Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ phục vụ tạo và nhân giống lợn

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - NGUYỄN THỊ HẬU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH LỢN DẠNG CỌNG RẠ PHỤC VỤ TẠO VÀ NHÂN GIỐNG LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP THÁI NGUYÊN - 2009 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - NGUYỄN THỊ HẬU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH LỢN DẠNG CỌNG RẠ PHỤC VỤ TẠO VÀ NHÂN GIỐNG LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Chăn nuôi Mã số: 606240 Người hướng dẫn khoa học : TS Nguyễn Mạnh Hà TS Đào Đức Thà THÁI NGUYÊN - 2009 Lời cảm ơn Để hoàn thành báo cáo tốt nghiệp này, nỗ lực phấn đấu thân, tơi cịn nhận giúp đỡ, hướng dẫn tận tình nhiều cá nhân, đơn vị tập thể khác Nhân dịp tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Nguyễn Mạnh Hà Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên TS Đào Đức Thà Phó Bộ mơn Sinh lý sinh hóa tập tính vật ni Viện Chăn nuôi Quốc gia, người dành nhiều thời gian, tâm huyết bảo, giúp đỡ suốt q trình thực tập Tơi xin gửi tới thầy giáo, cô giáo trường Đại học Nông Lâm Thái Ngun nói chung, khoa Chăn ni nói riêng người giúp đỡ, giảng dạy suốt trình học tập trường Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Chăn ni tồn thể cán công nhân viên Viện, đặc biệt anh, chị cán Bộ môn Sinh lý sinh hóa tập tính vật ni Viên chăn nuôi, Trung tâm thực nghiệm bảo tồn vật nuôi Viện chăn ni Phịng thí nghiệm cơng nghệ tế bào động vật Viện Chăn nuôi, người hướng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành tốt đề tài Xin bày tỏ lòng biết ơn tới người thân, bạn bè đồng nghiệp bên tôi, giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập rèn luyện trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên thực tập Viện Chăn nuôi! Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2009 Sinh viên Nguyễn Thị Hu LI CAM OAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực cha đợc công bố công trình khác Tôi xin cam đoan thông tin trích dẫn luận văn đà đợc chØ râ nguån gèc Tác giả Nguyễn Thị Hậu DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A ( Progressive Motility ) : Hoạt lực tinh trùng ASTT : Áp suất thẩm thấu C : Nồng độ tinh trùng cs : Cộng ctv : Cộng tác viên DAP : Độ dài đường trung bình DCL : Độ dài đường ziczăc DSL : Độ dài đường thẳng I ( Immotile) : Tinh trùng không hoạt động Motility : Hoạt động tinh trùng NST : Nhiễm sắc thể L ( Local motility ) : Tinh trùng hoạt động chỗ TTNT : Thụ tinh nhân tạo TTON : Thụ tinh ống nghiệm V : Lượng tinh dịch lần lấy tinh VAC : Tổng số timh trùng tiến thẳng VCL : Tốc độ chuyển động theo đường ziczăc VAP : Tốc độ chuyển động theo đường trung bình VSL : Tốc độ chuyển động theo đường thẳng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Một số tiêu chất lượng tinh nguyên trước đông lạnh 52 Bảng 3.2 Khoảng cách vận tốc tinh trùng giống lợn 58 Bảng 3.3 Đặc điểm môi trường ly tâm (n=60) 59 Bảng 3.4 Ảnh hưởng hai môi trường ly tâm đến sức sống tinh trùng 60 Bảng 3.5 Ảnh hưởng môi trường ly tâm đến sức sống tinh trùng giống lợn Landrace 62 Bảng 3.6 Ảnh hưởng môi trường ly tâm đến sức sống tinh trùng giống lợn Yorkshire 62 Bảng 3.7 Ảnh hưởng môi trường ly tâm đến sức sống tinh trùng 63 giống lợn Duroc 63 Bảng 3.8 Ảnh hưởng tốc độ ly tâm đến sức sống tinh trùng……….65 Bảng 3.9 Sức sống tinh trùng sau ly tâm giống lợn 67 Bảng 3.10 Đặc điểm môi trường cân (n= 60) 68 Bảng 3.11 Chất lượng tinh dịch sau cân giống Landrace 69 Bảng 3.12 Chất lượng tinh dịch sau cân giống Yorkshire 70 Bảng 3.13 Chất lượng tinh dịch sau cân giống Duroc 70 Bảng 3.14 Ảnh hưởng thời gian đông lạnh đến sức sống tinh trùng 71 (n= 70) 71 Bảng 3.15 Ảnh hưởng thời gian giải đông đến sức sống tinh trùng 73 (n=70) 73 Bảng 3.16 Chất lượng tinh dịch đông lạnh sau giải đông giống lợn 75 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Biểu đồ 3.1: Biểu đồ so sánh thể tích tinh dịch giống lợn 53 Biểu đồ 3.2: Biểu đồ so sánh hoạt lực tinh trùng giống 54 Biểu đồ 3.3: Biểu đồ so sánh nồng độ C (tr/ml) giống 55 Biểu đồ 3.4: Biểu đồ so sánh VAC (tỷ) lần lấy tinh 56 Biêủ đồ 3.5: Biêủ đồ so sánh Motility (%), A (Progressive.Motility %) tinh trùng môi trường ly tâm 61 Biêủ đồ 3.6: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng tinh nguyên tinh pha môi trường ly tâm (VCN) 64 Biêủ đồ 3.7: Biểu đồ so sánh hoạt lưc (A ) tinh trùng chế độ ly tâm 66 Biêủ đồ 3.8: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng trước, sau đông lạnh thời gian đông lạnh 10 phút 20 phút 72 Biêủ đồ 3.5: Biểu đồ so sánh hoạt lưc (A) tinh trùng thời gian giải đông 30 giây 45 giây 74 Biêủ đồ 3.10: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng sau giải đông giống lợn 76 Biêủ đồ 3.11: Biểu đồ so sánh độ dài chuyển động tinh trùng 77 Biêủ đồ 3.12: Biểu đồ so sánh vận tốc chuyển động tinh trùng dạng vận động 77 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 10 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 10 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 11 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 11 CHƯƠNG 12 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12 1.1 Vai trò lợn đực giống thụ tinh nhân tạo chăn nuôi lợn nước ta 12 1.2 Cơ sở nghiên cứu tinh dịch tinh trùng lợn 13 1.2.3 Một số đặc tính sinh lý tinh trùng lợn 18 1.2.4 Một số tiêu chất lượng tinh dịch lợn .24 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tinh dịch .27 1.3 Cơ sở khoa học kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn 31 1.3.1 Một số nguyên lý đông lạnh tinh dịch .32 1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới sức sống tinh trùng đông lạnh 35 1.3.3 Cơ sở khoa học môi trường đông lạnh tinh dịch lợn 37 1.3.4 Cơ sở khoa học quy trình đơng lạnh tinh dịch lợn 41 1.4 Tình hình nghiên cứu đơng lạnh tinh dịch lợn nước ngồi nước 42 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nước 42 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 44 CHƯƠNG 45 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG 45 VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 45 2.1.1 Tinh dịch lợn đực 45 2.1.2 Hoá chất dụng cụ thí nghiệm 45 2.2 Yêu cầu 45 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 45 2.4 Nội dung phương pháp nghiên cứu 46 2.4.1 Nghiên cứu số tiêu đánh giá chất lượng tinh dịch lợn trước đông lạnh 47 2.4.3 Nghiên cứu sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh .51 2.5 Phương pháp xử lý số liệu .51 CHƯƠNG 52 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 52 3.1 Kết nghiên cứu số tiêu chất lượng tinh dịch lợn trước đông lạnh .52 3.2 Kết nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn 59 3.2.1.Kết nghiên cứu kỹ thuật ly tâm 59 3.2.2 Kết nghiên cứu kỹ thuật cân tinh dịch .68 3.2.3 Kết nghiên cứu đông lạnh tinh dịch nitơ 71 3.2.4 Kết nghiên cứu nhiệt độ thời gian giải đông tinh dịch đông lạnh 73 Như kết sử dụng tinh đông lạnh phối giống cho lợn nái sản xuất cần phải nghiên cứu sâu nhằm nâng cao hiệu Tuy nhiên với kết bước đầu khẳng định thành công kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn 80 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 81 KẾT LUẬN 81 ĐỀ NGHỊ 82 I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 83 II TÀI LIỆU TIẾNG ANH 84 III TÀI LIỆU TIẾNG PHÁP 87 IV TÀI LIỆU TIẾNG ĐỨC 87 10 MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Hiện nay, kỹ thuật thụ tinh nhân tạo gia súc nói chung kỹ thuật thụ tinh nhân tạo lợn nói riêng nghiên cứu áp dụng rộng rãi toàn giới Để có vật liệu cung cấp cho thụ tinh nhân tạo, trước hết phải có quy trình bảo quản nhằm giữ cho tinh trùng đảm bảo chất lượng ngồi thể Quy trình bao gồm kỹ thuật như: kỹ thuật pha loãng, kỹ thuật bảo tồn kỹ thuật đông lạnh tinh dịch Trên giới, kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn nghiên cứu ứng dụng sản xuất, thành công kỳ diệu đông lạnh tinh dịch lợn đưa kỹ thuật thụ tinh nhân tạo (TTNT) lên vị trí mới, có ngân hàng tinh dịch đông lạnh suất cao Sự diện ngân hàng tinh dịch đông lạnh giúp cho việc vận chuyển, trao đổi, mua bán giống giới trở nên thuận tiện giảm nguy lan truyền mầm bệnh Đồng thời kỹ thuật đông lạnh tinh dịch góp phần bảo tồn lâu dài tinh dịch số giống địa phương quý Ở nước ta kỹ thuật đơng lạnh tinh dịch bị nghiên cứu, sản xuất, áp dụng rộng rãi sản xuất, nhiên kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn bước đầu nghiên cứu Một số nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn theo công nghệ Nhật Bản Mỹ tiến hành, bước đầu có kết chưa áp dụng sản xuất Để góp phần làm phong phú thêm kỹ thuật công nghệ sinh sản thụ tinh nhân tạo lợn, đồng thời áp dụng kết nghiên cứu vào sản xuất, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ phục vụ tạo nhân giống lợn” Thuộc đề tài công nghệ sinh học cấp nhà nước: “Nghiên cứu ứng dụng tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo nhân giống lợn” 86 34 Polge, C Salamon, S and I Wilmut (1970), Fertilizing capacity of frozen boar semen following surgical insemination,Vet Rec 87, pp 424-428 35 Pursel, V.G and L.A Johnson (1971), Fertility with frozen boar semen J Anim Sci 33, pp 265 36 Pursel, V.G and L.A Johnson (1975) Freezing of boar spermatozoa: Fertilizing capacity with concentrated semen and a new thawing procedure J Anim Sci 40, pp 99-102 37 Pursel, Schulman and Johnson, Effect of Orvus ES Paste on Acrosomee Morphology, Motility and Fertilizing Capacity of Frozen-Thawed Boar Sperm J Anim Sci 47, pp 198-202 38 Pursel and Johnson (2004), Boar semen cryopreservation protocol, J Anim Sci, 40(1), pp 99-102 39 Rigau T., Piedrafita J., Reverter J., Canal M., Rodríguez-Gil J.E (1996) The rate of L-lactate production: a feasible parameter for the fresh diluted boar semen quality analysis Anim Reprod Sci 43, pp 161-172 40 Sanada and saito (1978), Artificial insemination of livestock The fourth edition, Niwa et al, Tokyo, pp 154 41 Sellés E, Gadea J, Romar R, Mators C, Ruiz S (2003) Analysis of in vitro fertilizing capacity to evaluate the freezing procedures of boar semen and to predict the subsequent fertility Reprod Domest Anim 38, pp 66 -72 42 Teresa Cremades, Jordi Roca, Heriberto Rodriguez-Martinez, Teresa Abaigar, Juan M Vazquez and Emilio A Martinez.( 2005), Kinematic changes during the cryopreservation of boar spermatozoa J Androl 26, pp 610-618 43 Torahiko IIDA (1994), Artificial insemination, pp 153 - 162 44 Tsutsui, Hori, Komoriya, Shimizu, Nagakubo, Kawakami (2000), Effect of Addition of Orvus ES Paste to Frozen Canine Semen Extender on Sperm Acrosomees J Vet Med Sci,; Vol.62; No.5, pp 537-538 87 45 Wagner, H.G., and M Thibier (2000), World statistics for artificial insemination in small ruminants and swine, Proc 14th ICAR, 2(15), pp 46 Weize K.F.( 1991), Cryobiological aspect of sperm conservation, Gusta ficher, Verlag, Jena 47 Zimmerman DR (1986), Role of subtherapentic antimicrobial in big production, J.Anim.Sci.62, (supple 3) : III TÀI LIỆU TIẾNG PHÁP 48 P Thilmant (2001), Congélation du sperme de verrat en paillettes fines de 0,25 ml Porcine en France 33, pp 151-156 IV TÀI LIỆU TIẾNG ĐỨC 49 Telesforo Bonadonna (1967), Fisiopatologia de la reproduccion y de la fecundacion artificial de los animales domesticos, Redicion revolucionaria, La Habana 8, pp 249 50 Westendorf P, Ritcher.L, Treu H, (1975) Zur Tiefgefrierung von Ebersperma Labor-und Besamungsergebnisse mit dem Hỹlsenberger Paillettenverfahren DtschTierojrztl Wschr 82, pp 261–267 88 PHỤ LỤC Phương pháp nghiên cứu số tiêu đánh giá chất lượng tinh dịch lợn trước đông lạnh Các tiêu chất lượng tinh dịch lợn nghiên cứu theo phương pháp thường quy phần mềm Spermvision 3.0 Phương pháp nghiên cứu hoạt lực tinh trùng (A, %) Hoạt lực tinh trùng nghiên cứu dựa việc sử dụng phần mềm Sperm Vision 3.0 - Phần mềm Sperm Vision giúp phân tích tiêu tinh dịch trực tiếp xác Hệ thống Sperm Vision có cấu tạo gồm: + Kính hiển vi phản pha + Camera kỹ thuật số tốc độ cao + Máy tính có hệ thống Graphics PC card chun dụng + Bộ phận sưởi ấm tự động + Phiến kính chuyên dụng dùng lần + Micro pipet 10 – 100µl + Phần mềm chạy chương trình Window XP Cách tiến hành : Bật máy Nhấn chuột vào biểu tượng Sperm Vision Màn hình hiển thị trang Sample ( mẫu ) Khai báo yêu cầu: + Time ( Thời gian : ngày, tháng, ) tự động hiển thị + Donor ID ( Đặc điểm gia súc lấy mẫu ) + Donor name ( Tên gia súc lấy mẫu ) + Breed ( Giống ) + Tech ( Kỹ thuật viên ) 89 + Evat Tech ( Kỹ thuật đánh giá ) + Extender ( MơI trường sử dụng để pha lỗng ) Bấm chuột vào New sample ( Mẫu ) Màn hình hiển thị lên trang: New sample entry ( Khai báo yêu cầu mẫu ) Phải khai báo mục: + Ngày kiểm tra ( tự động ) + Giờ kiểm tra ( tự động ) + Donor ID : số hiệu gia súc kiểm tra + Tech : kỹ thuật viên + Eval Tech : kỹ thuật đánh giá + Đơn vị lượng tinh kiểm tra + Extender use : mơi trường pha lỗng kiểm tra Nếu không khai báo đầy đủ phần mềm không chạy có câu hỏi đưa Bấm vào ô “ OK” Màn hình hiển thị trang : Mobility Analysis ( phân tích hoạt lực ) + Nhấn chuột vào cửa sổ giống ( Breed ) Chọn mục giống kiểm tra ( phần cài đặt sẵn trương trình giống ) + Nhấn chuột vào ô Dilution radio để chọn tỉ lệ pha loãng phù hợp với tỉ lệ pha mẫu kiểm tra Màn hình hiển thị hình ảnh kiểm tra bảng tiêu kiểm tra Chuẩn bị tiêu : Nhỏ lượng 20 microlit mẫu vào phiến kính có sẵn Đưa phiến kính chuẩn bị sẵn lên kính hiển vi Điều chỉnh độ nét 90 Nháy chuột vào ô cửa sổ Analyze kết tự động hiển thị hình hình ảnh số liệu Di chuyển sang vị trí khác để kiểm tra cách nhấn chuột vào ô field tiếp tục nhấn chuột vào Analyze để phân tích tiếp Đối với lợn mẫu làm lần ( field ) Các số liệu tự động tính tốn theo field trung bình Các số liệu hình ảnh lưu giữ lại chuyển field liệu Field chuyển sang phần Exel để tính tốn Hết Field tự động hiển thị lên phần kiểm tra kì hình trực tiếp Field cho kết Những số liệu vấn đề liên quan đến gia súc kiểm tra khai báo vào thư mục tương ứng Các tiêu kì hình tỉ lệ tinh trùng sống, chết kỹ thuật viên phải trực tiếp quan sát hình nhấn chuột vào vị trí tinh trùng máy tính tự động ghi lại tính tốn Những tinh trùng chết đánh dấu chấm đỏ đầu, tinh trùng kỳ hình kỹ thuật viên phải phân loại nhận biết xác Phương pháp nghiên cứu nồng độ tinh trùng (C, triệu/ml) Nồng độ tinh trùng đánh giá máy so màu SDM-S hãng Minitub (Đức) Cách đánh sau: - Bước 1: đặt phương pháp đo Sử dụng phương pháp để đo nồng độ tinh trùng lợn - Bước 2: đo mật độ quang nước muối sinh lý Cho vào cuvet 3,5ml nước muối sinh lý để đo - Bước 3: so màu để tìm nồng độ tinh trùng 91 Lấy cuvet khác, cho vào 3,5ml nước muối sinh lý 70µl tinh dịch Lắc nhẹ cho mẫu đưa vào máy để so màu - Bước 4: đọc kết hình Phương pháp nghiên cứu áp suất thẩm thấu Đo ASTT tinh dịch lợn máy đo tự động Osmometer Type hãng Minitub (Đức) Cách tiến hành: bật máy lên, máy khởi động – phút, hình hiển thị dãy số 9999, cho 0,1ml tinh dịch cần khảo sát vào tuýp nhựa chuyên dụng máy, sau lắp vào đầu đo đặt vào vị trí đo, lúc máy tự hoạt động theo chương trình, hình máy hiển thị dãy số giảm dần từ số (+) đến số (-) Khi dãy số – 800 máy tự động phát tín hiệu tút…tút…tút…liên tục báo hiệu cho kỹ thuật viên chuẩn bị thao tác nâng kim kích đơng lên vị trí quy định Khi hình số – 1000 nhanh chóng thao tác đưa kim kích đơng vào vị trí sau nhấc kim vị trí ban đầu, thời gian kích đơng 0,5 giây Sau thời gian kích đơng, hình hiển thị dãy số, dãy số có giá trị (+) giảm dần, dãy số dừng dao động xung quanh giá trị đó, ta xác định kết Dãy số hình lúc giá trị áp lực thẩm thấu dung dịch Chú ý: trước lần đo cần chỉnh máy cách đo áp suất thẩm thấu nước cất Nước cất có ( ASTT ) chỉnh vị trí máy 1miniosmol = 0,001860C = 0,0224 atm Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ tinh trùng kỳ hình - Phương pháp: làm tiêu cố định quan sát trực tiếp hình vi tính phần mềm Sperm Vision Lấy hai phiến kính rửa sạch, sấy khơ, nhỏ giọt tinh dịch lên phiến kính, dùng phiến kính gạt cho tinh dịch dàn mỏng Để hong khơ ngồi khơng khí khoảng phút Sau đưa lên kính hiển vi hệ thống 92 máy Sperm Vision Quan sát đếm tổng số tinh trùng, số tinh trùng kỳ hình vi trường Sau xử lý thống kê để đánh giá tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 93 Bình nitơ dùng kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn Tủ bảo ôn dùng kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn 94 Máy đo áp suất thẩm thấu tinh dịch lợn Máy ly tâm tinh dịch lợn 95 Hệ thống phần mềm Spermvision dùng đánh giá tiêu tinh trùng Một số hóa chất dùng kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn 96 Môi trường đông lạnh dùng kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn 97 Kiểm tra chất lượng tinh dịch trước sau đông lạnh 98 Tinh dịch sau cân đóng vào cọng rạ 99 Tinh dịch sau đóng vào cọng rạ Đông lạnh tinh dịch Nitơ lỏng (- 1960C) 100 Giải đông tinh cọng rạ Đàn lợn sinh TTNT tinh cọng rạ đông lạnh ... xuất kỹ thuật kỹ thuật thụ tinh nhân tạo - công nghệ đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ - Phục vụ chương trình tạo nhân giống lợn, làm sở góp phần bảo tồn quỹ gen (bảo tồn tinh dịch giống lợn. .. đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ phục vụ tạo nhân giống lợn? ?? Thuộc đề tài công nghệ sinh học cấp nhà nước: ? ?Nghiên cứu ứng dụng tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo nhân giống lợn? ??... cho tinh trùng đảm bảo chất lượng thể Quy trình bao gồm kỹ thuật như: kỹ thuật pha loãng, kỹ thuật bảo tồn kỹ thuật đông lạnh tinh dịch Trên giới, kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn nghiên cứu ứng