH ~7,4, at 25C upon addition of 0-10 equiv of Cys, excitation wavelength at 540 nm, emission wavelength at 585 nm b Survey on effects of competitive amino acids and reation between of Hg2L2 and biothiols fluorescence intensity (a.u) Wavelength/nm Wavelength/nm Fig.3.11 The UV-Vis and fluorescence spectra of L with Hg(II) ions: (a) UV-Vis spectra, L (5 µM) in C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0-5µM); (b) Fluorescence spectra, L (5 µM) in C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0-5µM)), excitation wavelength at 540 nm Wavelength/nm Wavelength/nm fluorescence intensity (a.u) fluorescence intensity (a.u) Absorbance b They survey of UV-Vis and fluorescence titration spectra of L for the detection Hg(II) ions Wavelength/nm Concentration (μM) Fig.3.25 (a) Emission spectra of Hg L2 (2,5 μM) C H5OH/HEPES (pH =7,4, 1/9, v/v) at 25 oC upon addition of different amino acids (10 equiv each) including Cys, Hcy, GSH, Ala, Asp, Arg, Gly, Glu, ILe, Leu, Lys, Met, Thr, Ser, Tyr, Trp, and Val, respectively (Others: a mixture of miscellaneous amino acids without mercapto group) (b) Emission intensity at 585 nm of Hg L2 (2,5 μM) vs different concentions of Cys, GSH, Hcy, and other amino acids The results presented in Fig.3.25a show that only the thiolcontaining amino acids make strong change to fluorescence intensity of solution In contrast, other amino acids without the thiol group 14 11 Hg2L2 + H2Cys + 80H- 2Hg(Cys)2 + H20 + 2L 3.1.4.2 Experimental study on the use of Hg2L2 complex as fluorescence sensor to detect biothiol a Survey on UV-Vis and fluorescence titration spectra of Hg2L2 Fig.3.24 indicates that when Cys is gradually added in Hg2L2 complex solution: in the UV-Vis spectra, the maximum absorption peak at 460 nm wavelength disappears constantly while a new maximum absorption peak with a very strong absorption intensity at fluorescence intensity (a.u) fluorescence intensity (a.u) fluorescence intensity (a.u) d Survey on the effects of the competitive metal ions Fig.3.13 shows that there is no significant change in UV-Vis spectra as well as in fluorescence spectra when adding Cd Fig.3.12 The graph for determination of the molar ratio of the reaction between Hg(II) ions and L: L µM in (II), Fe (II), Co (III), Cu C2H5OH/H2O (1/9, v/v) pH ~7,4, emission wavelength (II) , Zn (II), Pb (II), Ca at 585 nm, excitation wavelength at 540 nm (II), Na (I), K (I) with a times higher concentration of L Thus, L can detect selectively Hg (II) ions in the presence of these ions Absorbance Calculated results in Table 3.8 show that the formation of Hg2L2 complex leads to the significant transfer of the electron density from L ligands to metal core Hg(II) ions and shorten the energy gap between HOMO and LUMO As the results, at main excited states (maximum oscillator intensity is 0,5913) from S0→S2, with the main contribution of transition from HOMO to LUMO (53,12%), with a small amount of excitation energy of 1,37 eV This leads to the fact that fluorescence emission wavelength of complex shifts to the long wavelength, greater than 900 nm Therefore, in practice, there is no fluorescence from Hg2L2 complex to be detected 3.1.4 Study on the use of Hg2L2 complex to detect biothiols 3.1.4.1 Study on theoretical calculations from complex reactions Constant association of complex was calculated by fluorescence titration method The calculated results reveal that constant association of complex Hg2L2 is 1017,45 (M-3) Meanwhile, the association constant of Hg(RS)2 from Hg(II) ions with biothiols RSH, (2Hg(II) + 2RSH = Hg(SR)2 + 2H+, Ka) for Cys, GSH, Hcy are 1020,1; 1020,2 and 1019,7, respectively Hence, the reation between Hg2L2 with biothiols (Cys, GSH, Hcy) to format complex (Hg(II) with biothiols the freedom of L may be available The research results in term of thermodynamics of reation between Hg(II) ions and Cysteine (H2Cys) show that the reation (14) occurs beacause ΔG298 is negative (value ΔG298 of -821,6 kcal.mol-1) 2Hg2Cys + Hg(II) + 4OH[Hg(Cys)2]2+ + 4H2O (14) The free energy (ΔG298) of reaction to form Hg2L2 from Hg(II) ions and L with a value ΔG298 of -410,2 kcal.mol‾1 Thus, the reation occurs (for the reason that the value ΔG298 is -1232 kcal.mol-1): Wavelength/nm Wavelength/nm Wavelength/nm Fig.3.13 Absorbance (a) and fluorescence (b) spectra of sensor L (1,5 μM) with different metal ions Hg(II), Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I), K(I) (5 equiv each) in C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, excitation wavelength at 540 nm e The survey on the use of sensor L for quantitation detection of Hg(II) ions In the concentration range of Hg(II) ions from to 400 μg/L: the variation of absorbance (ΔA540) and variation of fluorescence intensity (∆I585) maitain a good linear relationship with the ion concentration of Hg(II) with respective equations: ΔA540= (0,01 ± 0,01) + (0,0011 ± 0,0000) × [Hg(II)], R=0,999; ∆I585= (-1,0 ± 0,4) + (0,3 ± 0,0) × 12 [Hg(II)], R=0,999 The limit of detection and limit of quantitation for Hg(II) ions of colorimetric method are respectively 15,3 μg/L and 51,2 μg/L or 0,076 μM and 0,25 μM and the fluorescent method is 11,8 μg/L 39,3 μg/L or 0,059 μM and 0,19 μM, respectively 3.1.3 The theoretical study on the application of L for detection Hg(II) ions a The study on the molecular structure of Hg2L2 The calculated results of the complex formation between Hg(II) ions and L with the molar ratio of 1: at the theoretical level of B3LYP/LanL2DZ show that there is a unchanged geometrical structure found as Hg2L2, which is and shown in Fig.3.16 The formation of Hg2L2 complex is thermodynamically favorable, with a ∆G298 value of 410,2 kcal mol-1 The bonds of complexes include O25Hg93, O71Hg93, S55Hg93, and O26O71 These bonds are known to be formed based on the calculated results of the distances among atoms, significantly smaller than the sum of van der Waals radii of relevant atoms To confirm that the structure of the Hg2L2 complex, AIM analysis was conducted The results of the analysis show that there are bond critical points (BCPs) between the contact points between O, S ligands and Hg (II), which are covalent bonds with the existence of the ring critical points (RCPs) between contacts O, S, N, Hg points (complex have ring structure) To explain fluorescence characteristics based on nature of the electrons of the bonds, NBO analysis was conducted The Fig.3.16 The optimized geometry of Hg2L2 at the B3LYP/LanL2DZ level of theory results show that free L has the structure: D-π conjugated - A (Fluorescent); L in complex: the electron pair of N7 is no longer conjugated to the conjugate π (the structure of D - π conjugated - A was broken), therefore there is an electron transfer leading to fluorescence quenching of the complex 13 b The analysis of fluorescent properties of Hg2L2 Table 3.8 Calculated excitation energy (E), wavelength (λ), and oscillator strength (f) for low-laying singlet state of Hg2L2 at B3LYP/LanL2DZ State S0→S1 S0→S2 S0→S3 MO 201→203 E (eV) 1,29 λ f (nm) 961,2 0,0838 S0→S5 4,63 202→203 30,06 202→204 59,58 201→203 1,37 903,4 0,5913 2,41 201→204 3,99 202→203 53,12 202→204 24,77 201→203 1,57 788,7 0,1063 201→204 S0→S4 Percentage contribution(%) 201→203 38,83 39,46 1,59 778,5 0,0647 32,24 201→204 43,20 202→204 3,52 197→203 1,93 642,3 0,0183 2,66 199→203 50,52 199→204 10,31 200→203 25,64 S0→S5 201→205 2,29 S0→S6 198→204 199→203 1,95 636,4 0,0121 2,30 19,80 199→204 2,57 200→204 27,67 ... hợp số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất cyanine coumarin để xác định biothiol Hg(II) " Những đóng góp luận án: - Sensor L thiết kế từ dẫn xuất cyanine công bố, phát chọn lọc ion Hg(II) dựa phản... Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng ứng dụng sensor AMC từ dẫn xuất coumarin để phát chọn lọc biothiol: + Nghiên cứu lý thuyết thiết kế, tổng hợp sensor AMC phản ứng sensor AMC với biothiol. .. μM 3.2 Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng ứng dựng sensor huỳnh quang AMC từ dẫn xuất coumarin phát biothiol dựa phản ứng cộng Michael 3.2.1 Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor AMC phản ứng sensor