Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS, bệnh tai xanh) là một trong những bệnh quan trọng nhất, gây thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn trên phạm vi toàn cầu. Mặc dù đã có nhiều loại vacxin được sản xuất và sử dụng ở nhiều quốc gia với hy vọng sẽ khống chế và ngăn chặn được dịch bệnh này, nhưng cho đến nay hiệu lực bảo hộ của các vacxin PRRS vẫn chưa đạt được kết quả như mong muốn.
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ - 2017 ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG TIỀM NĂNG CỦA INTERFERON ALPHA TRONG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA LN ĐƯC TIÊM KHÁNG NGUYÊN GP5 TÁI TỔ HP CỦA VIRUS TAI XANH Trần Thị Thanh Hà1, Lý Đức Việt1, Nguyễn Thị Huyền1, Nguyễn Thị Lương , Đặng Thị Kiều Anh1, Đặng Vũ Hồng1 Takehiro KOKUHO2 TĨM TẮT Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRS, bệnh tai xanh) bệnh quan trọng nhất, gây thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn phạm vi tồn cầu Mặc dù có nhiều loại vacxin sản xuất sử dụng nhiều quốc gia với hy vọng khống chế ngăn chặn dịch bệnh này, hiệu lực bảo hộ vacxin PRRS chưa đạt kết qủa mong muốn Trong nghiên cứu này, ứng dụng hệ thống biểu baculovirus để sản xuất protein GP5 virus PRRS phân lập Việt Nam Kết nghiên cứu cho thấy protein GP5 tái tổ hợp sản xuất hệ thống baculovirus mang hoạt tính sinh học hoạt tính miễn dịch Đồng thời việc kết hợp protein GP5 tái tổ hợp interferon alpha làm tăng đáp ứng kháng thể đặc hiệu với virus PRRS, điều xác nhận kết IDEXX ELISA trung hòa virus Kết nghiên cứu cho thấy tiềm phát triển vacxin tái tổ hợp GP5 hệ thống baculovirus Việt Nam Từ khóa: Bệnh tai xanh, Khung đọc mở (GP5), Protein tái tổ hợp, Hệ thống biểu baculovirus Evaluation on influence of interferon alpha in swine immune response induced by recombinant GP5 protein of PRRSV Tran Thi Thanh Ha, Ly Duc Viet, Nguyen Thi Huyen, Nguyen Thi Luong, Dang Thi Kieu Anh, Dang Vu Hoang, Takehiro Kokuho SUMMARY Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) is one of the most important diseases causing economic loss in the global pig raising industry In spite of having many vaccine kinds were developed and used to prevent this disease in several countries, but up to date the protective efficacy of the current PRRS vaccines was limited In this study, the baculovirus expression system was used to produce recombinant GP5 protein from PRRS strain which was isolated in Viet Nam The studied results indicated that recombinant GP5 protein producing from Baculovirus system possessed both bioactive and immunity properties Also, the combination of recombinant GP5 protein and interferon alpha enhanced the specific antibody response with PRRSV (this was determined by IDEXX ELISA and VN Test) The result of this study indicated the potential for development of GP5 recombinant vaccine by using baculovirus system in Viet Nam Keywords: PRRS, Open reading frame (GP5), Recombinant protein, Baculovirus expression system Bộ môn Hóa sinh Miễn dịch - Viện Thú y Viện Thú y Nhật Bản KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ - 2017 I ĐẶT VẤN ĐỀ nghiên cứu gần (Du Y cs., 2012) Virus PRRS virus RNA sợi đơn dương xếp vào loài Nidovirales, họ Arteriviridae, giống Arterivirus, gần giống với virus gây viêm khớp ngựa (Equine arthritis virus - EAV), virus Lactic Dehydrogenase chuột (LDV) virus gây sốt xuất huyết khỉ (Simian Haemorrhagic Fever Virus- SHFV) (Thiel cs.; 1993) Đây là virus có vỏ bọc, hình cầu, đường kính từ 50-70 nm và chứa nhân nucleocapsid 25-35 nm Trên bề mặt có những gai nhô rất rõ Sự sinh sôi của virus bị dừng lại dùng chloroform hay ether, chứng tỏ vỏ có chứa lipid Virus có khả sinh sản tế bào đơn nhân tế bào đại thực bào, đồng thời có khả truyền qua thai, gây bệnh cho bào thai Virus có gen dễ bị thay đổi dẫn đến thay đổi tính kháng nguyên có khả trốn tránh hệ thống miễn dịch vật sinh nên nó có thể tồn tại rất lâu thể vật bị nhiễm (P.L.Delputte cs., 2004) Với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng cytokine đáp ứng miễn dịch trung hòa lợn virus PRRS, thực đề tài nghiên cứu “Đánh giá ảnh hưởng interferon alpha đến đáp ứng miễn dịch lợn tiêm kháng nguyên GP5 tái tổ hợp virus PRRS" Virus PRRS xâm nhập nhân lên đại thực bào (các tế bào có tác dụng bắt tiêu diệt tác nhân gây bệnh) Khi hình thành virion, virus phá hủy đại thực bào Virus PRRS có protein cấu trúc chính, là: (1) nucleocapsid protein (N, ORF 7), (2) protein xuyên màng (M, ORF 6) (3) glycoprotein (E, ORF5) Chuỗi hệ gen đầy đủ virus PRRS xác lập vào năm 1993, có kích thước khoảng 15,1 đến 15,5 kb chứa khung đọc mở (ORF) để mã hóa 20 protein đã định sẵn Hệ gen chứa vùng khơng dịch mã (UTR) vị trí 59 39 (Meulenberg cs., 1993) ORF 1a 1b định vị xi dòng 59-UTR, chiếm giữ khoảng 80% hệ gen ORF1a dịch trực tiếp ORF1b dịch khung dịch chuyển ribosomal, độ lún xuống chuỗi Protein ORF1ab lớn thủy phân protein thành sản phẩm liên quan đến chép virus phận (Nelsen CJ cs., 1999) Nhiều nghiên cứu rằng, protein GP5 protein mang hoạt tính miễn dịch quan trọng nhất, kích thích sản sinh kháng thể trung hòa lợn với virus PRRS Đồng thời, ảnh hưởng interferon alpha đến đáp ứng miễn dịch lợn tiêm vacxin PRRS Du cộng mô tả II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Tế bào côn trùng SF21AE High Five từ Trung tâm Phòng Kiểm soát dịch bệnh động vật, Viện thú y Nhât Interferon alpha từ công ty Nanogen, Việt Nam 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Biểu protein tái tổ hợp hệ thống baculovirus: Bac-to-Bac baculovirus expression system hãng invitrogen theo hướng dẫn nhà sản xuất - Phát nhanh baculovirus tái tổ hợp: phương pháp PCR theo công bố Barbara Malitscheck cs., 1999 - Đánh giá hoạt tính sinh học protein GP5 tái tổ hợp phương pháp IPMA sử dụng tế bào trùng theo Đặng Vũ Hồng cs., 2016 - Bất hoạt baculovirus mang protein GP5 tái tổ hợp: theo phương pháp Paloma Rueda cs., 2001 - Phương pháp ELISA: sử dụng kit IDEXX theo hướng dẫn nhà sản xuất - Phương pháp trung hòa virus: (VN Test) theo công bố Trần Thị Thanh Hà cs., 2012 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sản xuất protein GP5 tái tổ hợp virus PRRS hệ thống Baculovirus 3.1.1 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen ORF5 virus PRRS kỹ thuật RT-PCR Trong nghiên cứu này, tiến hành sản xuất tái tổ hợp protein GP5 virus PRRS qui trình thiết lập trước (Đặng Vũ Hoàng KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ - 2017 cs 2016) Để thiết kế cặp mồi đặc hiệu gen ORF5 virus PRRS, 20 trình tự gen ORF5 cơng bố ngân hàng liệu NCBI sử dụng để so sánh tìm trình tự đặc trưng Phần mềm FastPCR sử để tính tốn thơng số mồi, cho phép xác định trình tự mồi phù hợp với yêu cầu đặt Trình tự mồi đặc hiệu cho gen ORF5 thông số cặp mồi trình bày bảng ORF5-R: ATG TTG GGG AAA TGC TTG ACC GC ORF5-F: CTA AGG ACG ACC CCA TTG TTC CGC Bảng Trình tự mồi dùng để khuếch gen ORF5 virus PRRS thông số mồi Kết phản ứng PCR kiểm tra nhiệt độ bắt cặp tối ưu mồi (hình 1) cho thấy xuất băng DNA khoảng 600 bp bốn nhiệt độ bắt cặp khác nhau: 50, 55, 60 650C Kích thước phù hợp với kích thước dự kiến gen ORF5 virus PRRS theo thiết kế khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu (603 bp) Sản phẩm PCR gen ORF5 thu sử dụng làm nguyên liệu để thực nghiên cứu Hình Phổ điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR M, thang DNA chuẩn; giếng 1-4: sản phẩm RT-PCR với nhiệt độ bắt cặp mồi 50, 55, 60 65 oC KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ - 2017 3.1.2 Tạo baculovirus tái tổ hợp mang gen ORF5 sử dụng tế bào côn trùng SF21AE Việc sản xuất protein GP5 tái tổ hợp virus PRRS sử dụng hệ thống baculovirus tiến hành theo hướng dẫn nhà sản xuất công bố trước chúng tơi (Đặng Vũ Hồng cs., 2016) Để tạo baculovirus tái tổ hợp, dòng bacmid tái tổ hợp sử dụng để chuyển nạp vào tế bào côn trùng SF21AE theo hướng dẫn nhà sản xuất (Bac-to-Bac baculovirus expression System, invitrogen, Mỹ) Kết thể hình Hình Hình ảnh tế bào côn trùng SF21AE sau gây nhiễm Bacmid tái tổ hợp nuôi nhiệt độ 27oC sau 72 Kết cho thấy xuất bệnh tích tế bào (CPE) sau 72 nuôi cấy mẫu gây nhiễm bacmid tái tổ hợp (clone 1-8) Mẫu đối chứng không gây nhiễm với bacmid tái tổ hợp (control) phát triển bình thường hồn tồn không thấy xuất CPE Để tạo baculovirus tái tổ hợp có mang gen ORF5 virus PRRS, chúng tơi thực phản ứng PCR phát nhanh baculovirus tái tổ hợp với cặp mồi đặc hiệu gen ORF5 theo phương pháp công bố Barbara Malitscheck cs., 1999 Kết thể hình cho thấy dòng baculovirus tái tổ hợp xuất băng DNA với kích thước mong đợi gen ORF5 Từ kết thu được, chúng tơi kết luận tạo dịng baculovirus tái tổ hợp mang gen ORF5 virus PRRS Đoạn gen ORF5 từ baculovirus tái tổ hợp sử dụng để xác định trình tự nucleotide Trình tự gen khung đọc đoạn gen ORF5 trình bày hình KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ - 2017 Hình Phổ điện di sản phẩm PCR M, thang DNA chuẩn; 1-8, sản phẩm PCR sử dụng baculovirus tái tổ hợp mang gen ORF5 virus PRRS Kết cho thấy trình tự đoạn gen ORF5 virus PRRS gồm 603 nucleotidee từ mã đầu (mã ATG) mã cuối (mã TAG) nằm gen ORF5 Hình Trình tự gen khung đọc gen ORF5 virus PRRS Đồng thời, trình tự gen thu được sử dụng để blast lên ngân hàng liệu NCBI Kết thể hình cho thấy đoạn gen ORF5 nghiên cứu có độ tương đồng 99% Hình Kết so sánh trình tự gen nhận diện lồi sử dụng cơng cụ Blast trình tự gen ORF5 virus PRRS ngân hàng NCBI KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ - 2017 so sánh với gen ORF5 virus PRRS phân lập Học viện Nông nghiệp Việt Nam, chủng KTY-PRRS-02 (Accession No LC102500.1) 3.1.3 Kiểm tra hoạt tính sinh học protein GP5 tái tổ hợp phương pháp Immunoperoxidase monolayer assay (IPMA) tế bào côn trùng High FIVE A Để kiểm tra hoạt tính sinh học protein GP5 tái tổ hợp, tiến hành phương pháp IPMA sử dụng tế bào trùng dịng High FIVE nhằm phát có mặt protein GP5 tái tổ hợp Các bước tiến hành theo phương pháp cơng bố trước (Đặng Vũ Hồng cs., 2016) Kết trình bày hình B Hình Kết IPMA sử dụng tế bào trùng High FIVE gây nhiễm với baculovirus tái tổ hợp sau 72 A Huyết chuẩn âm: Huyết lợn SPF âm tính với PRRSV; B Huyết chuẩn dương: Huyết lợn SPF gây tối miễn dịch với PRRSV cường độc Kết hình cho thấy giếng sử dụng huyết lợn SPF âm tính với virus PRRS nhuộm thấy tế bào không bắt màu, giếng sử dụng huyết gây tối miễn dịch với virus PRRS ngược lại, tế bào bắt màu nâu đỏ nguyên sinh chất nhuộm Chứng tỏ protein GP5 tái tổ hợp phản ứng mạnh nhận diện bới kháng thể tự nhiên kháng virus PRRS Điều chứng tỏ, protein GP5 tái tổ hợp hệ thống biểu baculovirus mang đặc tính sinh học tự nhiên 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng interferon alpha đến đáp ứng miễn dịch trung hòa với virus PRRS lợn tiêm kháng nguyên GP5 tái tổ hợp 3.2.1 Bất hoạt baculovirus mang protein GP5 tái tổ hợp BEI Baculovirus mang protein GP5 tái tổ hợp xử lý với 10mM BEI 48h theo phương pháp 10 công bố Paloma Rueda cs., 2001 Để khẳng định baculovirus bất hoạt, sử dụng tế bào côn trùng High FIVE gây nhiễm với baculovirus bất hoạt BEI Đối chứng dương sử dụng baculovirus không bất hoạt (active baculovirus) Sau 72 gây nhiễm, chúng tơi quan sát bệnh tích tế bào (CPE), kết trình bày hình Kết hình cho thấy: xuất bệnh tích tế bào (CPE) sau 72 nuôi cấy giếng gây nhiễm với baculovirus không bất hoạt (active baculovirus) Giếng đối chứng không gây nhiễm với baculovirus (Negative Control) giếng gây nhiễm với virus baculo bất hoạt BEI (BEIinactivated baculovirus), tế bào phát triển bình thường hồn tồn khơng thấy xuất CPE, kết cho thấy baculovirus mang protein GP5 tái tổ hợp bất hoạt hồn tồn sử dụng thí nghiệm lợn nhằm đánh giá tính sinh miễn dịch GP5 tái tổ hợp vai trò KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ - 2017 interferon alpha đáp ứng miễn dịch trung hịa gây kháng ngun GP5 lợn Hình Tế bào côn trùng High FIVE gây nhiễm với baculovirus tái tổ hợp bất hoạt 10mM BEI 48 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng tiềm Interferon alpha đáp ứng miễn dịch lợn tiêm kháng nguyên GP5 tái tổ hợp virus PRRS Nhằm đánh giá hoạt tính miễn dịch protein GP5 tái tổ hợp vai trò interferon alpha đáp ứng miễn dịch trung hòa với virus PRRS lợn tiêm kháng nguyên GP5 tái tổ hợp, chọn lợn 35 ngày tuổi khơng có kháng thể kháng virus PRRS, dịch tả lợn PCV2 Bố trí thí nghiệm trình bày bảng Bảng Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng interferon alpha đến đáp ứng miễn dịch trung hòa với virus PRRS lợn tiêm kháng nguyên GP5 tái tổ hợp Ngày tiêm Đối chứng (n=3) Tiêm kháng nguyên GP5 tái tổ hợp (n=3) Ngày Tiêm PBS A GP5 kết hợp bổ trợ Freund hoàn toàn - GP5 kết hợp bổ trợ Freund hoàn toàn (Freund’s complete adjuvant) - Interferon alpha với liều 5000 UI/lợn (Liều: 5.0x107 pfu) (Nanogen Co Vietnam) Ngày Tiêm PBS GP5 kết hợp bổ trợ Freund khơng hồn tồn (Freund’s Incomplete Adjuvant) GP5 kết hợp bổ trợ Freund khơng hồn tồn Ngày 21 Tiêm PBS GP5 kết hợp bổ trợ Freund khơng hồn tồn GP5 kết hợp bổ trợ Freund khơng hồn tồn B Mẫu huyết lợn thu thập ngày 0, 7, 14, 21, 28, 35 42 sau tiêm đánh giá kít ELISA thương mại (IDEXX laboratories, inc) theo hướng dẫn nhà sản xuất phương pháp trung hịa virus (VN Test) theo cơng bố Trần Thị Thanh Hà cs., 2012 Kểt trình bày hình Kết hình cho thấy, nhóm tiêm kháng nguyên GP5 tái tổ hợp kết hợp interferon alpha phát kháng thể kháng virus PRRS sau Tiêm kháng nguyên GP5 kết hợp Interferon alpha (n=3) tiêm 21 ngày, nhóm lợn tiêm kháng nguyên GP5 tái tổ hợp, kháng thể kháng virus PRRS xuất muộn ngày so với nhóm tiêm kháng nguyên GP5 kết hợp với interferon Cả hai nhóm thí nghiệm cho kết duơng tính mạnh (căn vào S/P ratio) từ ngày 35 đến ngày 42 sau tiêm, so sánh với nhóm đối chứng (tiêm PBS) Kết hoàn toàn phù hợp với cơng bố trước đây, lợn tiêm vacxin PRRS kết hợp với Interferon alpha làm tăng đáp 11 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ - 2017 Hình Kết ELISA phát kháng thể kháng virus PRRS huyết lợn tiêm kháng nguyên GP5 tái tổ hợp Interferon alpha ứng kháng thể đặc hiệu với virus PRRS (Wasin Charermtantanakul, 2009) Đồng thời, kết cho thấy vai trò tiềm interferon alpha chất bổ trợ vacxin nhằm nâng cao hiệu lực miễn dịch vacxin phòng bệnh tai xanh lợn, đặc biệt với vacxin tái tổ hợp Nhằm khẳng định vai trò interferon alpha đáp ứng miễn dịch trung hòa với virus PRRS lợn tiêm kháng nguyên GP5 tái tổ hợp, chúng tơi tiến hành phản ứng trung hịa virus (VN Test) với mẫu huyết thu thập ngày 42 sau tiêm Kết trình bày bảng Bảng Kết phản ứng trung hòa virus với huyết lợn tiêm kháng nguyên GP5 tái tổ hợp kết hợp với Interferon alpha Nhóm thí nghiệm Nhóm đối chứng (tiêm PBS) Kết ELISA (S/P ratios) 0.319 Kết VNT (Log2) Tiêm protein GP5 kết hợp Interferon alpha 1.952 6.00 Tiêm protein GP5 1.642 5.00 Mẫu đối chứng âm chuẩn 0.162 Mẫu đối chứng dương 3.803 8.00 Kết bảng cho thấy, mức độ trung hòa kháng thể hai nhóm thí nghiệm cao, ngày 42, nhóm tiêm GP5 kết hợp với Interferon alpha cao nhóm tiêm kháng ngun GP5 12 Khơng có tượng trung hịa kháng thể quan sát nhóm đối chứng (tiêm PBS) Kết cho thấy kháng nguyên GP5 có khả tạo đáp ứng miễn dịch trung hịa với virus PRRS KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ - 2017 Interferon alpha làm tăng đáp ứng miễn dịch lợn tiêm protein tái tổ hợp GP5 IV KẾT LUẬN Ứng dụng thành công hệ thống biểu Baculovirus việc sản xuất protein GP5 tái tổ hợp virus PRRS phân lập Việt Nam, protein GP5 tái tổ hợp hệ thống baculovirus mang hoạt tính sinh học tính sinh miễn dịch tự nhiên, ứng cử viên tiềm để sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Tai xanh Việt nam Đồng thời Interferon alpha hoàn toàn phù hợp vai trò chất bổ trợ vắc xin tái tổ hợp nhằm nâng cao tính sinh miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp GP5 virus PRRS Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu phát triển hồn thiện vacxin tái tổ hợp GP5 dùng phịng bệnh tai xanh Việt Nam Đồng thời phát triển hướng nghiên cứu xây dựng ngân hàng cytokine tái tổ hợp lợn (porcine cytokine bank) để phục vụ công tác nghiên cứu phát triển hệ thống cytokine bổ trợ vacxin hệ mới, phục vụ công tác phịng chống dịch bệnh cho vật ni Việt Nam Lời cảm ơn: Tác giả xin chân thành cảm ơn Tiến sỹ Michihiro Takagi, Viện Thú y Quốc gia Nhật Bản tặng mẫu huyết lợn SPF âm tính mẫu huyết gây tối miễn dịch với virus PRRS cường độc dùng làm mẫu đối chứng nghiên cứu Tác giả xin bày tỏ cám ơn đến PGS.TS Tô Long Thành cán thuộc phịng virus, Trung tâm chẩn đốn Thú y Trung ương hỗ trợ để hồn thành cơng trình TÀI LIỆU THAM KHẢO Thiel HJ, Meyers G, Stark R, Tautz N, Rumenapf T, et al (1993), “Molecular characterization of positive strand RNA viruses: pestiviruses and the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)” Arch Virol Suppl, 7, pp 41-52 Du Y1, Qi J, Lu Y, Wu J, Yoo D, Liu X, Zhang X, Li J, Sun W, Cong X, Shi J, Wang J (2012) Evaluation of a DNA vaccine candidate co-expressing GP3 and GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) with interferon α/γ in immediate and long-lasting protection against HP-PRRSV challenge Virus Genes Dec;45(3):474-87 Meulenberg JJ, Hulst MM, de Meijer EJ, Moonen PL, den Besten A, et al (1993), “Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV” Virology, 192, pp 62–72 Barbara Malitschek and Manfred Schartl (1991) Rapid identification of recombinant baculovirus using PCR, Biotechnology, vol 11, No Nelsen CJ, Murtaugh MP, FabergKS (1999) “Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents” J Virol, 73, pp 270–280 Rueda P, Fominaya J, Langeveld JP, Bruschke C, Vela C, Casal JI Effect of different baculovirus inactivation procedures on the integrity and immunogeniCity of porcine parvovirus-like particles Vaccine 2000;19(7– 8):726–34 Đặng Vũ Hoàng, Trương Quốc Phong, Trần Thị Thanh Hà, Nguyễn Thị Huyền, Takehiro Kokuho cs (2016) Ứng dụng hệ thống biểu baculovirus nhằm sản xuất protein ORF2 tái tổ hợp virus PCV2 Tạp chí KHKT Thú y Tập XXIII, Số 2, 14-21 Trần Thị Thanh Hà, Ken Inui, Phạm Thị Nga, Đặng Xuân Sinh, Trịnh Quang Đại, Trương Anh Đức và Ngũn Viết Khơng, 2012, Phản ứng trung hịa virus PRRS ni cấy tế bào ứng dụng Tạp chí KHKT Thú y Tập XVIII, Số Charerntantanakul W (2009), Adjuvants for porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines Vet Immunol Immunopathol 15;129 (1-2):1-13 Nhận ngày 8-8-2016 Phản biện ngày 5-9-2016 13 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ - 2017 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ NGUY CƠ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH PHÁT SINH VÀ LÂY LAN HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LN (PRRS) TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH THÁI BÌNH Trịnh Đình Thâu1, Phạm Văn Lý2 TĨM TẮT Tình hình dịch bệnh PRRS tỉnh Thái Bình khảo sát số xã thuộc huyện: (Vũ Thư, Kiến Xương TP Thái Bình, tỉnh Thái Bình) phương pháp xử lý số liệu lưu trữ điều tra, vấn chủ hộ chăn nuôi Kết khảo sát cho thấy năm 2013, tỉnh Thái Bình có 528 lợn mắc PRRS, chiếm 0,05% tổng đàn lợn tỉnh, số lợn chết 104 con, chiếm 19,70% số lợn bệnh Nghiên cứu xác định yếu tố nguy làm phát sinh lây lan PRRS với giá trị OR từ 2,10 đến 3,05, bao gồm: Trang trại ni lợn có đường giao thơng qua hay gần khu vực chợ buôn bán gia súc, gia cầm sống; lợn nuôi khơng tiêm phịng bệnh truyền nhiễm nguy hiểm khác; nguồn gốc giống không rõ ràng; chuồng trại nuôi không sử dụng thuốc sát trùng, vệ sinh tiêu độc định kỳ; sử dụng nước ao hồ công cộng để chăn ni thời gian có dịch; người ni bán chạy lợn thời gian có dịch Từ khóa: Lợn, PRRS, Tình hình dịch bệnh, Yếu tố nguy cơ, Tỉnh Thái Bình Study on some risky factors affecting the spread of PRRS epidemic in Thai Binh province Trinh Dinh Thau, Pham Van Ly SUMMARY Situation of PRRS epidemic in Thai Binh province was surveyed at some representative communes of Vu Thu and Kien Xuong districts, Thai Binh province The study was carried out by analyzing the secondary data and conducting the survey through interviewing the pig raising farmers The surveyed results showed that in 2013, there were 528 PRRS infection pigs accounting for 0.05% of total pig number in the province Of which, the number of dead pigs were 104, accounting for 19.70% of the infection pigs There were risky factors associating with the spread of PRRS epidemic with OR value from 2.10 to 3.05 identified These factors including: The farms had the main roads passing or located closely to the alive poultry/animal markets; The pigs were not vaccinated for other dangerous diseases; The piglet origin was not clear; The disinfectants were not used for routine disinfection in the farms; The water from community ponds/reservoirs was used in the farms during PRRS outbreak period; The farmers sold the pigs illegally in the areas and periods that PRRS was being outbroken Keywords: Pig, PRRS, Infection rate, Risky factor, Thai Binh province I ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng rối loạn hơ hấp sinh sản lợn (PRRS), hay cịn gọi bệnh tai xanh, bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, lây lan nhanh Học viện Nông nghiệp Việt Nam Chi cục Thú y tỉnh Thái Bình 14 làm chết nhiều lợn Nguyên nhân gây bệnh virus PRRS, làm thiệt hại kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi Ở Việt Nam từ tháng 3/2007 đến nay, bệnh trở thành đại dịch nhiều địa phương làm tổn thất lớn kinh tế cho người chăn ni, phải kể đến tỉnh Thái Bình (Cục Thú y, 2008, 2009, 2010, 2011) KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ - 2017 Trong năm gần đây, đàn lợn tỉnh Thái Bình phát triển mạnh tốc độ giá trị sản xuất Tuy nhiên, dịch bệnh làm nhiều lợn ốm, chết Do việc nghiên cứu, tìm hiểu hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn có ý nghĩa quan trọng cấp thiết q trình phịng chống dịch bệnh đạt hiệu quả, giảm thiệt hại dịch bệnh gây kê, Chi cục thú y, Trạm thú y (số liệu thứ cấp) tiêu: tổng số lợn, số lợn ốm, số lợn chết tiêu hủy PRRS Mục đích nghiên cứu này, nhằm xác định tình hình dịch bệnh PRRS lợn Thái Bình năm 2013 đánh giá yếu tố nguy gây bùng phát bệnh tai xanh đàn lợn địa bàn nghiên cứu - Đánh giá yếu tố nguy có ảnh hưởng đến q trình phát sinh và lây lan bệnh PRRS lợn địa bàn tỉnh Thái Bình năm 2013: II NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Dùng bảng hỏi (phiếu điều tra) để điều tra hộ chăn nuôi; kết hợp vấn cán thú y sở để thu thập thêm thơng tin + Gần đường giao thơng + Gần chợ buôn bán giết mổ động vật sản phẩm động vật + Khơng tiêm phịng bệnh truyền nhiễm nguy hiểm 2.1 Nội dung nghiên cứu Tình hình dịch bệnh PRRS lợn tỉnh Thái Bình năm 2013 Đánh giá yếu tố nguy ảnh hưởng đến trình phát sinh lây lan bệnh PRRS lợn địa bàn tỉnh Thái Bình năm 2013 Đề tài tiến hành từ tháng 8/2013 đến tháng 7/2014 xã Vũ Vân, Vũ Đoài (huyện Vũ Thư), xã Phú Xn (thành phố Thái Bình), xã Vũ Hịa (huyện Kiến Xương) 2.2 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Vật liệu - Số liệu điều tra tình hình chăn ni lợn tình hình dịch bệnh PRRS lợn, thu thập thông qua tài liệu lưu trữ Cục thống Nhân tố 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu + Nguồn gốc giống không rõ ràng + Không sử dụng thuốc sát trùng để vệ sinh tiêu độc định kỳ + Sử dụng nước ao hồ công cộng để chăn nuôi lợn + Bán chạy lợn - Xử lý phầm mềm Microsoft Excel 2007 liệu để biết số hộ chăn nuôi lợn mắc bệnh không mắc bệnh PRRS - Sử dụng phần mềm Epicalc 2000 để xác định yếu tố nguy có liên quan hay khơng liên quan đến việc phát sinh lây lan dịch bệnh PRRS theo phương pháp nghiên cứu bệnh chứng hay hồi cứu (case-control studies), Bệnh Có mắc Khơng mắc Tổng số Có yếu tố nguy a b a+b Khơng có yếu tố nguy c d c+d Tổng số a+c b+d a+b+c+d = N Sử dụng phép thử χ2 (khi bình phương) (Chi-square) để có kết luận mối liên quan yếu tố nguy số hộ có lợn mắc bệnh 15 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ - 2017 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thái Bình năm 2013 3.1 Tình hình dịch bệnh PRRS lợn Kết trình bày bảng Bảng Tình hình dịch bệnh PRRS lợn Thái Bình năm 2013 Số lợn ốm (con) Tỷ lệ (%) Số chết, xử lý (con) Tỷ lệ (%) 180.253 0,00 0 0,00 164.628 0,00 0,00 151.596 129 0,09 22 17,05 Quỳnh Phụ 156.911 0,00 0,00 Thái Thụy 107.789 0,00 0,00 TP Thái Bình 40.503 138 0,34 19 13,77 Tiền Hải 92.045 0,00 0,00 Vũ Thư 167.796 261 0,16 63 24,14 1.061.521 528 0,05 104 19,70 TT Huyện/Thành Tổng số lợn (con) Đông Hưng Hưng Hà Kiến Xương Tổng số Từ đầu tháng 4/2013, qua triển khai công tác hoạt động kiểm dịch lưu động, kết hợp với giám sát thường xuyên, phát dịch bệnh tai xanh đàn lợn 117 hộ chăn nuôi 23 thôn thuộc xã: Vũ Hoà (huyện Kiến Xương), Vũ Vân, Vũ Đoài (huyện Vũ Thư) xã Phú Xuân (thành phố Thái Bình) với tổng số lợn mắc bệnh 528 (128 lợn nái, 313 lợn thịt, 87 lợn sữa) tổng đàn 1.283 con, số lợn điều trị khỏi bệnh 424 (108 lợn nái, 280 lợn thịt, 36 lợn sữa); số lợn chết bị tiêu huỷ 104 (20 lợn nái, 33 lợn thịt, 51 lợn sữa), chiếm 19,69 % số lợn ốm Số lợn ốm mắc bệnh PRRS năm 2012 81 con, số lợn chết xử lý 25 (Chi cục thú y Thái Bình, 2012) Như vậy, so với năm 2012, số lợn ốm mắc bệnh tai xanh tăng 6,52 lần, số lợn chết phải xử lý tăng 4,16 lần Nguyên nhân tỷ lệ tiêm phòng vacxin PRRS đàn lợn đạt thấp hệ thống giám sát, phát dịch sở nhiều hạn chế, phát chậm, báo cáo chậm 3.2 Yếu tố nguy làm ảnh hưởng đến 16 trình phát sinh và lây lan dịch bệnh PRRS lợn Thái Bình năm 2013 Việc kiểm sốt yếu tố nguy hộ chăn nuôi quan trọng cần phải triển khai thường xuyên, nhằm kiểm sốt có hiệu dịch bệnh Mặt khác, cơng tác kiểm dịch, vận chuyển cần trọng khắc phục tồn tại, bất cập để ngăn chặn virus PRRS lây lan gây bệnh vận chuyển gia súc mang trùng Chúng tiến hành thu thập thông tin điều tra theo biểu mẫu, sau có thống kê số liệu theo yếu tố phân tích, kết ảnh hưởng yếu tố nguy đến việc làm phát tán lây lan dịch bệnh PRRS Thái Bình năm 2013 phân tích sau: 3.2.1 Gần đường giao thơng Chúng tơi điều tra 120 hộ chăn ni lợn, mối liên hệ số hộ chăn ni lợn có dịch PRRS khơng có dịch PRRS với yếu tố có khu vực chăn ni gần đường giao thơng thể qua bảng KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ - 2017 Bảng Kết điều tra mối liên hệ yếu tố đường giao thơng số hộ chăn ni có dịch PRRS lợn Thái Bình năm 2013 Khu vực chăn nuôi gần đường giao thông Có dịch PRRS Khơng có dịch PRRS Tổng hàng Hộ có 27 15 42 Hộ khơng 33 45 78 Tổng cột 60 60 120 Bảng cho thấy p = 0,021637 < 0,05, bác bỏ H0 Các hộ chăn ni lợn gần đường giao thơng có liên quan làm tăng nguy mắc bệnh PRRS lợn Thái Bình gấp 2,45 lần (95% CI 1,13-5,33) so với hộ khơng có đường giao thơng qua 3.2.2 Chăn nuôi gần chợ buôn bán gia súc, P OR 0,021637