Mục tiêu của luận án là xây dựng và phát triển phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử và phổ hồng ngoại phản xạ kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến nhằm định lượng nhanh, chính xác một số hợp chất methylxanthines có mặt trong chè Việt Nam mà không cần tách loại chúng trên nền mẫu thực. Xây dựng và phát triển phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử và phổ hồng ngoại phản xạ kết hợp với thuật toán thống kê đa biến nhằm phân loại nguồn gốc địa lý chè Việt Nam dựa trên cùng dữ liệu phổ.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ HUẾ NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT NHÓM METHYLXANTHINES TRONG CHÈ VÀ PHÂN LOẠI CHÈ VIỆT NAM DỰA TRÊN DỮ LIỆU PHỔ CHUYÊN NGÀNH: Hóa Phân tích MÃ SỐ: 62440118 DỰ THẢO TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC - 2019 HÀ NỘI Cơng trình đƣợc hồn thành tại: - Khoa Hóa học – Trường ĐH Khoa học Tự nhiên – ĐH Quốc gia Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: - PGS.TS Tạ Thị Thảo - PGS.TS Nguyễn Văn Ri DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN Viết tắt ANN CF DA HPLC IR LC LOD LOQ MC MS MSC PC PCA PCR PLS R RB Re RMSE SANAS SNV TB TP UV-Vis LD PT TN CTK Tiếng Anh Tiếng Việt Artificial Neural Networks Caffeine Discriminant Analysis High performer liquid chromatography Infrared reflectance spectroscopy Liquid chromatography Limit of detection Limit of quantification Mean centreing Mass Spectrometry Multiplicative scatter correction Principal Component Principal Component Analysis Principal Component Regreesion Partial Least Squares Coeficient Regression Robinson Briston Recovery Root mean square error Standad addition net analyte signal Standad normal transformation Theobromine Theophylline Ultraviolet-visible Mạng nơron nhân tạo Cafein Phân tích biệt thức Sắc ký lỏng hiệu cao Phổ hồng ngoại Sắc ký lỏng Giới hạn phát Giới hạn định lượng Phổ trung bình Phổ khối Hiệu chỉnh phân tán nhiều lần Cấu tử Phân tích cấu tử Hồi quy cấu tử Bình phương tối thiểu phần Hệ số tương quan Hệ đệm Robinson Briston Độ thu hồi Hệ số biến thiên Phân tích thêm chuẩn đa biến Biến đổi chuẩn hóa Theobromin Theophyllin Vùng tử ngoại – khả kiến Lâm Đồng Phú Thọ Thái Nguyên Các tỉnh khác GIỚI THIỆU VỀ LUẬN ÁN Tính cấp thiết Luận án Chè (Camellia sinensis L.o Kuntze) từ lâu đồ uống quen thuộc người sử dụng rộng rãi nhiều quốc gia giới, đặc biệt Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam Nhiều nghiên cứu rằng, số methylxanthines poliphenols chè có tác dụng phịng chống nhiều bệnh bao gồm bệnh tim mạch, hen suyễn, gan, bệnh miệng đặc biệt có tác dụng phịng tránh, giảm nguy mắc bệnh ung thư Trong chè, nhóm methylxanthines gồm ba chất caffeine, theobromine theophyline quan tâm đặc biệt có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như: caffeine có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, tim hơ hấp; theobromine theophyline chất có tác dụng làm giãn trơn Hiện nay, nhu cầu sử dụng chè lớn đặc biệt loại chè có chất lượng cao dẫn tới thực trạng sản phẩm chè tiếng bị làm nhái thương hiệu với chất lượng không đảm bảo, nguồn gốc không rõ ràng Trước thách thức trên, việc kiểm soát chất lượng truy xuất nguồn gốc sản phẩm dần trở thành nhu cầu tất yếu mang lại lợi ích thiết thực cho nhà sản xuất người tiêu dùng Trên giới, nghiên cứu xác định đồng thời hàm lượng methylxanthines chè chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (High performer Liquid Chromatography-HPLC) Ngoài ra, nhà khoa học quan tâm phát triển nhóm phương pháp phổ quang phổ hấp thụ phân tử (Ultraviolet – Visible spectroscopy-UV-Vis) quang phổ hồng ngoại phản xạ (Infrared reflectance spectroscopy – IR) kết hợp với thuật toán thống kê đa biến cho phép xác định đồng thời methylxanthines thực phẩm So với phương pháp phân tích hóa học, định lượng thực phẩm phổ UV-Vis phổ IR có ưu điểm trội, khơng phải xử lý mẫu, phân tích nhanh, giá thành rẻ Hiện nay, Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu xác định đồng thời hàm lượng methylxanthines chè phân loại chè theo nguồn gốc địa lý dựa liệu phổ UV-Vis, IR kết hợp với phân tích thống kê đa biến Xuất phát từ lý nêu trên, đề tài luận án Tiến sĩ: “Nghiên cứu phân tích số chất nhóm methylxanthines chè phân loại chè Việt Nam dựa liệu phổ” thực với mục tiêu Mục tiêu Luận án -Xây dựng phát triển phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử phổ hồng ngoại phản xạ kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến nhằm định lượng nhanh, xác số hợp chất methylxanthines có mặt chè Việt Nam mà không cần tách loại chúng mẫu thực - Xây dựng phát triển phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử phổ hồng ngoại phản xạ kết hợp với thuật toán thống kê đa biến nhằm phân loại nguồn gốc địa lý chè Việt Nam dựa liệu phổ Những đóng góp Luận án - Nghiên cứu Việt Nam xây dựng phương pháp phổ IR, UV-Vis phân tích định lượng methylxanthines chè Việt Nam - Nghiên cứu Việt Nam xây dựng phương pháp phân loại nguồn gốc địa lý chè Việt Nam dựa liệu phổ IR, UV-Vis Cấu trúc luận án Luận án gồm chương, 32 bảng, 38 hình phụ lục, 110 tài liệu tham khảo Luận án gồm 129 trang, gồm phần chính: Đặt vấn đề (4 trang); Tổng quan (35 trang); Thực nghiệm (18 trang); Kết nghiên cứu bàn luận (70 trang); Kết luận Kiến nghị (2 trang) NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung chè thị trƣờng chè Việt Nam 1.1.1 Phân loại chè Việt Nam Chè có tên khoa học Camellia sinensis, loại xanh lưu niên mọc thành bụi nhỏ, thông thường cắt tỉa để thấp mét (6 ft) trồng để lấy Ở Việt Nam, chè phân bố tự nhiên tập trung vùng trung du miền núi nhiệt độ 15-230C, độ cao so với mực nước biển 1000 mét số tỉnh miền núi phía Bắc: Thái Nguyên, Phú Thọ, Hà Giang, … Lâm Đồng Tùy theo giống chè, điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng, kĩ thuật chăm bón, canh tác, chế biến thành phần hóa học giá trị kinh tế chè khác có cách thức phân loại chè khác nhau: phân loại theo nguồn gốc thực vật, theo cách thức chế biến, theo nguồn gốc địa lý [4] 1.1.2 Thành phần hóa học chè Chất lượng chè thành phẩm định thành phần hóa học nguyên liệu kỹ thuật chế biến Thành phần sinh hóa chè biến đổi phức tạp phụ thuộc vào giống, tuổi chè, điều kiện thổ nhưỡng, kỹ thuật canh tác, kĩ thuật chế biến… Trong thành phần chè xanh, nước chiếm 75- 80%, 20% tanin (hỗn hợp catechine dẫn xuất chúng), 3-4% caffeine, hàm lượng chất khác (bảng 1.1) [4, 97] 1.2 Giới thiệu methylxanthines 1.2.1 Đặc điểm cấu tạo tính chất Xanthine purine sở tìm thấy hầu hết mô chất người sinh vật khác Methylxanthine dẫn xuất methyl hóa xanthine, chúng hợp chất hữu dị vòng xây dựng từ vòng pyrimidinedione imidazole Methylxanthines bao gồm caffeine, theobromine, theophylline, aminophylline, paraxanthine, pentoxifylline, IBMX Các methylxanthines thường dùng chất kích thích nhẹ, giãn phế quản điều trị triệu chứng hen suyễn Trong chè, cà phê, ca cao thường tìm thấy ba methylxanthines caffeine (1,3,7-trimethylxanthine), theophylline (1,3-dimethylxanthine) theobromine (3,7-dimethylxanthine) Công thức cấu tạo methylxanthines thể bảng 1.3 [63] 1.2.2.Tác dụng sinh hóa Trong ba methylxanthines (caffeine, theobromine theophylline), caffeine chiếm khối lượng lớn nhất, theobromine theophylline chiếm lượng nhỏ Ví dụ: caffeine ước tính chiếm 0,4-2,4% trọng lượng khô cà phê 2-5% chè; theobromine theophylline chiếm khoảng 0,33% trọng lượng khô chè Methylxanthines có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, làm cho tinh thần minh mẫn, chất kích thích tăng cường hoạt động tim 1.3 Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng methylxanthines chè 1.3.1 Phương pháp săc kí lỏng hiệu cao Phương pháp HPLC phương pháp phổ biến, áp dụng nhiều phân tích định lượng methylxanthines chè Theo nghiên cứu giới, pha tĩnh sử dụng phổ biến C18 với kích thước cột khác Pha động thường dung môi phân cực H2O, MeOH, ACN…hay hỗn hợp hay dung môi theo tỷ lệ định Một số loại detector sử dụng như: detector quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis), detector khối phổ (MS) …[17, 24, 34, 65, 66] Ở Việt Nam, theo TCVN 9744:2013 qui định phương pháp HPLC để xác định hàm lượng cafein chè xanh sau: Caffeine mẫu chè xanh chiết cách cho hồi lưu với nước có magie oxit Sau lọc, hàm lượng caffeine định lượng HPLC với điều kiện: detector UV-273nm, cột tách C18 Partisphere kích thước 110 mm x 4,6 mm với hệ thống HPLC hãng Whatman, dung môi pha động methalnol:nước (30:70, v/v), tốc độ dòng 1,0 ml/phút 1.3.2 Phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến Định lượng hợp chất hữu phổ hồng ngoại có ưu điểm trội đơn giản q trình tiền xử lý mẫu, lượng mẫu phân tích ít, khơng cần phá hủy mẫu phân tích, q trình chuẩn bị mẫu đơn giản, chi phí thấp hạn chế sai số trình chuẩn bị mẫu vịng hai thập kỉ trở lại có nhiều cơng trình nghiên cứu định lượng hợp chất hữu ích chè Các mẫu chè thường đo phổ hồng ngoại phản xạ vùng số sóng 10.000 – 4000 cm-1 Dữ liệu phổ hồng ngoại kết hợp thuật toán hồi quy đa biến PLS định lượng thành công methylxanthines, poliphenols mẫu chè Các thuật toán tiền xử lý số liệu SNV, MSC, MC ứng dụng để thu kết tốt [32, 37, 50, 70, 74, 82, 102] 1.3.3 Phương pháp phổ quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến Trên giới, nhà khoa học nghiên cứu phát triển phương pháp UV-Vis với mục đích định lượng methylxanthines mẫu phức tạp chè, cà phê [49, 49, 60, 75, 92]… Để loại bỏ tannin mẫu, mẫu chè sau ủ nước nóng 1000C loại bỏ tannin cách thêm dung dịch chì acetaete, lượng chì acetate loại bỏ dung dịch natri cacbonate Dung dịch sau loại tannin đo phổ hấp thụ UV-Vis khoảng bước sóng 200-400 nm Ma trận liệu phổ xử lý mơ hình hồi quy tuyến tính PLS [59] mơ hình hồi quy phi tuyến tính ANN [49] nồng độ cafein, theobromin xác định phương pháp HPLC Tuy nhiên, với phương pháp nghiên cứu dừng lại việc xác định nồng độ CF mẫu chè, TB TP với hàm lương nhỏ nên định lượng 1.4 Ứng dụng thống kê đa biến phân loại chè 1.4.1 Các phương pháp nhận dạng phân loại đối tượng 1.4.2 Phân loại chè dựa liệu hàm lượng chất phân tích mẫu Chè phân loại dựa hàm lượng hợp chất hữu chiếm lượng lớn chè catechin, methylxathines, axit gallic… [27, 31, 41] dựa vào hàm lượng kim loại chè [13, 58, 64, 71, 98, 105] 1.4.3 Phân loại chè dựa liệu phổ kết hợp thống kê đa biến Trong năm gần đây, có nhiều cơng trình nghiên cứu sử dụng phương pháp phổ IR, UV-Vis, NMR… kết hợp với phương pháp thống kê đa biến nhằm mục đích phân loại nguồn gốc chè [28, 38, 61, 62, 67, 95, 105] 1.3 Kết luận phần tổng quan Thông qua tổng quan nhận thấy cần thiết xây dựng phát triển phương pháp định lượng methylxanthines phân loại nguồn gốc địa lý chè Việt Nam dựa liệu phổ thực tiễn trên, luận án tiến sĩ “Nghiên cứu phân tích số chất nhóm methylxanthines chè phân loại chè Việt Nam dựa liệu phổ” thực với nội dung sau: (1) Phát triển phương pháp tiêu chuẩn HPLC để phân tích chất nhóm methylxanthines chè xanh làm sở liệu cho phân tích phương pháp UV-Vis IR kết hợp với hồi quy đa biến (2) Nghiên cứu xây dựng quy trình xác định đồng thời nhóm chất methylxanthines chè xanh Việt Nam phương pháp UV-Vis IR kết hợp với hồi quy đa biến: nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi quy đa biến tuyến tính phi tuyến tính sở ma trận hàm lượng ba chất mẫu chè xác định phương pháp HPLC ma trận tín hiệu thu từ phương pháp UV-Vis IR (3) Ứng dụng qui trình phân tích xây dựng để phân tích số mẫu chè lưu hành thị trường so sánh kết với phương pháp tiêu chuẩn HPLC (4) Nghiên cứu xây dựng mơ hình phân loại nguồn gốc địa lý chè xanh Việt Nam sở liệu phổ UV-Vis IR kết hợp với thuật toán nhận dạng CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 125 mẫu chè xanh thành phẩm lấy trực tiếp từ sở sản xuất có nguyên liệu chè xanh thuộc tỉnh: Thái Nguyên, Lâm Đồng, Phú Thọ, Hà Giang, n Bái, Tun Quang, Hịa Bình Trong đó: Thái Nguyên 35 mẫu, Lâm Đồng 25 mẫu, Phú Thọ 31 mẫu 34 mẫu chè tỉnh khác (Hà Giang, Yên Bái, Tuyên Quang) 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp định lượng đồng thời ba chất TB, TP CF mẫu chè 2.2.2.1 Phát triển phương pháp HPLC xác lập điều kiện tách TB, TP CF Bước 1: Tối ưu hóa hệ thống HPLC: - Khảo sát: dung môi pha động, tỉ lệ thành phần pha động, tốc độ dòng… Bước 2: Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích: - Tính chọn lọc, đặc hiệu độ tinh khiết pic - Xây dựng đường chuẩn đánh giá đường chuẩn: - Tính thích hợp hệ thống - Độ lặp lại ngày - Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp - Độ (hiệu suất thu hồi) Bước 3: Xây dựng qui trình xử lý mẫu: nhiệt độ chiết, thời gian chiết mẫu 2.2.2.2 Phương pháp phổ IR, UV-Vis Bước 1: Tiến hành đo phổ IR, UV-Vis mẫu ta thu ma trận tín hiệu Bước 2: Xây dựng mơ hình hồi quy đa biến dựa ma trận tín hiệu 25 mẫu chè ma trận nồng độ tương ứng xác định HPLC.Trên phần mềm Matlad sử dụng phương pháp PCR, PLS, ANN để xây dựng mơ hình Bước 3: Kiểm tra độ xác mơ hình thơng qua 10 mẫu chè biết trước nồng độ chất (bằng phương pháp HPLC), đánh giá sai số tương đối hệ số tương quan để lựa chọn mơ hình phù hợp Bước 4: Tiến hành đo mẫu thực tế dựa mơ hình xây dựng 2.2.2 Phương pháp phân loại Bước 1: Tiến hành đo phổ IR, UV-Vis mẫu ta thu ma trận tín hiệu Bước 2: Sử dụng phương pháp thống kê PCA-DA PLS- DA, ANN để phân loại chè theo nguồn gốc địa lý Bước 3: Kiểm tra thử mẫu chè mơ hình vừa xây dựng CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phát triển phƣơng pháp HPLC định lƣợng đồng thời CF, TB, TP chè xanh 3.1.1.Tối ưu hóa điều kiện tách CF, TB, TP hệ HPLC-UV 3.1.1.1 Khảo sát thành phần pha động Khảo sát thành phần pha động chương trình rửa giải Khảo sát số loại pha động khác gồm: MeOH/Nước; MeOH/ đệm phosphate; ACN/Nước; ACN/đệm phosphate Từ kết thu được, lựa chọn hệ pha động ACN đệm phosphate Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ thành phần pha động Tiến hành khảo sát tỉ lệ thể tích pha động ACN/đệm phosphate: 10/90, 15/85, 20/80 Kết thu cho thấy tỉ lệ pha động ACN/đệm phosphate: 15/85 (v/v) tốt Khảo sát ảnh hưởng tốc độ dòng pha động Tiến hành khảo sát tốc độ dòng pha động: 0,8 ml/phút, 1,0 ml/phút, 1,2 ml/phút Từ đó, lựa chọn tốc độ dịng tối ưu cho q trình phân tích sắc ký 1,0 ml/phút Từ kết khảo sát trên, lựa chọn điều kiện tối ưu cho trình phân tích methylxanthines chè xanh + Cột: C18 (250 x 4,6 mm; µm) + Detector UV: 272 nm + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Nhiệt độ: nhiệt độ thường (250C-350C) + Thể tích mẫu tiêm vào cột: 10 µl + Hệ dung mơi pha động: ACN/đệm phosphate: 15/85 (v/v) TB - 3.5 1.10 TP - 4.2 1.00 0.90 CAF - 5.8 0.80 AU 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 Minutes 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 a b Hình 3.1 SKĐ HPLC-UV phân tích TB, TP, CF tối ưu (a-mẫu chuẩn; b-mẫu chè xanh) 3.1.1.2 Xây dựng phương trình đường chuẩn Các giá trị Pvalue thu lớn 0,05, chứng phương pháp xây dựng không mắc sai số hệ thống (cả sai số hệ thống biến đổi sai số hệ thống không đổi) Từ đó, xác định LOD LOQ đường chuẩn Bảng 3.1 LOD LOQ TB, TP, CF tính theo phương trình đường chuẩn Phƣơng trình đƣờng LOD LOQ Chất Sy b chuẩn (ppm) (ppm) y = 41401x – 14371 TB 13896 41401 1,0 3,4 TP CF y = 37233x – 9488.9 y = 31341x – 17432 9788 38925 37233 31341 0,8 4,1 2,6 12,4 Hình Đường chuẩn xác định TB, TP, CF phương pháp HPLC 3.1.2.2 Độ chụm (độ lặp lại): Độ lệch chuẩn tương đối RSD% phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với ba chất phân tích có giá trị từ 0,16 – 8,2% Như vậy, kết nằm giới hạn cho phép AOAC Vì phương pháp có độ lặp phù hợp với sác xuất thống kê 3.1.2.3 Độ (độ thu hồi): Hiệu suất thu hồi trung bình TB, TP, CF nằm khoảng cho 95% -115% Chứng tỏ phương pháp phân tích xây dựng có độ xác cao, dùng để phân tích định lượng TB, TP, CF chè xanh 3.1.3 Phân tích mẫu thực tế 3.1.3.1.Khảo sát điều kiện chiết mẫu 10 * Khảo sát thời gian chiết mẫu: Kết cho thấy, thay đổi thời gian chiết khác (1 phút, phút, phút, 10 phút) hiệu suất chiết tăng tiếp tục tăng từ 10 phút đến 15 phút hiệu suất chiết gần không đổi Chọn thời gian chiết 10 phút cho khảo sát * Khảo sát nhiệt độ chiết mẫu: Kết cho thấy, thay đổi nhiệt độ chiết khác (200C, 500C, 700C, 800C, 900C ) hiệu suất chiết tăng tiếp tục tăng từ 900C đến 1000C hiệu suất chiết gần không đổi Chọn nhiệt độ chiết 900C tối ưu 3.1.3.2 Phân tích mẫu thực tế Kết hàm lượng ba chất mẫu chè thể bảng 3.2 ảng Hàm lượng TB, TP CF mẫu chè Hàm lƣợng ba chất mẫu (mg/g) STT Mẫu Hàm lƣợng ba chất mẫu (mg/g) TB TP CF 49,35 21 LD4 1,96 3,39 17,93 4,32 44,02 22 LD5 3,07 3,27 33,32 4,64 47,37 23 LD6 4,06 3,79 35,23 4,16 4,07 4,18 4,92 5,12 4,89 4,51 4,74 5,55 6,79 43,99 65,79 58,83 54,95 77,72 24 25 26 27 28 LD7 LD8 LD9 LD10 CTK1 2,49 2,82 2,51 3,86 4,20 3,25 2,03 4,58 2,76 5,48 23,93 21,81 40,02 25,60 63,51 TN9 3,36 6,92 77,01 29 CTK2 1,58 4,09 33,48 10 11 12 TN10 TN11 TN12 2,27 4,00 3,42 4,52 5,17 5,14 58,48 53 64,46 30 31 32 CTK3 CTK4 CTK5 3,35 5,49 3,31 3,56 2,70 2,38 26,98 58,06 79,39 13 TN13 3,86 5,3 54,23 33 CTK6 4,37 3,36 65,89 14 15 TN14 TN15 4,13 4,16 4,16 5,07 65,54 55,19 34 35 CTK7 CTK8 1,40 3,34 1,35 4,43 50,82 56,26 16 TN16 2,94 4,44 53,47 36 CTK9 4,19 5,23 58,64 17 TN17 4,26 5,29 53,28 37 CTK10 1,25 2,54 62,86 18 19 20 LD1 LD2 LD3 3,61 3,66 5,07 1,34 2,66 3,05 21,78 24,62 23,59 38 39 40 CTK11 CTK12 CTK13 3,62 4,08 3,33 5,48 3,86 4,46 59,02 43,87 54,47 STT Mẫu TB TP CF TN1 4,46 4,34 TN2 6,01 TN3 3,59 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8 11 3.1.4 Kết luận phương pháp HPLC phát triển được: - Từ kết thu thấy HPLC phương pháp phân tích hiệu xác đồng thời thành phần xanthines có mẫu chè - Bộ số liệu từ HPLC dùng để làm số liệu chuẩn để xây dựng mơ hình hồi quy đa biến nhằm định lượng đồng thời TB,TP CF phổ hồng ngoại phổ UV-Vis 3.2 Nghiên cứu định lƣợng đồng thời ba methylxanthines chè quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến 3.2.1 Phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính 3.2.1.1 Phổ UV-Vis dung dịch CF, TB, TP mẫu chè Phổ UV-Vis (190-700 nm) mẫu chè thu hình 3.2(a) cho thấy có xuất píc đặc trưng vùng bước sóng 190-240nm 240310nm Tuy nhiên, vùng bước sóng 190-240nm độ hấp thụ lặp lại Chọn liệu vùng phổ 240-310nm để tiến hành định lượng CF, TB, TP mẫu chè Abs Abs nm nm Hình 3.3 Phổ UV-Vis mẫu chè 3.2.1.2 Khảo sát tính chất cộng tính caffeine, theobromine theophylline Kết cho thấy phổ hấp thụ ba chất có tính cộng tính nên sử dụng phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính để xác định đồng thời ba chất Mặt khác, kết cho thấy mẫu có ảnh hưởng tới phép định lượng ba hợp chất chè Do vậy, để thu kết xác cần phải loại bỏ ảnh hưởng mẫu cách loại bỏ yếu tố gây ảnh hưởng sử dụng phương pháp thêm chuẩn đa biến 12 3.2.1.3 Nghiên cứu lựa chọn mơ hình hồi quy đa biến tuyến tính Ma trận mẫu chuẩn ma trận mẫu kiểm tra định lượng đồng thời ba methylxanthines mẫu chè trình bày bảng 3.3 bảng 3.4 Bảng 3.3 Hàm lượng CF, TB, TP mẫu chè xanh sử dụng làm mẫu chuẩn STT Mẫu 10 11 12 13 CTK1 CTK2 CTK3 CTK4 CTK5 CTK6 CTK7 CTK8 TN1 TN2 TN3 TN4 TN7 Hàm lƣợng ba chất mẫu (mg/g) TB TP CF 4,20 5,48 63,51 1,58 4,09 33,48 3,35 3,56 26,98 5,49 2,70 58,06 3,31 2,38 79,39 4,37 3,36 65,89 1,40 1,35 50,82 3,34 4,43 56,26 4,46 4,34 49,35 6,01 4,32 44,02 3,59 4,64 47,37 4,16 4,89 43,99 4,92 5,55 54,95 STT Mẫu 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 TN8 TN9 TN10 TN11 TN12 LD1 LD2 LD3 LD4 LD5 LD6 LD7 Hàm lƣợng ba chất mẫu (mg/g) TB TP CF 5,12 6,79 77,72 3,36 6,92 77,01 2,27 4,52 58,48 4,00 5,17 53 3,42 5,14 64,46 3,61 1,34 21,78 3,66 2,66 24,62 5,07 3,05 23,59 1,96 3,39 17,93 3,07 3,27 33,32 4,06 3,79 35,23 2,49 3,25 23,93 Bảng 3.4 Hàm lượng CF, TB, TP mẫu chè xanh sử dụng làm mẫu kiểm tra STT Mẫu TN5 TN6 TN13 TN14 TN15 Hàm lƣợng ba chất mẫu (mg/g) TB TP CF 4,07 4,51 65,79 4,18 4,74 58,83 3,86 5,30 54,23 4,13 4,16 65,54 4,16 5,07 55,19 STT Mẫu 10 LD8 LD9 CTK9 CTK10 CTK11 Hàm lƣợng ba chất mẫu (mg/g) TB TP CF 2,82 2,03 2,82 2,51 4,58 2,51 4,19 5,23 58,64 1,25 2,54 62,86 3,62 5,48 59,02 Mơ hình PCR Kết xử lý PCA cho thấy PC1 chiếm 63% tổng phương sai tập số liệu thêm PC2 tổng phương sai tích lũy 98 % Như với cấu tử chứa hầu hết thông tin tập số liệu, lựa chọn số PC=2 để bắt đầu khảo sát lựa chọn số PC tối ưu Độ xác mơ hình thay đổi số PC từ đến 20 bảng 3.5 13 Bảng 3.5 Độ xác mơ hình hồi qui xác định methylxanthin mẫu kiểm tra theo phương pháp UV-Vis kết hợp với PCR Số PC 10 15 17 20 Hệ số tương quan R TB 0,18 0,53 0,54 0,76 0,79 0,90 TP 0,00 0,28 0,36 0,43 0,41 0,35 CF 0,18 0,14 0,31 0,25 0,28 0,24 Hệ số biến thiên RMSE TB TP CF 0,94 1,56 15,84 0,73 1,37 17,57 0,73 1,32 15,84 0,69 1,26 14,95 0,61 1,19 15,58 0,45 1,22 15,10 Kết thu sau sử dụng phương pháp PCR cho thấy thay đổi số PC từ đến 20 giá trị R thấp khơng biến đổi nhiều TB TP hệ số biến thiên RMSE CF tương đối cao Do không nên sử dụng phương pháp PCR phân tích định lượng đồng thời methylxanthin phổ UV-Vis Mơ hình PLS Kết thu cho thấy 11 cấu tử chứa hầu hết lượng thông tin tập số liệu, lựa chọn PC= 11 đến 20 để khảo sát số PC tối ưu Độ xác mơ hình thay đổi số PC từ đến 20 bảng 3.6 Bảng 3.6 Độ xác mơ hình hồi qui xác định methylxanthin mẫu kiểm tra theo phương pháp UV-Vis kết hợp với PLS 11 Hệ số tƣơng quan R TB TP CF 0,49 0,65 0,63 Hệ số biến thiên RMSE TB TP CF 0,72 0,78 8,45 12 13 14 0,60 0,67 0,75 0,78 0,79 0,78 0,68 0,74 0,71 0,69 0,62 0,51 0,65 0,68 0,58 7,77 7,03 7,77 15 0,72 0,77 0,72 0,55 0,61 7,72 16 0,82 0,81 0,73 0,46 0,54 7,55 17 0,87 0,81 0,72 0,44 0,54 7,53 18 0,88 0,83 0,71 0,41 0,51 7,65 19 0,84 0,81 0,72 0,54 0,54 7,54 20 0,84 0,81 0,72 0,53 0,53 7,46 Số PC 14 Khi tăng số PC từ 11 đến 18 hệ số tương quan R tăng rõ rệt, ngược lại hệ số biến thiên RMSE giảm dần Tiếp tục tăng số PC PC 19 hệ số tương quan R giảm hệ số biến thiên RMSE tăng Tuy nhiên giá trị R chưa cao điều PLS mơ hình hồi quy đa biến tuyến tính nên làm việc với mẫu có tương tác chưa biết chất phân tích với mẫu ảnh hưởng mẫu đáng kể sai số phép đo tương đối lớn Do đó, việc loại bỏ chất gây ảnh hưởng hoặn áp dụng phương pháp thêm chuẩn đa biến để loại bỏ ảnh hưởng mẫu cần thiết Loại trừ ảnh hưởng tannin mẫu chè Tiến hành xây dựng mơ hình với 25 mẫu chuẩn 10 mẫu kiểm tra sau loại tannin sử dụng số PC=20 với mơ hình PCR PC=18 với mơ hình PLS Kết thu bảng 3.7 Bảng 3.7 Độ xác mơ hình PCR PLS xác định methylxanthin mẫu kiểm tra trước sau loại tannin Mơ hình PCR Không loại tanin Loại tannin R RMSE R RMSE Mô hình PLS TB TP CF TB TP CF 0,90 0,45 0,92 0,43 0,35 1,22 0,45 1,13 0,24 15,10 0,42 14,10 0,88 0,41 0,84 0,54 0,83 0,51 0,87 0,49 0,71 7,65 0,72 7,54 Kết thu bảng 3.14 cho thấy , giá trị RMSE thu hai mơ hình PLS PCR sau loại tannin mẫu chè cải thiện không đáng kể Do đó, chúng tơi nghiên cứu sử dụng phương pháp thêm chuẩn đa biến để loại ảnh hưởng mẫu phép định lượng ba methylxanthines mẫu chè phương pháp UV-Vis 3.2.1.2 Phương pháp thêm chuẩn đa biến sử dụng mơ hình SANAS Phương trình thêm chuẩn đa biến SANAS xác định đồng thời CF, TB, TP dựa ma trận tín hiệu 15 mẫu thêm chuẩn ma trận tín hiệu đo 15 mẫu 71 số sóng độ hấp thụ quang vùng phổ từ 240-310 nm Kết hình 3.4, 3.5 Hình 3.4 Đường thêm chuẩn xác định nồng độ methylxanthines mẫu xanh Thái Nguyên 15 Hình 3.5 Đường thêm chuẩn xác định nồng độ methylxanthines mẫu xanh Hà Giang Từ phương trình đường thêm chuẩn tính hàm lượng (mg/g) CF TB mẫu chè, đối chứng với phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao HPLC kết bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết phân tích hàm lượng TB, TP CF mẫu chè Mẫu chè Hàm lƣợng CF (mg/g) HPL UV-Vis C Hàm lƣợng TB (mg/g) UVHPLC Vis Hàm lƣợng TP (mg/g) UVHPLC Vis TN10 60,02 58,48 2,06 2,27 - < 1,49 CTK7 54,96 50,82 1,51 1,40 - 4,52 3.2 Nghiên cứu định lƣợng đồng thời ba methylxanthines chè phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến 3.2.1 Phổ hồng ngoại phản xạ mẫu chè Tín hiệu phổ hồng ngoại phản xạ 35 mẫu chè vùng phổ 4000-10000 cm-1 trình bày hình 3.6 Nhận thấy vùng số sóng 4000-10000 cm-1 có đỉnh pic đặc trưng rõ ràng Sự xuất đỉnh pic đặc trưng vùng 42005200cm-1 liên kết C=O, CC C-N phân tử methyxanthines quay dao động Đồng thời, vùng số song 6900 Hình Dữ liệu phổ hồng ngoại phản cm-1 8800 cm-1 xuất pic xạ 35 mẫu chè chuyển động quay dao động nhóm –CH3 3.2.3 Nghiên cứu lựa chọn mơ hình hồi quy đa biến tuyến tính 3.2.3.1 Mơ hình PCR 16 Sau xử lý PCA cho thấy PC1 chiếm 78% tổng phương sai tập số liệu thêm PC2 tổng phương sai tích lũy 98 % Do vậy, lựa chọn số PC=2 để bắt đầu khảo sát lựa chọn số PC tối ưu Độ xác mơ hình PCR với ma trận tín hiệu mẫu kiểm tra trước sau tiến hành xử lý tiền số liệu thay đổi số PC từ đến 20 trình bày hình 3.7 Từ kết số hình 3.6 thấy tăng số PC từ đến hệ số tương quan R2 tăng rõ rệt, ngược lại hệ số biến thiên RMSE giảm Chọn PC phương pháp tiền xử lý tối ưu: TB: PC=9, MC; TP: PC=3, SNV; CF: PC=15, SNV Hình Độ xác mơ hình hồi quy xác định methylxanthines mẫu kiểm tra phương pháp IR kết hợp với PCR 3.2.3.2 Mơ hình PLS Kết thu cho thấy cấu tử chứa hầu hết lượng thông tin tập số liệu, lựa chọn PC= 61 đến 15 để khảo sát số PC tối ưu Độ xác mơ hình PCR với ma trận tín hiệu mẫu kiểm tra trước sau tiến hành xử lý tiền số liệu thay đổi số PC từ đến 15 trình bày hình 3.8 Từ kết số hình 3.6 thấy tăng số PC từ đến hệ số tương quan R tăng rõ rệt, ngược lại hệ số biến thiên RMSE giảm So sánh với phương pháp hồi quy đa biến PCR chúng tơi nhận thấy có cải thiện đáng kể giá trị R RMSE Nhìn chung phương pháp tiền xử lí số liệu MC cho kết tốt so với phương pháp tiền xử lí số liệu SNV khơng tiền xử lí Chọn PC phương pháp tiền xử lý tối ưu: TB: PC=11, MC; TP: PC=15, MC; CF: PC=14, MC Gias trị RMSE 0.8 Ban đầu Theobromin 0.7 SNV 0.6 MC 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Số PC 10 12 14 16 Hình Độ xác mơ hình hồi quy xác định methylxanthines mẫu kiểm tra phương pháp IR kết hợp với PCR 3.2.3.2 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế Kết phân tích mẫu thực tế thu bảng 3.9 17 ảng Kết phân tích CF, TB TP mẫu chè tính từ mơ hình PLS dựa liệu phổ phản xạ Hàm lƣợng TB (mg/g) Mẫu chè HPLC IR TN16 TN17 CTK13 CTK14 LD10 2,94 4,26 4,08 3,33 3,86 2,90 4,27 4,00 3,13 3,73 Sai số (%) 1,10 0,22 2,09 5,92 3,35 Hàm lƣợng TP(mg/g) HPLC IR 4,44 5,29 3,86 4,46 2,76 4,20 5,10 3,66 4,37 2,65 Hàm lƣợng CF(mg/g) Sai số (%) 5,42 3,75 5,23 2,01 4,05 HPLC IR 53,47 53,28 43,87 54,47 25,60 51,09 52,27 41,88 53,09 24,59 Sai số (%) 5,42 3,75 5,23 2,01 4,05 Từ kết thu nhận thấy hàm lượng methylxanthines thu theo phương pháp IR kết hợp với thuật tốn PLS phương pháp phân tích tiêu chuẩn HPLC sai khác khơng có ý nghĩa thống kê Trên sở ma trận tín hiệu 85 mẫu chè đo phương pháp NIR kết hợp với thuật tốn PLS tính hàm lượng CF, TB, TP mẫu chè vẽ biểu đồ Boxplot mẫu chè theo khu vực địa lý khác Kết trình bày hình 3.9 Boxplot of TB Boxplot of TP Vùng địa lý Các tỉnh khác Lâm Đồng Phú Thọ Thái Nguyên Vùng địa lý Các tỉnh khác Lâm Đồng Phú Thọ Thái Nguyên TP TB 3 2 1 Các tỉnh khác Lâm Đồng Phú Thọ Thái Nguyên Các tỉnh khác Vùng địa lý Phú Thọ Thái Nguyên Vùng địa lý Boxplot of CF Boxplot of TB+TP+CF 90 100 Vùng địa lý Các tỉnh khác Lâm Đồng Phú Thọ Thái Nguyên 80 70 80 60 70 50 40 Vùng địa lý Các tỉnh khác Lâm Đồng Phú Thọ Thái Nguyên 90 TB+TP+CF CF Lâm Đồng 30 60 50 40 30 20 20 10 Các tỉnh khác Lâm Đồng Phú Thọ Thái Nguyên Các tỉnh khác Vùng địa lý Lâm Đồng Phú Thọ Thái Nguyên Vùng địa lý Hình Khối lượng TB, TP, CF mẫu chè theo khu vực địa lý khác 3.3 Phân loại chè theo nguồn gốc địa lý dựa liệu phổ phƣơng pháp thống kê đa biến 3.3.1 Phân loại nhận dạng chè theo nguồn gốc địa lý phổ hấp thụ phân tử 18 3.3.1.1 Phân loại nhận dạng theo PCA-DA Độ xác phương pháp đánh giá qua tỉ lệ nhận dạng cách so sánh kết nhận dạng mẫu kiểm tra với việc gắn nhãn ban đầu Nếu kết cho thấy chưa đạt yêu cầu thay đổi số PC khác từ đến 20 để lựa chọn mơ hình hồi quy số PC phù hợp Sau khảo sát chọn số PC tối ưu 12 Kết nhận dạng 25 mẫu chè thể bảng 3.10 Bảng 3.10 Kết nhận dạng 25 mẫu chè dựa liệu phổ UV-Vis kết hợp với PCA-DA Độ xác (%) Kết nhận dạng Loại chè Số lƣợng mẫu TN LĐ PT TK TN LĐ PT TK 05 06 07 07 03 0 01 06 02 01 05 0 0 07 84 Từ kết bảng 3.11 cho thấy 25 mẫu chè thuộc vùng địa lý khác nhau, mẫu chè Lâm đồng tỉnh khác tỉ lệ nhận dạng 100%, 05 mẫu chè Thái Nguyên tỉ lệ nhận dạng 3/5 07 mẫu chè Phú Thọ tỉ lệ nhận dạng 05/07 3.3.1.2 Phân loại nhận dạng theo PLS-DA Kết thu sau sử dụng phương pháp PLS-DA cho thấy tỉ lệ khơng nhận dạng mơ hình cịn cao Do khơng thể dùng mơ hình PLS-DA sở liệu phổ UV-Vis để phân loại nhận dạng nguồn gốc địa lý mẫu chè thị trường 3.3.2 Phân loại nhận dạng chè theo nguồn gốc địa lý phổ hồng ngoại 3.3.2.1 Phân loại nhận dạng theo PCA-DA Bảng 3.11 Kết nhận dạng 25 mẫu chè dựa liệu phổ IR kết hợp với PCA-DA Kết nhận dạng Loại chè Số lƣợng mẫu TN LĐ PT TK TN LĐ PT TK 05 06 07 07 05 0 0 05 01 0 07 0 01 06 19 Độ xác (%) 92 Độ xác mơ hình với 25 mẫu kiểm tra đạt 92%: 25 mẫu chè thuộc vùng địa lý khác nhau, mẫu chè Thái Nguyên Phú Thọ tỉ lệ nhận dạng 100%, 06 mẫu chè Lâm Đồng tỉ lệ nhận dạng 5/6 07 mẫu chè tỉnh khác tỉ lệ nhận dạng 06/07 3.3.2.2 Phân loại nhận dạng theo PLS-DA Kết nhận dạng 25 mẫu chè thể bảng 3.12 Độ xác mơ hình với 25 mẫu kiểm tra đạt 96% cho thấy hồn tồn sử dụng mơ hình PLS-DA sở liệu phổ hồng ngoại phản xạ để phân loại nguồn gốc địa lý mẫu chè thị trường Bảng 3.12 Kết nhận dạng 25 mẫu chè dựa liệu phổ IR kết hợp với PLS-DA Độ Kết nhận dạng Số Loại lƣợng chè TN LĐ PT TK xác mẫu (%) 05 05 0 TN 06 05 01 LĐ 96 07 0 07 PT 07 0 07 TK KẾT LUẬN Luận án cơng trình Việt Nam ứng dụng thành công kỹ thuật đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis phổ phản xạ IR để định lượng đồng thời số chất nhóm methylxanthin mẫu tự nhiên tiến hành phân loại nguồn gốc địa lý chè Việt Nạm Các kết luận án đạt sau: Đã khảo sát lựa chọn điều kiện phù hợp cho phép xác định đồng thời hợp chất TB, TP, CF chè phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao Ở điều kiện nghiên cứu píc ba methylxanthines tách hồn tồn khỏi nhau, pic nhọn cân đối Kết phân tích hàm lượng ba methylxanthin mẫu chè cho thấy có khác hàm lượng methylxanthin vùng địa lý khác sở để phân loại nguồn gốc địa lý chè Việt Nam Bộ số liệu hàm lượng ba methylxanthin xác định phương pháp HPLC dùng để làm số liệu chuẩn để xây dựng mô hình hồi quy đa biến nhằm định lượng đồng thời TB,TP CF phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử phổ hồng ngoại 20 Đã định lượng đồng thời ba chất Cafein, Theobromin, Theophyllin chè phương pháp thêm chuẩn đa biến NAS dựa liệu phổ UV-Vis vùng 240-310 nm so sánh đối chứng với phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao HPLC Kết đối chứng với HPLC cho kết độ lệch tương đối hàm lượng sai khác không nhiều 10% Kết áp dụng phương pháp hồi quy đa biến nhằm định lượng đồng thời ba methylxanthines mẫu chè sở liệu phổ hấp thụ phân tử: Mô hình CLS cho sai số lớn (hàng nghìn %), xác định đồng thời hợp chất nghiên cứu hỗn hợp Hai mơ hình hồi qui đa biến tuyến tính PCR PLS cho kết phân tích khả quan mơ hình CLS Tuy nhiên, hệ số tương quan R cấu tử chưa cao (0,49 – 0,88) Áp dụng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến tuyến tính nhằm định lượng đồng thời ba methylxanthines mẫu chè cho kết tốt phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử Thuật toán hồi qui đa biến PLS sử dụng thành công để xác định đồng thời ba methylxanthin mẫu chè sở liệu phổ hồng ngoại với hệ số tương quan R biểu thị hàm lượng tìm hàm lượng xác định phương pháp HPLC mẫu kiểm tra đạt từ 0,97 đến 0,99 (với PC=14) Khi phân tích mẫu thực tế cho thấy hàm lượng methylxanthines thu theo phương pháp IR kết hợp với thuật toán PLS phương pháp phân tích tiêu chuẩn HPLC sai khác khơng có ý nghĩa thống kê (sai số tương đối nhỏ 5,42%) Đã xây dựng mơ hình thống kê đa biến để nhận dạng chè theo nguồn gốc địa lý PCA-DA, PLS-DA dựa sở liệu quang phổ hấp thụ phân tử phổ hồng ngoại phản xạ Kết phân loại dựa số liệu phổ phản xạ cho kết tốt phổ hấp thụ phân tử hai mơ hình PCA-DA, PLS-DA Sử dụng phương pháp phổ hồng ngoại phản xạ kết hợp với thuật toán nhận dạng PLS-DA cho kết phân loại tốt nhất, độ xác mơ hình mẫu xây dựng mơ hình 100, mẫu kiểm tra 96% PC=18 Ứng dụng mơ hình thu nhận dạng 25 mẫu chè thuộc vùng địa lý khác nhau, kết cho thấy mẫu chè Thái Nguyên, Phú Thọ tỉnh khác tỉ lệ nhận dạng 100%, 06 mẫu chè Lâm Đồng tỉ lệ nhận dạng 5/6 Độ xác mơ hình với 25 mẫu kiểm tra đạt 97% cho thấy hồn tồn sử dụng mơ hình PLS-DA sở liệu phổ hồng ngoại phản xạ để phân loại nguồn gốc địa lý mẫu chè thị trường Thành công nghiên cứu góp phần vào việc phát triển phương pháp xác định đồng thời chất mẫu tự nhiên kỹ thuật tương đối đơn giản, nhanh, không cần xử lý mẫu phân tích mẫu hàng loạt mang lại hiệu kinh tế Nghiên cứu mở hướng phát triển phương pháp 21 phân tích nhanh, đơn giản nhằm truy xuất nguồn gốc sản phẩm mang lại lợi ích thiết thực cho nhà sản xuất người tiêu dùng CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN [1] Trần Thị Huế, Nguyễn Thế Anh, Trần Thị Thuỳ Dung, Tạ Thị Thảo, Nguyễn Văn Ri, (2017), “Định lượng đồng thời caffein, theobromin, theophyllin chè đen chè xanh Hà Giang phương pháp phổ hấp thụ phân tử sử dụng phương pháp thêm chuẩn đa biến”, Tạp chí Hóa học, tập 23(2), trang 110-117 [2] Trần Thị Huế, Bùi Đức Thọ, Tạ Thị Thảo, Nguyễn Văn Ri, (2018), “Định lượng đồng thời caffein, theobromin, theophyllin chè phương pháp quang phổ hồng ngoại phản xạ sử dụng thuật tốn hồi quy đa biến”, Tạp chí Phân tích Hóa, Lý Sinh học, tập 55(5e34), trang 67 -72 [3] Trần Thị Huế, Nguyễn Tân Thành, Ngô Thị Lương, Tạ Thị Thảo, Nguyễn Văn Ri, (2019), “Phân tích đánh giá hàm lượng cafein, theobromin, theophylline loại chè xanh Việt Nam có nguồn gốc địa lý khác nhau”, Tạp chí Phân tích Hóa, Lý Sinh học, tập 24(1), trang 181 – 186 [4] Trần Thị Huế, Trần Thùy Dung, Tạ Thị Thảo, Nguyễn Văn Ri, (2019), “Định lượng đồng thời caffein, theobromin, theophyllin chè phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử kết hợp với hồi quy đa biến”, Tạp chí Phân tích Hóa, Lý Sinh học, tập 24(1), trang 192 – 196 [5] Tran Thi Hue, Bui Duc Tho, Nguyen Van Ri, Ta Thi Thao, “Geographic origin classification and simultaneous determination of methylxanthines in Vietnamese tea using chemometrics based on the near infrared reflectance spectroscopy”, Analytica Vietnam conference 2019 22 ... phân loại nguồn gốc địa lý chè Việt Nam dựa liệu phổ thực tiễn trên, luận án tiến sĩ ? ?Nghiên cứu phân tích số chất nhóm methylxanthines chè phân loại chè Việt Nam dựa liệu phổ? ?? thực với nội dung... UV-Vis phân tích định lượng methylxanthines chè Việt Nam - Nghiên cứu Việt Nam xây dựng phương pháp phân loại nguồn gốc địa lý chè Việt Nam dựa liệu phổ IR, UV-Vis Cấu trúc luận án Luận án gồm... lượng methylxanthines chè phân loại chè theo nguồn gốc địa lý dựa liệu phổ UV-Vis, IR kết hợp với phân tích thống kê đa biến Xuất phát từ lý nêu trên, đề tài luận án Tiến sĩ: ? ?Nghiên cứu phân tích