Nghiên cứu chiết tách xác định thành phần hóa học của một số dịch chiết từ nụ vối

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRẦN THU HIỀN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT TỪ NỤ VỐI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng - Năm 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRẦN THU HIỀN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT TỪ NỤ VỐI Chuyên ngành Mã số : Hóa hữu : 60.44.27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS ĐẶNG MINH NHẬT Đà Nẵng - Năm 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận văn Trần Thu Hiền MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Bố cục luận văn CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY VỐI 1.1.1 Tên gọi 1.1.2 Mô tả thực vật 1.1.3 Phân bố 1.1.4 Dược tính nụ vối 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.2.1 Các cơng trình nghiên cứu Việt Nam 1.2.2 Các cơng trình nghiên cứu giới 1.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRỌNG LƯỢNG 11 1.3.1 Bản chất phương pháp phân tích trọng lượng 11 1.3.2 Phân loại phương pháp phân tích trọng lượng .12 1.3.3 Một số kỹ thuật phương pháp phân tích trọng lượng 12 1.3.4 Ưu nhược điểm phương pháp phân tích trọng lượng 15 1.4 PHƯƠNG PHÁP RẮN – LỎNG .16 1.4.1 Kỹ thuật chiết soxhlet 16 1.4.2 Ưu nhược điểm phương pháp chiết máy soxhlet 17 1.5 PHƯƠNG PHÁP HẤP THỤ NGUYÊN TỬ 18 1.5.1 Sự xuất phổ hấp thụ nguyên tử 18 1.5.2 Nguyên tắc phép đo AAS 18 1.5.3 Ưu, nhược điểm phép đo AAS .19 1.5.4 Ứng dụng phương pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử 20 1.6 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ (GC - MS) 20 1.6.1 Phương pháp sắc ký khí (GC) 20 1.6.2 Phương pháp khối phổ MS 23 1.6.3 Khối phổ kết hợp với sắc ký khí 24 1.7 PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 25 1.7.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh .25 1.7.2 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa 26 1.8 SẮC KÝ CỘT 26 1.8.1 Mục đích .26 1.8.2 Nguyên tắc 26 1.8.3 Chuẩn bị sắc ký cột .26 1.9 PHƯƠNG PHÁP CỘNG HƯỞNG TỪ HẠT NHÂN (NMR) 30 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 33 2.1.1 Thu gom nguyên liệu 33 2.1.2 Xử lý nguyên liệu 33 2.1.3 Thiết bị - dụng cụ - hóa chất .34 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.3 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ 36 2.3.1 Xác định độ ẩm 36 2.3.2 Xác định hàm lượng tro phương pháp tro hóa mẫu 37 2.3.3 Xác định hàm lượng số kim loại nặng nụ vối phương pháp hấp thụ nguyên tử AAS 38 2.4 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT BỘT NỤ VỐI BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU .39 2.4.1 Khảo sát điều kiện chiết bột nụ vối dung môi n-hexan 39 2.4.2 Khảo sát thời gian chiết tối ưu bột nụ vối dung môi etylaxetat 40 2.4.3 Khảo sát thời gian chiết tối ưu bột nụ vối dung môi diclometan .41 2.4.4 Khảo sát thời gian chiết tối ưu bột nụ vối dung môi etanol tuyệt đối 41 2.5 CHIẾT TÁCH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HĨA HỌC, THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA DỊCH CHIẾT TRONG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU TỪ BỘT NỤ VỐI .42 2.6 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC TRONG CAO CHIẾT N – HEXAN .44 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 47 3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ VÀ ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT 47 3.1.1 Độ ẩm .47 3.1.2 Hàm lượng tro .47 3.1.3 Xác định hàm lượng số kim loại phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 48 3.1.4 Kết khảo sát thời gian chiết dung môi khác 49 3.2 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN, CẤU TẠO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÁC DỊCH CHIẾT KHÁC NHAU CỦA NỤ VỐI .53 3.2.1 Dịch chiết dung môi n-hexan .53 3.2.2 Dịch chiết dung môi etylaxetat 57 3.2.3 Dịch chiết dung môi diclometan 58 3.2.4 Dịch chiết dung môi etanol tuyệt đối .61 3.3 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 62 3.2.1 Kết thử hoạt tính kháng sinh 62 3.2.2 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH .64 3.4 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CHẤT H2 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 Kết luận .78 Kiến nghị 79 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (Bản sao) PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu 2.1 Tên bảng Hóa chất sử dụng trình chiết xuất phân lập Trang 34 2.2 Thiết bị sử dụng trình chiết xuất phân lập 34 3.1 Kết khảo sát độ ẩm 47 3.2 Kết khảo sát hàm lượng tro 48 3.3 Kết xác định hàm lượng kim loại nặng 48 3.4 3.5 3.6 3.7 Kết khảo sát thời gian chiết dung môi n – hexan Kết khảo sát thời gian chiết dung môi etylaxetat Kết khảo sát thời gian chiết dung môi diclometan Kết khảo sát thời gian chiết dung môi etanol tuyệt đối 49 50 51 52 3.8 Thành phần định danh dịch chiết n – hexan nụ vối 55 3.9 Thành phần định danh dịch chiết etylaxetat nụ vối 58 3.10 Thành phần định danh dịch chiết diclometan nụ vối 60 3.11 Thành phần định danh dịch chiết etanol tuyệt đối nụ vối 62 3.12 3.13 3.14 3.15 Kết thử hoạt tính kháng sinh dịch chiết n - hexan, diclometan, etanol tuyệt đối nụ vối Kết thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH dịch chiết n hexan, diclometan, etanol tuyệt đối nụ vối Dữ liệu phổ 13C – NMR chất H2 Dữ liệu so sánh phổ 13C-NMR, 1H – NMR chất H2 phổ 13C-NMR, 1H – NMR TLTK [19] 63 64 68 77 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Các sơ đồ Số hiệu Tên sơ đồ sơ đồ 2.1 2.2 2.3 Sơ đồ khảo sát tiêu hóa lý điều kiện chiết xuất Sơ đồ xác định thành phần hóa học thử hoạt tính sinh học số dịch chiết từ nụ vối Sơ đồ phân lập tinh chế chất H2 Trang 35 43 46 Các đồ thị Số hiệu Tên đồ thị đồ thị 3.1 3.2 3.3 3.4 Ảnh hưởng thời gian chiết đến khối lượng riêng dịch chiết n - hexan Ảnh hưởng thời gian chiết đến khối lượng riêng dịch chiết etylaxetat Ảnh hưởng thời gian chiết đến khối lượng riêng dịch chiết diclometan Ảnh hưởng thời gian chiết đến khối lượng riêng dịch chiết etanol tuyệt đối Trang 50 51 52 53 73 Hình 3.12 Phổ HMBC chất H2 Dựa vào phổ HMBC hình 3.10; 3.11; 3.12 ta nhận thấy cho thấy có tương tác xa H C vị trí C mà H tương tác: H2 → C4, Cβ , H3 → C1, C3, C5 , H4 → C2, C6 , H5 → C1, C3, C5 , H6 → C4, Cβ , H2’ → C1’, C2’, C3’, H3’→ C2’, C3’, C4’, H5’ → C4’, C5’, C6’, H6’ → C6’, Hα → C1, Cβ, CC=O, Hβ → Cα, C2, C6, CC=O 74 Hình 3.13 Phổ HSQC chất H2 75 Hình 3.14 phổ HSQC chất H2 76 Hình 3.15 Phổ HSQC chất H2 F Nhận xét Qua hình 3.13; 3.14; 3.15 ta nhận thấy có tương tác gần C H nhóm – CH vị trí cacbon số 2, 3, 4, 5, 6, α, β nhóm – CH3 vị trí 3’, 5’ nhóm – OCH3 vị trí 6’ Tại vị trí C1 khơng xảy tương tác Điều góp phần chứng minh thêm cơng thức cấu tạo H2 Tóm lại: Qua phổ 13C - NMR, 1H - NMR, Phổ DEPT, phổ HMBC, phổ HSQC ta kết luận chất H2 có cơng thức cấu tạo tên gọi sau: HO 4' CH3 5' O 6' a 3' H3C CH3 2' OH 1' b O 2’, 4’ – dihydroxy – 6’ – methoxy – 3’, 5’ – dimethyl chalcone 77 Phổ 13C - NMR, 1H – NMR chất H2 so sánh với TLTK [19] Kết thu thể bảng 3.15 Bảng 3.15 Dữ liệu so sánh phổ 13C-NMR, 1H – NMR chất H2 phổ 13 VỊ TRÍ 13 C-NMR , 1H – NMR TLTK [19] C-NMR 13 C-NMR CHẤT H2 TLTK [19] 135.41 134.9 128.42 H – NMR H – NMR CHẤT H2 TLTK [19] 127.9 7.64 (d) 7.65 (d; 7.2) 128.94 128.4 7.40 (m) 7.41(m) 130.20 129.7 7.40 (m) 7.41 (m) 128.94 128.4 7.40 (m) 7.41 (m) 128.42 127.9 7.64 (d) 7.65 (d; 7.2) 1’ 109.08 108.6 2’ 162.08 161.6 3’ 106.61 106.1 4’ 159.28 158.7 5’ 108.91 108.4 6’ 158.89 158.4 13.59 (s) 13.60 (s) OH – 2’ CH3 – 3’ 7.57 7.1 2.13 (s) 2.14 (s) CH3 – 5’ 8.25 7.7 2.15 (s) 2.16 (s) O - CH3 – 6’ 62.35 61.9 3.66 (s) 3.66 (s) α 126.76 126.2 7.98 (d, 15.5) 7.99 (d; 15.7) β 142.89 142.4 7.84 (d, 15.5) 7.84 (d; 15.7) CO 193.39 192.9 78 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau nghiên cứu nụ vối đạt số kết sau: Xác định thông số hóa lý nguyên liệu: độ ẩm nụ vối khơ 10.87 %, hàm lượng tro trung bình nụ vối 2.66 % , hàm lượng kim loại nặng : As, Hg, Pb, Cd, Cu, Zn theo định Bộ Y tế số 46/2007/QD - BYT ngày 19 - 12 - 2007 Bộ trưởng Bộ Y tế việc ban hành qui định giới hạn tối đa nhiễm sinh học hóa học thực phẩm với hàm lượng kim loại nặng cho phép thực phẩm (rau, quả, chè sản phẩm chè) Cho thấy hàm lượng nụ vối hàm lượng cho phép sử dụng, an tồn, khơng ảnh hưởng đến sức khỏe người Bằng phương pháp GC – MS định danh số thành phần hóa học dịch chiết từ nụ vối Từ dịch chiết n - hexan định danh 14 cấu tử gồm sterol, dirterpen (nhóm tocopherol), acid hữu cơ, ester Từ dịch chiết etylaxetat định danh cấu tử gồm acid hữu cơ, sterol Từ dịch chiết diclometan định danh 14 cấu tử gồm sterol, dirterpen (nhóm tocopherol), acid hữu Từ dịch chiết etanol định danh 11 cấu tử gồm acid hữu cơ, sterol, andehit, dẫn xuất phenol, ester Các dịch chiết n - hexan, diclometan, etanol từ nụ vối thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hoạt tính chống oxy hóa Kết dịch chiết hoạt tính thể ức chế chủng vi khuẩn gram (+) Staphylococcus aureus với dung môi n - hexan 2.42 μg/ml, dung môi diclometan 11.6 μg/ml, dung môi etanol tuyệt đối 76.44 μg/ml Đối với dịch chiết n - hexan cịn thể hoạt tính thể ức chế chủng vi khuẩn gram (+) Bacillus subtilis với 87.55 μg/ml thử hoạt tính chống oxy 79 hóa dịch chiết nụ vối dung mơi etanol khả chống oxy hóa với EC50 = 105.77 μg/ml Từ cao n - hexan phân lập định danh chất HO CH3 5' 4' O 6' 3' H3C CH3 2' OH 1' O 2’, 4’ – dihydroxy – 6’ – methoxy – 3’, 5’ – dimethyl chalcone Kiến nghị Tiếp tục phân lập, tinh chế chất có nụ vối từ cao chiết etyacetat, diclometan, etanol xác định cấu trúc chất phân lập Sau thử hoạt tính sinh học chất để nhận định cách tồn diện tác dụng điều trị bệnh từ nụ vối Nghiên cứu thử lâm sàng để đưa dược liệu quý thành loại thuốc chữa bệnh 80 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Bộ môn dược liệu (2012), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh [2] Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Tr 1186 – 1188 [3] Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thi Hà (1999), Ứng dụng số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, Nhà xuất Giáo dục [4] Đỗ Tất Lợi, Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, 2004, tr 423 – 424 [5] Hồng Văn Lựu (1996), Nghiên cứu thành phần hóa học số thuộc họ sim (Myrtaceae) Nghệ An, Luận án phó tiến sỹ Khoa Học Hóa học – Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Sư phạm [6] Nguyễn Đức Minh (1975), Tính kháng khuẩn thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học [7] Nguyễn Kim Phi Phụng (2005), Phổ NMR sử dụng phân tích hữu cơ, Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [8] Nguyễn Kim Phi Phụng (2006), phương pháp cô lập, Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [9] Trần Văn Sung (2012), Các phương phổ dùng hóa học, Giáo trình cao học, Viện Cơng nghệ Hóa học – Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam [10] Nguyễn Quốc Tuấn (2012), Xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid nụ vối, Luận văn thạc sĩ hóa phân tích, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên [11] Đỗ Thị Thanh (2006), nghiên cứu vối Việt Nam, khóa luận tốt nghiệp trường Đại học Quốc gia Hà Nội 81 Tài liệu tiếng anh [12] Byung – Sun Min, Cao Van Thu, Nguyen Tien Đạt, Nguyen Hai Đang, Han – Su jang, Tran Manh Hung (2008), Antioxidative Flavonoids from Cleistocalys Bubs, publication collection, Tr 1725 – 1728 [13] Burits and Bucar, M.Burits and F Bucar (2000), Antioxidant activity of Nigella sativa essential oil, Phytotherapy Research 14, pp 323-328 [14] Byung – Sun Min, To Dao Cuong, Joon Seok Lee, Mi hee Woo, Tran Manh Hung (2010), Cholinesterase inhibitors from Cleistocalyx operculatus buds, Arch Pharm Res, 33 (10), 1665 – 1670 [15] Cuendet et Al.,M Cuendet, K.Hostettmann and O Potterat (1997), Iridiod glucosides with free radical scavenging properties from Fagraea blumei, Helvetica Chimica Acta 80 (1997), pp 1144-1152 [16] Chun – Lin Ye, Jian – Wen liu, Dong – Zhi Wei, Yan – Hua Lu, Feng Qian (2005), In vitro antitumor activity by 2’, 4’ – dihydroxy – 6’ – methoxy – 3’, 5’ – dimethylchalconein a solid human carcinoma xenograft model, Cancer chemother pharmacol, 55; 447 – 452 [17] Chun – lin Ye, Yan – Hua Lu, Dong – Zhi Wei (2004), Flavonoids from Cleistocalyx operculatus, Phytochemistry 65, 445 – 447 [18] Hadacek, F., Greger, H (2000), “Test of antifungal natural products methodolagies, comparability of result and assay choise”, Phytochem Anal., 90, 137-147 [19] Manar M Salem and Karl A Werbovetz (2005), Antiprotozal Compounds from Psorothamnus polydenius, j.Nat.Prod.68, 108 – 111 [20] Nguyen Thi Dung, Jung Min Kim, Sun Chul Kang, Chemical composition (2008), Chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of the essentialoil and the ethanol extract of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry buds, Food and chemical Toxicology 46, 3632 – 3639 82 [21] Nguyen Thi Dung, Vivek.K.Bajpai, jung In Yoon, Sun Chul Kang (2009), Anti – inflammatory effects of essential oil isolated from the bubs of cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr and perry, Food and chemical toxicology 47, 449 – 453 [22] Pual Cos, Louis Maes, Jean-Bosco Sindambiwe, Arnold J Vlietinck, Dirk Vanden Berghe (2005), Bioassay for antibacterial and antifungal activities, Laboratory for Microbiology, Parasitology and Hygien, Faculty of Pharmaceutical, Biomedical and VeterinarySciences, University of Antwerp, Belgium,1-13 [23] Truong Tuyet Mai, Nguyen Van Chuyen (2007), Anti – hyperglycemic activity of an aqueous extract from flower bubs of cleistocalyx operculatus (roxb.) Merr and Perry, Biosci, Biotechnol Biochem, 71 (1), 69 – 76 [24] To Dao Cuong, Tran Binh Tung, Phương Thien Thuong,Yoo SS, Kim EH, Kim SK, Oh WK (2010), C-Methylated flavonoids from Cleistocalyx operculatus and their inhibitory effrcts on novel ìnluenza A (H1N1), J Nat Prod [25] Woo AY, Waye MM, Kwan HS, Chan MC, Chau CF, Cheng CH (2002) Inhibition of Atpases by Cleistocalyx operculatus, A possible mechanism for the cardiotonic actions of the herb, Vasc pharmacol, 38, 163 – 168 [26] Zhang Feng Xian, Liu Meifang and Lu Renrong (1990), Chemical constituents from the bud of Cleistocalyx operculatus, Zhwu xuebao 32 (6), 469 Trang wed [27] http://www.caythuocvietnam.vn/ PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1.1 Phổ GC - MS xác định thành phần hóa học dung mơi n – hexan 1.2 Phổ GC – MS xác định thành phần hóa học dung môi n – hexan PHỤ LỤC 2.1 Phiếu trả kết thử hoạt tính kháng sinh 2.2 Phiếu trả kết hoạt tính chống oxy hóa DPPH PHỤ LỤC ... tài nghiên cứu ? ?Nghiên cứu chiết tách xác định thành phần hóa học số dịch chiết từ nụ vối? ?? Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu qui trình chiết hợp chất hóa học từ nụ vối - Xác định thành phần hóa học. .. học dịch chiết từ nụ vối - Thăm dị hoạt tính sinh học số dịch chiết từ nụ vối - Khảo sát phân lập xác định số công thức cấu tạo từ nụ vối Đối tượng phạm vi nghiên cứu Nụ vối đặt mua Bắc Giang định. .. ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRẦN THU HIỀN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT TỪ NỤ VỐI Chuyên ngành Mã số : Hóa hữu : 60.44.27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng