Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu của luận án là nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích xác định 5 dạng As bao gồm AsB, As(III), MMA, DMA, As(V) và bước đầu nghiên cứu phân tích 4 dạng Se bao gồm vô cơ Se(IV), Se(VI), DMDSe, SeMet bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC ghép nối với khối phổ plasma cảm ứng ICPMS. Ứng dụng phương pháp phân tích để phân tích các dạng asen trong các đối tượng mẫu như: Nước, nước mắm, cá, gạo, nước tiểu, huyết thanh và selen trong mẫu thuốc, thực phẩm chức năng.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Mạnh Hà NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH LƢỢNG VẾT CÁC DẠNG ASEN VÀ SELEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP GHÉP NỐI SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI KHỐI PHỔ PLASMA CẢM ỨNG (HPLC-ICPMS) Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 9440112.03 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội – 2019 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hiện nay, vấn đề phân tích dạng nguyên tố nhu cầu cấp thiết đánh giá ô nhiễm thực phẩm môi trường, nghiên cứu q trình chuyển hóa tích lũy sinh học, nghiên cứu q trình địa hóa Tuy nhiên phép xác định thông thường cho biết tổng hàm lượng nguyên tố chưa cho biết hàm lượng nguyên tố dạng cụ thể, để đánh giá tính độc, q trình chuyển hóa chất thể sinh vật, chất tồn tầng địa chất, tồn nguyên tố môi trường lại cần đến thông tin hàm lượng số lượng dạng nguyên tố Có thể đề cập đến ngun tố gây nhiễm mang độc tính cao As, nguyên tố coi chất độc bảng A gây bệnh ung thư nguy hiểm cho người, asen chủ yếu dạng hợp chất vơ (có độc tính cao) đưa vào thể từ nhiều nguồn khác nhau: thực phẩm, nước uống, khơng khí Trong thể, thơng qua phản ứng metyl hóa khử liên tục hợp chất As chuyển thành dạng khơng độc, sau tiết qua nước tiểu, phân, tích lũy da, tóc, móng Vì vậy, hàm lượng As nước tiểu, phân, da, tóc, móng dùng làm thị cho phơi nhiễm As thể Chính hàm lượng As nước sinh hoạt theo tiêu chuẩn quy định thấp (≤10µg/lít) Trong tự nhiên As tìm thấy nhiều dạng hợp chất khác As(III), As(V), MMA, DMA…trong dạng As(III) độc dạng As(V); dạng As vơ có độc tính cao dạng As hữu cơ, dạng lại chuyển hóa qua lại với nhờ tác động yếu tố môi trường sống Mặt khác asen (As) nguyên tố vi lượng cần thiết cho sinh trưởng phát triển động vật người Ở hàm lượng định As tham gia vào trình trao đổi chất, tổng hợp nucleic, protit hemoglobin Chính mà chuyên gia thực phẩm tổ chức FAO/WHO đưa mức hấp thụ lượng asen vô tối đa cho người 15µg As/kg trọng lượng thể/tuần Mặc dù As nguyên tố thiếu trong hệ thống sinh học, hấp thụ hàm lượng vượt mức cần thiết, lại chất cực độc Độc tính As phụ thuộc vào dạng hợp chất nó, mức độ độc hại hợp chất giảm dần theo thứ tự sau: arsenites > inorganic arsenites > organic trivalent compounds (arsenooxides) > inorganic arsenates > organic pentavalent compounds > arsonium compounds > elemental arsenic Một nguyên tố khác Se, nguyên tố vừa đóng vai trị ngun tố vi lượng vừa độc tố hàm lượng cao, khoảng nồng độ Se phép có thể người mà không gây độc hại hẹp tùy thuộc vào dạng tồn Se, lượng Se nên đưa vào thể người hàng ngày khoảng 50200μg/ngày Các dạng hợp chất có độc tính selen thường gặp selen dioxyd (SeO2), acid selenơ (H2SeO3), muối selenit (SeO32-), acid selenic (H2SeO4), muối selenat(SeO42-) dạng selenua (Se2-) Các hợp chất selen đáng ý dinh dưỡng sức khỏe (CH3)2Se, (CH3)2Se+, selennocystein, selennocystin, selenomethionin.Như vậy, dạng tồn cuả ngun tố có tính chất khác phân tích tổng hàm lượng ngun tố chưa độc tính ứng dụng nó, việc định lượng dạng nguyên tố cần thiết Do việc xác định nồng độ dạng asen selen mẫu thực phẩm môi trường sinh học, thuốc thực phẩm chức đánh giá mức độ rủi ro đến sức khỏe người Vì vậy, phương pháp xác định phù hợp để tách định lượng xác dạng khác asen selen mẫu cần thiết Với lý trên, lựa chọn đề tài “Nghiên cứu xác định lượng vết dạng Asen selen phương pháp ghép nối sắc kí lỏng hiệu cao với khối phổ Plasma cảm ứng HPLC-ICP-MS” Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích xác định dạng As bao gồm AsB, As(III), MMA, DMA, As(V) bước đầu nghiên cứu phân tích dạng Se bao gồm vô Se(IV), Se(VI), DMDSe, SeMet phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao HPLC ghép nối với khối phổ plasma cảm ứng ICPMS Ứng dụng phương pháp phân tích để phân tích dạng asen đối tượng mẫu như: Nước, nước mắm, cá, gạo, nước tiểu, huyết selen mẫu thuốc, thực phẩm chức 2.Nội dung nghiên cứu luận án Phát triển phương pháp phân tích dạng Asen Selen hệ liên hợp HPLC ghép nối ICP-MS - Tối ưu điều kiện tách nhận biết dạng As Se HPLC-ICP-MS - Tối ưu điều kiện xử lý mẫu - Thẩm định xác nhận giá trị sử dụng phương pháp (Độ đúng, độ xác, LOD, LOQ, CRM) Ứng dụng phương pháp phát triển để phân tích - Dạng tồn As mẫu sinh học, thực phẩm môi trường - Dạng tồn Se mẫu thuốc mẫu nấm nem định hướng thực phẩm chức CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.Khái quát nguyên tố As 1.1.1 Các dạng tồn Asen tự nhiên 1.1.2 Sự phân bố asen môi trường 1.1.3 Sự phân bố As đối tượng thực phẩm 1.1.4 Độc tính chế gây độc asen 1.2 Các dạng tồn chuyển hóa dạng selen 1.2.1 Độc tính ứng dụng ảnh hưởng selen đến sức khỏe người 1.3 Các phương pháp phân tích dạng Asen selen 1.3.1 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao ghép nối hệ hydrua quang phổ huỳnh quang nguyên tử (HPLCUV-HG-AFS) 1.3.2 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao ghép nối với hệ quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng kĩ thuật hydrua hóa (HPLC-HG-AAS) 1.3.3 Phương pháp điện di mao quản CE-UV 1.3.4 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao ghép nối với cảm ứng cao tần quang phổ phát xạ nguyên tử (HPLC – ICP – AES 1.3.5 Phương pháp kết hợp HPLC-ICP-MS CHƢƠNG - THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 2.1.1 Hóa chất 2.1.2 Chuẩn bị hóa chất dung dịch chuẩn: 2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 2.2 Phương pháp lấy mẫu, bảo quản, xử lý mẫu thực phẩm 2.2.1.Các loại mẫu đo Mẫu chuẩn (CRM) asen bột gạo (ERM®-BC211) từ tài liệu tham khảo châu Âu, Viện tài liệu tham khảo đo lường Bỉ, chứng nhận cho As (III), As (V) DMA, tổng nồng độ asen ,được sử dụng để xác nhận phương pháp phân tích tính chất hợp chất asen mẫu gạo Mẫu cá (DORM-2) Canada, chứng nhận cho AsB hàm lượng asen tổng.Các mẫu chuẩn chứng nhận bảo quản cẩn thận điều kiện kín, nhiệt độ -4 oC Sử dụng loại mẫu chuẩn có mẫu tương tự với mẫu thực tế phân tích, để xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích Mẫu thực tế bao gồm (mẫu mước, nước mắm, gạo, nước tiểu, huyết mẫu thuốc…) 2.2.2 Lấy mẫu Trong nghiên cứu địa điểm lấy mẫu; Mẫu lấy xã Nhật Tân, huyện Kim Bảng, tỉnh Hà Nam vào tháng 11 năm 2017 bao gồm (mẫu mước, nước mắm, gạo, nước tiểu, huyết thanh…) Mẫu thuốc; mẫu mua cửa hàng thuốc khu vực Hà Nội Đối với mẫu nƣớc: Các mẫu nước ngầm lấy từ giếng khoan có độ sâu khác Nước ngần bơm cho chảy tự khoảng 20 phút sau mẫu nước lấy bảo quản bình kín nhiệt độ 40C vận chuyển lưu mẫu Mẫu Gạo: Sau lấy chứa túi nhựa bảo quản điều kiện oC Mẫu máu: Mẫu máu sau lấy từ người dân hộ gia đình thêm EDTA để tránh tượng đơng máu vào ống đựng máu chuyên dụng ngành y tế bảo quản - 4oC sau vận chuyển phòng TN bảo quản -20oC Mẫu nƣớc tiểu: lấy theo dòng, loại bỏ phần đầu phần cuối dịng dễ có tạp nhiễm dịch nhày, tế bào bong vi khuẩn 2.2.3 Tiền xử lý mẫu Mẫu cá: Sau thu thập địa phương Việt Nam, sơ chế cách loại bỏ phần không sử dụng làm thực phẩm (đầu, da, nội tạng, xương, vỏ) Sau tiến hành đông khô 50oC nghiền mịn Mẫu bảo quản ống Falcon polypropylen -20oC tiến hành phân tích.Hàm lượng nước mẫu xác định chênh lệch khối lượng trước sau đông khô Mẫu gạo: Mẫu gạo nghiền mịn tiến hành đông khô (mất nước) giống bảo quản kín, -4 oC Mẫu huyết thanh: Mẫu máu sau lấy thêm EDTA để tránh tượng đông máu Huyết thu cách để máu đông tự nhiên khoảng thời gian từ 30 phút đến giờ, ly tâm khoảng 3.000 vòng/phút 10 phút, phần dịch (supernatant) phía huyết [35] Mẫu Thuốc: Mẫu thuốc sau mua bảo quản -180C 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu: 2.3.1.Phân tích tổng As Se Phân hủy mẫu lị vi sóng Trong mẫu cá thực phẩm asen liên kết chặt chẽ với thành phần protein Do trước định lượng, cần phá vỡ protein mẫu để đưa dạng vô Đây phương pháp xử lý mẫu đại làm giảm đáng kể thời gian xử lý mẫu, khơng làm mẫu phân tích vơ hóa mẫu triệt để, vơ hóa lúc nhiều mẫu Sử dụng axit HNO3và tác nhân ơxi hóa H2O2 Đối với Se sử dụng axit HNO3, H2SO4và tác nhân ơxi hóa H2O2 Các bƣớc tiến hành phân hủy mẫu lị vi sóng Cân xác khoảng: 50,0 – 200,0 mg mẫu thực phẩm đông khô sấy khô Tùy hàm lượng As có mẫu chọn lượng cân cho phù hợp Cho vào bình xử lý mẫu Teflon dung tích 100ml lị vi sóng (phá mẫu lặp) Thêm vào bình 5ml HNO3 đặc; 0,5ml H2O2 đặc) Tiến hành phá kèm mẫu trắng Tương tự Selen cân xác khoảng: 50,00 mg mẫu thuốc sấy khơ Tùy hàm lượng Se có mẫu chọn lượng cân cho phù hợp Cho vào bình xử lý mẫu Teflon dung tích 100ml lị vi sóng (phá mẫu lặp) Thêm vào bình 5ml HNO3 đặc; 1ml H2O2 đặc 0,5ml H2SO4 đặc).Tiến hành phá kèm mẫu trắng Để đánh giá quy trình phân tích, chúng tơi tiến hành phân tích mẫu chuẩn đối chiếu cá DORM-2 mẫu gạo BC-211 2.3.2 Quy trình xử lý mẫu phân tích dạng As Se Mẫu Cá: Cân xác khoảng 50,00 mg mẫu thực phẩm (cá) chứa As cho vào ống facol 15ml Dùng 10ml dung mơi MeOH:H2O theo tỉ lệ 50/50 thể tích (chiết lặp lần tương ứng 3;3;4 ml) Công suất chiết siêu âm 80%, thời gian chiết 2x3 phút, ly tâm 6000xg, thời gian ly tâm phút Dịch chiết chuyển sáng ống facol pha loãng 10 lần nước deion lọc qua màng lọc 0,45µm Sau bơm vào cột sắc ký, đo dạng hợp chất As thiết bị ghép nối HPLC-ICP-MS Mẫu Gạo: Cân xác gam mẫu gạo chứa As cho vào ống facol 15ml Dùng 10ml HNO 0.28M đem ủ nhiệt độ 950C thời gian 90 phút, ly tâm 13000xg, thời gian ly tâm 10 phút Dịch chiết chuyển sáng ống facol lọc qua màng lọc 0,45µm Sau bơm vào cột sắc ký, đo dạng hợp chất As thiết bị ghép nối HPLC-ICP-MS Mẫu huyết thanh: Hút 0.4 mL huyết cho vào ống nghiệm 2mL thêm 0.5 mL ACN 0.1 mL H2O đem voltex phút ly tâm 10000xg, thời gian ly tâm 10 phút Dịch chiết lọc qua màng lọc 0,22µm Sau bơm vào cột sắc ký, đo dạng hợp chất As thiết bị ghép nối HPLC-ICP-MS Mẫu thuốc thực phẩm chức năng: Cân 50g mẫu pha loãng mL PBS (pH=7.4) ủ tủ sấy 950C thời gian phút, lấy thêm mL HCl 0.8M tiến hành ly tâm 10000xg, thời gian ly tâm 10 phút thu dung dịch đồng Sau bơm vào cột sắc ký, đo dạng hợp chất Se thiết bị ghép nối HPLC-ICP-MS Các mẫu nƣớc giếng khoan, nƣớc mắm nƣớctiểu: Tiến hành lọc qua màng 0.45 µm dung dịch đồng Sau bơm vào cột sắc ký, đo dạng hợp chất As thiết bị ghép nối HPLC-ICP-MS CHƢƠNG – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách xác định dạng Asbằng phƣơng pháp HPLC- ICP-MS 3.1.1 Tối ƣu điều kiện phân tích As Se ICP-MS Trong nghiên cứu này, ICP-MS sử dụng detector hệ HPLC Do đó, điều kiện đo, xác định As Se ICP-MS tối ưu hóa nhằm mục đích đạt độ nhạy cao chọn lọc cho phép đo nói riêng phép phân tích nói chung Trong nghiên cứu điều kiện làm việc ICP-MS nói chung chuẩn hóa cách sử dụng dung dịch chuẩn máy hãng kèm với thiết bị phân tích (Perkin Elmer ELAN9000) ICP-MS chuẩn kiểm tra độ nhạy trước phân tích Dung dịch để kiểm tra độ nhạy thiết bị gồm Be, Co, In U với nồng độ 10 ppb (Perkin Elmer No N8125031) Bên cạnh đó, điều kiện đo tối ưu cho nguyến tố cần phân tích, cụ thể nghiên cứu As Se khảo sát tối ưu Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới tín hiệu phân tích phép đo ICP-MS, điều kiện đo ICP-MS, thông số quan trọng công suất nguồn cao tần cảm ứng plasma (RF power), tốc độ khí Ar tạo sol khí (nebulizer gas flow) thấu kính hội tụ ion (lens voltage) Do đó, ba thơng số khảo sát, đánh giá chọn giá trị tối ưu nhằm đạt tín hiệu phân tích cao cho phép đo a- Cơng suất plasma b- Tốc độ khí tạo sol c- Thể thấu khí Hình 3.1 Ảnh hưởng thông số ICP-MS tới độ nhạy đồng vị As75 a- Công suất plasma b- Tốc độ khí tạo sol c- Thể thấu khí Hình 3.2 Ảnh hưởng thông số ICP-MS tới độ nhạy hai đồng vị 78Se -82Se 3.1.2 Tối ƣu điều kiện phân tích dạng As thiết bị HPLC 3.1.2.1 Khảo sát lựa chọn pha động Để khảo sát ảnh hưởng loại pha động đến khả tách dạng asen cột sắc kí Hamilton PRP-X 100, tiến hành phân tích hỗn hợp năm dạng asen (AsB, As(III), MMA, DMA As(V)) với nồng độ dạng asen 100µg/l Tốc độ pha động 1,2ml/phút; thể tích bơm mẫu 100 µl; 2% MeOH Hai loại pha động chọn để khảo sát đệm photphat KH2PO4 20mM, pH đệm amoni cacbonat (NH4)2CO3 50mM, pH Kết hình 3.3 3.4 cho thấy tín hiệu peak sử dụng đệm amonicacbonat tốt hơn, đặc biệt tín hiệu As(III) AsB Hơn nữa, sử dụng đệm photphat thời gian dài làm bề mặt côn thiết bị ICP-MS bị rỗ, làm giảm tuổi thọ tín hiệu đo thiết bị Vì chúng tơi chọn pha động đệm amonicacbonat cho lần khảo sát Hình 3.3 Sắc đồ dạng As nồng độ 100 Hình 3.4 Sắc ký đồ tách dạng As nồng độ ng/ml (pha động đệm KH2PO4 20mM, pH=8; 2% 100 ng/ml (sử dụng hệ đệm (NH4)2CO3 pH=9 MeOH; vịng lặp mẫu 500µl; tốc độ dịng làm pha động 2% MeOH; vịng lặp mẫu 500µl; 1,2ml/phút) tốc độ dòng 1,2ml/phút) 3.1.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng pH Các dạng asen có khác lớn số axit Ka, As3+ có pKa = 9,2; As5+ có pKa = 2,3; 6,8 11,6 MMA có pKa = 3,6 8,2; DMA có pKa = 1,3 6,2, chúng tách tốt phương pháp trao đổi ion Đây lí khiến pH định khả tách dạng asen cột sắc kí Hamilton PRP-X 100 Tiến hành thí nghiệm với năm dạng asen: AsB, As(III) MMA, DMA As(v) nồng độ 50 µg/l với điều kiện pha động gồm đệm (NH4)2CO3 50mM; 2% MeOH; thể tích bơm mẫu 500µl; tốc độ dịng 1,2 ml/phút thay đổi pH giá trị từ 7,0 đến 9,0 với bước nhảy 0,5 Kết thực nghiệm cho thấy sử dụng phương pháp đẳng dịng AsB As 3+ khơng tách khỏi Ở giá trị pH khác thời gian lưu dạng As (AsB, As3+, MMA, DMA) không thay đổi nhiều Riêng thời gian lưu As5+ tăng pH tăng Tuy nhiên, pH tín hiệu đo ổn định nhất, chọn pH pha động cho lần khảo sát Hình 3.5 Sắc đồ dạng As nồng độ 50ppb,(pha động đệm (NH4)2CO3 50mM; 2% MeOH; vịng lặp mẫu 500µl; tốc độ dòng 1,2 ml/phút) 3.1.2.3 Ảnh hƣởng nồng độ EDTA, MEOH Tiến hành sơ cho thấy có EDTA pha động tín hiệu píc tách tốt Do nghiên cứu có mặt EDTA quan trọng nồng độ sắt kim loại kiềm (canxi, magiê, vv) cao, đặc biệt mẫu môi trường sinh học Trong nghiên cứu này, EDTA 0,01% thêm vào pha động nồng độ giữ liên tục cho thí nghiệm Ngồi dung mơi hữu có khả làm tăng tín hiệu ICP-MS phân tích ngun tố có lượng ion hóa khoảng 9-11eV để cải tiến độ nhạy hiệu ứng cacbon tỉ lệ nhỏ methanol thêm vào pha động suốt trình tối ưu hóa Để khảo sát ảnh hưởng nồng độ phần trăm methanol đến khả tách dạng asen cột sắc kí Hamilton PRP-X 100, chúng tơi tiến hành phân tích hỗn hợp năm dạng asen (AsB, As(III), MMA, DMA As(V)) với nồng độ dạng asen 50 µg/l Thành phần pha động sử dụng hỗn hợp đệm 10mM 50mM (NH4)2CO3 (EDTA 0,01%), pH 9,0; tốc độ pha động 1,2 mL/phút thể tích bơm mẫu 500 µl chúng tơi thay đổi nồng độ methanol pha động theo tỉ lệ: 1%, 2%, 3%, 4%, 5%về thể tích Kết thu hình 3.6 Hình 3.6 Sắc đồ dạng As nồng độ 50ppb( pha động hỗn hợp đệm (NH4)2CO3 10, 50mM (EDTA 0,01%); pH 9; vịng lặp mẫu 500µl; tốc độ dịng 1,2ml/phút) Ở nồng độ khác MeOH, dạng As tách hồn tồn, tín hiệu As tăng lên tăng nồng độ MeOH đồng thời tín hiệu đường tăng lên Tại nồng độ MeOH 1%, 2%, 3% tín hiệu đường thấp 4% 5%.Nhận thấy nồng độ 2% MeOH, đỉnh píc cao hơn, đối xứng tín hiệu tách ổn định Vì chọn nồng độ methanol 2% cho khảo sát 3.1.2.4 Khảo sát lựa chọn chế độ đo đẳng dòng gradient pha động Để khảo sát ảnh hưởng hai phương pháp rửa giải đến khả tách dạng asen cột sắc kí Hamilton PRP-X 100, chúng tơi tiến hành phân tích hỗn hợp năm dạng asen AsB, As(III), MMA, DMA As(V) với nồng độ dạng asen 50 µg/L Tốc độ pha động 1,2 mL/phút; thể tích bơm mẫu 100 µl; 2% MeOH Đối với phương pháp đẳng dịng, chúng tơi sử dụng pha động đệm amonicacbonat (NH 4)2CO3 nồng độ 50mM, pH Còn phương pháp gradient tiếp tục sử dụng đệm (NH4)2CO3 nồng độ 10mM 50mM , pH Gradient pha động dùng để tách dạng As cài đặt sau: nồng độ EDTA MeOH giữ cố định tương ứng 0,05 % 2% (v/v) Nồng độ (NH4)2CO3 giữ cố định 10 mM phút sau tăng tuyến tính tới 50 mM 14 phút Sau giảm 10 mM 0,1 phút giữ điều kiện phút để cần cột tách cho lần bơm mẫu Sắc đồ tách dạng As hai điều kiện nêu đưa Hình 3.7 Hình 3.8 tương ứng với chương trình rửa giải đẳng dung mơi chương trình rửa giải gradient dung mơi Hình 3.7 Sắc đồ dạng As nồng độ50ppb Hình 3.8 Sắc đồ dạng As nồng độ 50ppb sử dụng phương pháp đẳng dòng pha động đệm sử dụng phương pháp gradient pha động hỗn (NH4)2CO3 50mM;EDTA 0,01%, pH=9; 2% hợp đệm (NH4)2CO3, (EDTA 0,01%); pH=9; 2% MeOH; vịng lặp mẫu 500µl; tốc độ dịng MeOH; vịng lặp mẫu 500µl; tốc độ dịng 1,2 1,2ml/phút ml/phút Kết cho thấy sử dụng phương pháp gradient, dạng As n gốc nước cất Dung dịch chuẩn bơm vào hệ thống HPLC-ICP-MS có sử dụng bơm mẫu sau cột điều kiện tối ưu trình bày phần Dung dịch chuẩn As(V) (Merck) nồng độ 50 ppb dung dịch HNO3 2% sử dụng làm nội chuẩn vào bơm vào hệ thống qua van bơm mẫu sau cột tách Chuyển đổi liệu xử lý số liệu tiến hành phần mềm Xcalibur version 2.0 Thermo Scientific Diện tích píc dạng As tương ứng nội chuẩn lấy tích phân kế phần mềm Quanlitative tích hợp Xcalibur Tỉ số diện tích pic tính cách lấy diện tích pic dạng asen chia cho diện tích pic nội chuẩn.Kết diện tích pic tỉ số diện tích pic trình bày Bảng 3.7 Bảng 3.7 Độ lặp lại tín hiệu phân tích có khơng sử dụng nội chuẩn 10 Tỷ số diện tích pic (sử dụng nội chuẩn) rsd Dạng Lần Lần Lần Lần Lần AsB 0,897 0,883 0,872 0,897 0,838 2,7 As (III) 0,167 0,153 0,155 0,161 0,169 4,2 DMA 1,582 1,461 1,579 1,582 1,462 4,3 MMA 0,372 0,367 0,343 0,362 0,374 3,3 As (V) 0,591 0,582 0,555 0,591 0,554 3,0 (%) Diện tích pic (counts) khơng sử dụng nội chuẩn Dạng rsd Lần Lần Lần Lần Lần AsB 1867213 1766412 1987456 1845763 1708945 5,7 As (III) 397398 412415 362516 394168 352563 6,5 DMA 2538306 2735475 2687546 2956751 2545623 6,3 MMA 2729129 2735475 2687546 2956751 2545623 5,4 As (V) 1398298 1606854 1432123 1424352 1324513 7,2 (%) Có thể thấy Bảng 3.7, phương pháp sử dụng nội chuẩn cho kết lặp lại đồng thời dạng As tốt Độ lệch chuẩn tương đối vể tỉ số diện tích píc cho thấy khả lặp lại tốt tín hiệu phân tích dạng As Độ lệch chuẩn tương đối nằm khoảng từ 2,7 % (AsB) đến 4,3% (DMA) Trong khơng sử dụng nội chuẩn độ lệch chuẩn tương đối nằm khoảng 5,4 đến 7,3 So sánh độ lệch chuẩn tương đối hai phương pháp có khơng sử dụng nội chuẩn nhận thấy không sử dụng nội chuẩn RSD cao khoảng 1,5-2,5 lần Điều lý giải không ổn định nguồn plasma cao tần cảm ứng trình bơm mẫu vào hệ thống HPLC-ICP-MS Đây nhược điểm detector ICP-MS phân tích dạng tồn chất Tuy nhiên, điều khắc phục sử dụng nội chuẩn thích hợp q trình phân tích Nội chuẩn bổ bù trừ thay đổi trình xử lý mẫu, đo tín hiệu phân tích Thơng thường để thực việc bổ hiệu chỉnh này, chất nội chuẩn đồng vị chất cần phân tích sử dụng (species-specific internal standard) thực kỹ thuật phân tích pha lỗng đồng vị khối phổ (ID-MS: isotopic dilution mass spectrometry) Nhưng để để sử dụng phương pháp nội chuẩn ngun tố cần phân tích phải có hai đồng vị bền.Trong thực tế, asen có đồng vị bền Do việc sử dụng kỹ thuật ID-MS không khả thi Tuy nhiên, nghiên cứu chất nội chuẩn không đặc trưng chứa nguyên tố As phân tử (speciesunspecific internal standard) sử dụng kèm theo bơm mẫu sau cột Mặc dù việc sử dụng chất nội chuẩn không đặc trưng (trong nghiên cứu As(V)) bổ bù trừ giai đoạn cuối qui trình phân tích (trong giai đoạn đo HPLC-ICP-MS) không bao gồm giai đoan xử lý mẫu Kết thực nghiệm việc sử dụng chất nội chuẩn cho độ lặp lại tín hiệu phân tích cao (Bảng 3.2) Do nội chuẩn khơng đặc trưng khuyến cáo sử dụng phân tích HPLC-ICP-MS, đặc biệt nguyên tố có đồng vị bền Trong nghiên cứu này, As(V) kết hợp với van bơm mẫu sau cột sử dụng nội chuẩn cho phép định lượng dạng asen đối tượng mẫu thực phẩm 11 Qua khảo sát tiến hành nghiên cứu này, chọn điều kiện tối ưu để phân tích dạng asen AsB, As(III) MMA, DMA As(V)trên hệ thống HPLC – ICPMS thể Bảng 3.8 Bảng 3.8 Tổng hợp điều kiện tối ưu cho tách dạng As hệ thống HPLC-ICPMS Thiết Thông số Giá trị bị HPLC (Shimadzu LC 10A) Hamilton PRP-X100, L = 250 mm, d = 46 mm, dp= Cột tách 10µm Nhiệt độ cột tách 25-27°C Thành phần pha động Kênh A: 10 mM (NH4)2CO3, pH 9,0 Kênh B: 50 mM (NH4)2CO3, pH 9,0 Tốc độ pha động 1,0 mL/ phút, rửa giải theo gradient Thể tích mẫu 500µL ICP-MS (Perkin Elmer ELAN 9000) Khí plasma 16 L/ phút Khí phụ trợ 1,05 L / phút Khí tạo sol 0,8 L/ phút Cơng suất plasma 1250 W Bộ tạo sol PFA Buồng phun Scott, double pass Ion đo As+ (m/z 75), Cl+(m/z 37) 3.3.3 Đánh giá độ phƣơng pháp 3.3.3.1 Hiệu suất thu hồi Hiệu suất thu hồi trình chiết dạng As mẫu đánh giá qua mẫu chuẩn cá là: (DORM-2), (DORM-3), (DORM-4) (BCR-627) Mẫu chuẩn gạo ERM-BC211 Năm mẫu CRM tiến hành chiết phân tích theo qui trình giồng quy trình chương Hàm lượng dạng As mẫu CRM phân tích HPLC-ICP-MS Bảng 3.9 Hiệu suất thu hồi mẫu chuẩn cá DORM-2 AsB (mg/Kg) DMA (mg/Kg) Phân tích Mẫu CRM Chứng Phân tích đƣợc Chứng đƣợc 15.5 ± 0.4 16.4 ± 1.1 0.27 ± 0.04 Nd Hiệu suất thu hồi (%) 95± RSD (%) 5,09 14,81 Bảng 3.10 Hiệu suất thu hồi mẫu chuẩn cá DORM-3 AsB (mg/Kg) DMA (mg/Kg) Phân tích Mẫu CRM Chứng Phân tích đƣợc Chứng đƣợc 5.87±0.06 Nd 0.35±0.01 Nd Hiệu suất thu hồi 95± (%) 2.86% RSD (%) 10.22% Bảng 3.11 Hiệu suất thu hồi mẫu chuẩn cá DORM-4 AsB (mg/Kg) Mẫu CRM Phân tích đƣợc DMA (mg/Kg) Chứng 12 Phân tích đƣợc Chứng 3,87 ± 0,16 Hiệu suất thu hồi (%) RSD (%) 3,9 5± 0,36 0,35±0,01 Nd 95 ± 2.86% 10.22% Bảng 3.12 Hiệu suất thu hồi mẫu chuẩn cá BCR 627 AsB (µmol/Kg) Phân tích Mẫu CRM Chứng đƣợc 50 ± 52 ± Hiệu suất thu hồi 46 ± 12 (%) RSD (%) 25% DMA (µmol/Kg) Phân tích đƣợc Chứng 1.90 ± 0.03 2.0 ± 0.3 75 ± 11 2% Bảng 3.13 Hiệu suất thu hồi mẫu chuẩn gạo ERM-BC211 DMA (mg/Kg) As(III) + As(V) (mg/Kg) Phân tích Mẫu CRM Chứng Phân tích đƣợc Chứng đƣợc 120 ± 119 ± 13 124 ± 124 ± 11 Hiệu suất thu hồi 101± 12 100 ± 10 (%) RSD (%) 5,83 4,84 Độ xác phương pháp thể Bảng 3.9 - Bảng 3.13 Có thể thấy AsB dạng hợp chất As chiếm chủ yếu mẫu CRM (DORM-2), (DORM-3) (DORM-4) tính theo As Ngoại trừ (BCR-627) tất giá trị thu thấp giá trị chứng nhận (có lẻ điều kiện bảo quản mẫu đọ ẩm cao) Độ xác dạng Asen tìm thấy mẫu chuẩn chứng nhận (DORM-2), (DORM-3) (DORM-4) cao 90% dạng asen khác Duy mẫu DORM3 dạng DMA khơng có chứng nhận, nhiên nghiên cứu dạng AsB DMA tìm thấy với 5,87 ± 0,06 (mg/kg) 0,35 ± 0,01 (mg/kg) tương ứng Đối với mẫu chuẩn ERMBC211 nồng độ DMA chứng nhận (119 ± 13) µmol/kg, kết thực nghiệm (120 ± 7) µmol/kg.Với độ tin cậy thống kê 95 % - 101% Kết giá trị đo so với chứng khơng khác Điều kết luận phương pháp HPLC-ICP-MS xác đáng tin cậy để phân tích dạng hợp chất As mẫu cá, gạo nói riêng mẫu thực phẩm nói chung 3.4 Tối ƣu điều kiện phân tích dạng Se thiết bị HPLC 3.4.1 Lựa chọn cột sắc kí Cột sắc ký có vai trị quan trọng việc tách chất phân tích khỏi nhau, ví trái tim hệ thống sắc kí Qua số báo tài liệu có liên quan, chúng tơi chọn pha tĩnh q trình tách cột sắc ký trao đổi anion PRP-X100 (10µm; 2,1x250mm).Bản chất cột PRP-X100 cột trao đổi anion Các dạng Se sau bơm vào van vào cột tách, dựa vào điều kiện pH thành phần pha động mà dạng Se tồn dưới dạng anion, cation hay dạng phân tử trung hịa Vì pH tối ưu chọn pH=8, nên pH dạng Se tồn dạng anion (dựa theo giá trị pKa), chúng trao đổi với anion cột sắc ký Sau bơm pha động chảy qua 13 cột, tùy thuộc vào lực dạng Se với cột pha động mà chúng rửa giải với thời gian khác nhau, dạng Se tách khỏi 3.4.2 Tối ƣu thành phần pha động pH Sau pha tĩnh pha động yếu tố thứ hai định đến hiệu tách sắc kí Nhìn chung, pha động với nồng độ pH ảnh hưởng đến: độ chọn lọc hệ pha, thời gian lưu trữ chất tan, hiệu lực cột tách (đại lượng Nef), độ phân giải chất cột pha tĩnh, độ rộng pic sắc kí Tiến hành khảo sát phân tích dạng Se hệ thống HPLC-ICP-MS điều kiện pha động sau: Pha động (NH4)2CO3, pH=5,0 gồm kênh A= 10mM B= 100mM Pha động (NH4)2CO3, pH=9,0 gồm kênh A= 10mM B= 100mM Pha động CH3COONH4,pH=5,2 gồm kênh A= 25mM B= 250mM Pha động gồm CH3COONH4,pH=8,0 gồm kênh A= 25mM B= 250mM Pha động Metanol : CH3COONH4= : 98 (v/v) EDTA 0,01%, pH=8,0 gồm kênh A=MeOH, B= 25mM C= 250mM (CH3COONH4) Kết phân tích thu sau: Hình 3.13 Sắc đồ dạng Se Se pha động MeOH : CH3COONH4= : 98 (v/v) EDTA 0,01%, gồm kênh A=MeOH, B= 25mM C= 250mM (CH3COONH4) 14 Dựa vào sắc đồ hình 3.13 ta thấy, pha động với thêm vào 2% ( theo thể tích) MeOH tối ưu cho tách dạng Se Trong thành phần pha động, với có mặt MeOH giúp cho dung dịch đệm hòa tan tốt chất cần khảo sát Ngoài ra, để làm giảm tạo hợp chất liên hợp Se với số kim loại khác(Fe, Mn, Zn, Ca,…) có mặt thành phần thuốc, ta thêm vào pha động EDTA 0,01% (w/v) 3.4.3 pH dung dịch đệm: Chúng tơi tiến hành phân tích với bốn dạngSe Se (VI), Se (IV), SeMeCys SeMet với điều kiện pha động gồm MeOH : CH3COONH4 = : 98 (v/v), sau thay đổi pH giá trị pH=5,2, pH= pH = Sắc đồ trình bày hình 3.14 Hình 3.14 Ảnh hưởng pH đến tách sắc ký dạng Se Từ kết hình 3.14, ta thấy giá trị pH=5,2 pH=7 dạng Se không tách khỏi sắc đồ lên thiếu dạng Se, pH=8 dạng Se tách tốt, chúng tơi chọn pH=8 giá trị pH tối ưu Điều hiểu có chuyển dạng Se pH=5,2 pH=7 dẫn tới tín hiệu phân tích khơng đạt yêu cầu tách dạng Se khỏi cách rõ rệt 3.4.4.Ảnh hƣởng tốc độ pha động chƣơng trình gradient rửa giải pha động Tốc độpha động góp phần ảnh hưởng đến hiệu tách sắc kí liên quan đến q trình thiết lập cân chất tan hai pha tĩnh pha động Khi tốc độ pha động nhỏ, chất phân tích muộn, gây dỗng pic, giảm độ nhạy tốn dung môi Khi tốc độ pha động lớn làm cho chất phân tích chưa tách khỏi bị đẩy khỏi cột dẫn đến tượng chồng pic Để lựa chọn tốc độ pha động tối ưu, tiến hành khảo sát dung dịch chuẩn Mix Se dạng, pha động với thành phần Metanol: CH3COONH4= : 98 (v/v) EDTA 0,01%, pH=8,0 gồm kênh A=MeOH, B= 25mM C= 250mM (CH3COONH4) tốc độ khác từ 0,4 – 1,0 ml/phút Kết khảo sát sau: 15 Hình 3.15 Ảnh hưởng tốc độ dịng đến tách sắc ký dạng Se Qua sắc đồ Hình 3.15, ta thấy tốc độ dịng 0,5 ml/phút peak sắc ký tách tốt nhất, ta chọn 0,5 ml/phút tốc độ dịng tối ưu cho q trình tách dạng Se.Chương trình dung mơi (rửa giải gradient) cho dạng Se có tính chất hóa lý giống nhau, nên lực chúng với pha tĩnh có khác nhỏ Chính muốn tách dạng Se khỏi cần thực rửa giải theo chương trình gradient nồng độ Qua khảo sát tiến hành nghiên cứu này, chúng tơi chọn điều kiện tối ưu để phân tích dạng Se (VI), Se (IV), Se-DLMet SeMeCys hệ thống HPLC – ICPMS thể Bảng 3.14 Bảng 3.14 Tổng hợp điều kiện tối ưu cho tách dạng Se hệ thống HPLC-ICPMS Thiết bị Thông số Giá trị HPLC (Shimadzu LC 10A) Cột tách Hamilton PRP-X100, L = 250 mm, d = 2,1 mm, dp= 10µm Nhiệt độ cột tách 25-27°C Kênh C: 25 mM CH COONH 0,1%EDTA, pH 8,0 Thành phần pha động 4, Kênh B: 250 mM CH COONH 0,1%EDTA, pH 8,0 4, Kênh A: Metanol Tốc độ pha động 0,5 mL/ phút, rửa giải theo gradient Thể tích mẫu 100µL ICP-MS (Perkin Elmer ELAN 9000) Khí plasma 16 L/ phút Khí phụ trợ 1,05 L / phút Khí tạo sol 0,8 L/ phút Cơng suất plasma 1250 W Bộ tạo sol PFA Buồng phun Scott, double pass Ion đo + Se (m/z 78, 82) 3.5 Đánh giá phƣơng pháp phân tích dạng Se hệ ghép nối HPLC-ICPMS 3.5.1 Khoảng tuyến tính đại lƣợng đặc trƣng phƣơng pháp phân tích 16 Xây dựng đường chuẩn: Mẫu phân tích số mẫu thuốc nấm men lưu hành thị trường với hàm lượng nhỏ, xây dựng đường chuẩn ởkhoảng nồng độ thấp từ 25ppb-500ppb Đường chuẩn xây dựng dựa hai phương pháp thêm chuẩn nội chuẩn để so sánh.Dung dịch nội chuẩn Se (VI) 100 ng/ml bơm vào hệ thống HPLC-ICP-MS qua van bơm mẫu sau cột Sắc đồ thu được, chuyển đổi sử dụng phần mềm Xcalibux 2.1 Diện tích pic dạng Se nội chuẩn tính tốn phần mềm Quan browser Qual browser tích hợp Xcalibua.Tỷ số diện tích pic tính diện tích píc chất phân tích chia cho diện tích píc nội chuẩn.Tỷ số diện tích pic trung bình trình bày Bảng 3.14 3.15 Tương quan tuyến tính tỉ số diện tích píc (diện tích pic) phụ thuộc vào nồng độ dạng Se dung dịch dùng để lập đường chuẩn Bảng 3.15 Tỷ số diện tích dạng Se so với nội chuẩn Tỉ số diện tích pic 25 50 100 200 300 400 STT Dạng ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml SeMeCys 0,376 0,584 1,108 2,213 3,143 4,150 Se (IV) 0,862 1,683 3,159 6,381 8,782 11,288 Se-DLMet 1,580 3,016 4,855 13,347 18,761 24,918 Se (VI) 2,255 3,621 7,327 17,231 24,642 27,611 Diện tích pic trung bình(counts) 25 50 100 200 300 400 STT Dạng ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml SeMeCys 11474 18469 41309 88837 194617 272163 Se (IV) 26300 53244 113714 256162 543807 740336 Se-DLMet 48218 95410 188990 420727 944462 1634232 Se (VI) 68822 114521 263786 543159 1240533 1810851 500 ng/ml 5,126 13,703 31,659 500 ng/ml 469080 1253990 2897158 - Như bảng 3.16, hệ số tương quan R2 phương trình hồi quy có sử dụng nội chuẩn tốt so với khơng sử dụng nội chuẩn Do đó, nội chuẩn sử dụng để định lượng dạng selen mẫu thực.Dựa vào kết phương trình hồi quy tuyến tính SeMeCys, Se (IV), Se-DLMet Se (VI) ta thấy phương trình có hệ số tương quan R2 > 0.995 Như xác định diện tích pic dạng Se ta tính nồng độ với độ xác lớn 99,5% Đồ thị biểu diễn tương quan tín hiệu phân tích vào nồng độ dạng Se mẫu đưa Bảng 3.16 Bảng 3.16 So sánh phương trình hồi quy với hệ số tương quan Phƣơng trình hồi quy biểu diễn tƣơng quan tín hiệu phân tíchcủa dạng Se phụ thuộc vào nồng độ Dạng TT selen Có sử dụng nội chuẩn Khơng sử dụng nội chuẩn Phƣơng trình hồi quy R2 Phƣơng trình hồi quy R2 -5 Y=(0,010±9,6.10 )*X+ SeMeCys 0,9995 Y=(594±17)*X (9125±4896) 0,9957 (0,120±0,0269) Y=(0,027±5,4.10-4)*X + Y=(1570±75)*X Se (IV) 0,9980 0,9887 (0,420±0,151) (48734,4±21147) -4 SeY=(0,063±8,98.10 )*X Y=(4304±218)*X 0,9990 0,9872 DLMet (0,027±0,252) (173297,8±61534) Y=(0,067±11,25.10Y=(4432±197)*X Se (VI) 0,9989 0,9902 )*X+(0,392±0,253) (117123±55511) 17 Bảng 3.17 Các đại lượng đăc trưng phép phân Hình 3.16 Kết sắc đồ dạng Se đo tích dạng Se phương pháp HPLC-ICP-MS tối ưu điều kiện hệ thống HPLC-ICP-MS 3.5.2 Đánh giá độ lặp lại thiết bị Một thông số quan trọng khác phương pháp phân tích độ ổn định phép đo Nó thể qua độ lặp lại kết phân tích.Để đánh giá độ ổn định thời gian lưu tín hiệu phân tích Năm dung dịch chuẩn chứa đồng thời bốn dạng Se nồng độ 100 ppb tính theo Se chuẩn bị cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc nước cất Dung dịch chuẩn bơm vào hệ thống HPLC-ICP-MS có sử dụng bơm mẫu sau cột điều kiện tối ưu trình bày phần Dung dịch chuẩn Se (VI) (Merck) nồng độ 100 µg/Ltrong dung dịch HNO3 2% sử dụng làm nội chuẩn bơm vào hệ thống qua van bơm mẫu sau cột tách Số liệu xử lý phần mềm Xcalibur version 2.1 Thermo Scientific.Diện tích píc dạng Se tương ứng nội chuẩn lấy tích phân kế phần mềm Quan Browser tích hợp Xcalibur.Tỉ số diện tích pic tính cách lấy diện tích pic dạng selen chia cho diện tích pic nội chuẩn.Kết diện tích pic tỉ số diện tích pic trình bày Bảng 3.18 Bảng 3.18 Độ lặp lại tín hiệu phân tích có khơng sử dụng nội chuẩn Diện tích pic (khơng sử dụng nội chuẩn) Dạng Lần Lần Lần Lần Lần RSD(%) SeMeCys 41243 41309 46828 50499 43215 8,95 Se (IV) 113714 117853 142727 147473 121647 11,92 Se-DLMet 188990 160239 212308 197201 187234 10,03 Se (VI) 263786 275504 290605 301274 269076 5,55 Tỷ số diện tích pic (sử dụng nội chuẩn) Dạng Lần Lần Lần Lần Lần RSD(%) SeMeCys 1,146 1,105 1,059 1,108 1,100 2,80 Se (IV) 3,159 3,151 3,229 3,236 3,097 1,83 Se-DLMet 4,855 4,285 4,803 4,327 4,766 6,02 Se (VI) 7,327 7,367 6,575 6,611 6,850 5,49 Như thấy Bảng 3.18, phương pháp sử dụng nội chuẩn có độ lặp lại tốt cho đồng thời dạng tồn Se Độ lệch chuẩn tương đối vể tỉ số diện tích píc cho thấy khả lặp lại tốt tín hiệu phân tích dạng Se Độ lệch chuẩn tương đối nằm khoảng từ 1,83 % (Se IV) đến 6,02% (SeDLMet) Trong khơng sử dụng nội chuẩn độ lệch chuẩn tương đối nằm khoảng 5,55 đến 11,92% So sánh độ lệch chuẩn tương đối hai phương pháp có khơng sử dụng nội chuẩn nhận thấy không sử dụng nội chuẩn %RSD cao nhiều (cao khoảng 1-5 lần) Điều lý giải không ổn định nguồn plasma cao tần cảm ứng trình bơm mẫu vào hệ thống HPLCICP-MS Đây nhược điểm detector ICP-MS phân tích dạng tồn chất Tuy nhiên, điều khắc phục sử dụng nội chuẩn thích hợp q trình phân tích.Nội chuẩn bổ bù trừ thay đổi trình xử lý mẫu, đo tín hiệu phân tích Thơng thường để thực việc bổ hiệu chỉnh này, chất nội chuẩn đồng vị chất cần phân tích sử dụng (species-specific internal standard) thực kỹ thuật phân tích pha lỗng đồng vị khối phổ (ID-MS) Nhưng để sử dụng phương pháp nội chuẩn nguyên tố cần phân tích phải có hai đồng vị bền.Trong 18 thực tế, selen có đồng vị bền Do việc sử dụng kỹ thuật ID-MS không khả thi Tuy nhiên, nghiên cứu chất nội chuẩn khơng đặc trưng chứa nguyên tố Se phân tử (speciesunspecific internal standard) sử dụng kèm theo bơm mẫu sau cột Mặc dù việc sử dụng chất nội chuẩn không đặc trưng (trong nghiên cứu Se (VI)) bổ bù trừ giai đoạn cuối qui trình phân tích (trong giai đoạn đo HPLC-ICP-MS) khơng bao gồm giai đoan xử lý mẫu Kết thực nghiệm việc sử dụng chất nội chuẩn cho độ lặp lại tín hiệu phân tích cao (Bảng 3.18) Do nội chuẩn khơng đặc trưng khuyến cáo sử dụng phân tích HPLC-ICP-MS, đặc biệt nguyên tố có đồng vị bền Trong nghiên cứu này, Se (VI) kết hợp với van bơm mẫu sau cột sử dụng nội chuẩn cho phép định lượng dạng selen đối tượng mẫu thực phẩm 3.5.3 Độ thu hồi Hiệu suất thu hồi (H%) phương phápđược xác định cách thêm lượng chuẩn biết vào mẫu thật khơng chứa chất phân tích Chọn mẫu thuốc có dạng tương tự mẫu phân tích (mẫu trắng), với điều kiện khơng chứa Se (xác thực việc đo tổng hàm lượng với ICP-MS) Sau thêm vào chuẩn Mix Se dạng 100ppb, chiết với điều kiện mẫu thực Đem dung dịch chiết đo dạng hệ thống HPLC-ICP-MS, đo lặp lại lần với nội chuẩn Se (VI) 100ppb Kết thu Bảng 3.19 Bảng 3.19 Độ thu hồi dạng selen Dạng Se SeMeCys Se (IV) Se-DLMet Se (VI) Thêm chuẩn 100ppb 100ppb 100ppb 100ppb Nồng độ trung bình (ppb) 113,3 104,7 91,5 93,9 Độ thu hồi (H %) 113,3 104,7 91,5 93,9 Kết thu bảng 21 cho thấy tách dạng Se có độ lặp lại tốt có độ thu hồi nằm khoảng 73,5% đến 101,7% Kết nằm khoảng 70% - 120% kết hoàn toàn chấp nhận Có thể thấy hiệu suất thu hồi hai dạng Se-DLMet Se (IV) thấp, điều giải thích chuyển dạng Se (IV) Se-DLMet thời gian bảo quản dung dịch thêm chuẩn chúng tơi Để tìm hiểu kỹ vấn đề này, phải có nghiên cứu kỹ để đánh nghiên cứu điều kiện thí nghiệm chưa làm điều 3.6 Ứng dụng phƣơng pháp phân tích mẫu thực 3.6.1 Kết nồng độ dạng As mẫu thực 3.6.1.1 Kết dạng As mẫu nƣớc mẫu gạo Tiến hành phân tích 20 mẫu nước giếng khoan mẫu gạo lấy từ xã Nhật Tân Huyện kim Bảng Tỉnh Hà Nam thể qua Bảng 3.20 Bảng 3.21 sau: Bảng 3.20 Nồng độ dạng As nước giếng khoan Bảng 3.21 Nồng độ dạng As mẫu gạo 19 Hình 3.17 Sắc đồ HPLC-ICP-MS mẫu gạo Từ Bảng 3.20 dạng As phát có thời gian lưu trùng với thời gian lưu As(III) Tỉ lệ chất mẫu nằm khoảng 78-84% so với tổng lượng As Như thấy nguồn nước bị nhiễm asen, bên cạnh ba dạng asen As(III), DMA As(V) phát tất mẫu gạo Bảng 3.21, điều lý giải mẫu gạo trồng nơi có nguồn nước bị nhiễm asen 3.6.1.2 Kết dạng As mẫu cá nƣớc mắm Kết sau phân tích mẫu cá mẫu nước mắm thể qua Bảng 3.22 Bảng 3.23 sau Bảng 3.22 Nồng độ dạng As mẫu cá Bảng 3.23 Nồng độ dạng As mẫu nước mắm 20 Hình 3.18 Sắc đồ HPLC-ICP-MS mẫu cá Hình 3.19 Sắc đồ HPLC-ICP-MS mẫu nước mắm PL 100 lần Từ Bảng 3.22, Hình 3.18 (sắc đồ mẫu cá) ta kết luận As mẫu cá tồn chủ yếu dạng AsB dạng không độc có hầu hết lồi động vật biển bên cạnh từ Bảng 3.23 Hình 3.19 dạng hữu AsB tìm thấy mẫu nước mắm Điều chứng tỏ cá nguyên liệu dùng để sản xuất nước mắm hàm lượng AsB từ cá có nước mắm điều hiển nhiên dạng khơng bị chuyển dạng q trình lên men sản xuất nước mắm Tổng nồng độ As loại mẫu nước mắm xác định phương pháp ICPMS hàm lượng dạng asen nước mắm xác định HPLC_ICPMS kết cho thấy hàm lượng dạng asen sau tách sắc ký thấp so với tổng hàm lượng asen mẫu nước mắm sau phân tích ICPMS Điều lý giải phân tích hàm lượng asen tổng số mẫu nước mắm ICPMS tăng muối mẫu nước mắm lớn dẫn đến tượng trùng khối 3.6.1.3 Kết dạng As mẫu Huyết nƣớc tiểu Tiến hành phân tích 17 mẫu nước tiểu 17 mẫu huyết lấy xã Nhật Tân Huyện kim Bảng Tỉnh Hà Nam nồng độ dạng As mẫu huyết nước tiểu thể qua Bảng 3.24 Bảng 3.24 Nồng độ dạng As mẫu Huyết nước tiểu Hình 3.20 Sắc đồ HPLC-ICP-MS mẫu huyết Hình 3.21 Sắc đồ HPLC-ICP-MS mẫu nước tiểu Từ Bảng 3.24, Hình 3.20 Hình 3.21 tất dạng As tìm thấy mẫu huyết nước tiểu Tuy nhiên dạng asen mẫu nước tiểu AsB DMA, dạng AsB DMA As(V) dạng có nhiều mẫu huyết Mặt khác, tổng nồng độ hợp chất arsen vô huyết nước tiểu tính tổng arsenite arsenate nồng độ hợp chất arsen vô dao động từ 1,84 đến 8,0 ng·mL-1 Điều chứng tỏ nguồn tiếp xúc asen với người chủ yếu đến từ nước gạo 21 3.6.2 Kết nồng độ dạng Se mẫu thực Tiến hành phân tích dạng Se có mẫu thực kết thể Bảng 3.25 Bảng 3.25 Kết tổng hợp dạng selen có mẫu thuốc, TPCN nấm men Nấm men Sezlan Colaf Centrum STT Dạng Se (µg/g) (µg/g) (µg/g) (µg/g) SeMeCys nd nd nd 35,36 Se (IV) 108,32 nd nd nd Se-DLMet nd nd nd nd Se (VI) nd nd nd nd Tổng* 108,32 35,36 Hàm lƣợng đo tổng 231,66 5,73 2,27 35,76 TPCN (µg/g) nd nd 8,72 8,05 16,77 20,16 Trong mẫu nấm men tồn dạng Se-DLMet với hàm lượng lớn Trong mẫu thuốc Selazn, có hai dạng Se phát khơng có dạng Se khảo sát Trong mẫu thuốc Colaf xác nhận có mặt dạng Selen khơng thuộc dạng Se nghiên cứu Trong mẫu thuốc Centrum có dạng Se (VI) với píc sắc ký rõ ràng hàm lượng tương đối lớn Trong mẫu thực phẩm chức xác định định lượng hai dạng Se Se-DLMet Se (VI) Có thể nói SeMeCys dạng Se có tác dụng chống lão hóa ngăn ngừa số bệnh tim mạch… Cũng lí đó, thuốc nghiên cứu chứa SeMeCys Trong thuốc, Se chiếm lượng nhỏ (trong khoảng từ 16,77µg/g đến 35,36 µg/g), cịn nấm men hàm lượng Se cao (~110 µg/g ) Mặc dù chiếm hàm lượng nhỏ, có mặt Se thành phần thuốc góp ích cho chống lão hóa tế bào phòng chống bệnh nguy hiểm dựa đặc tính chống oxy hóa chống ung thư cho chất ức chế trình tế bào cụ thể phát triển bệnh ung thư, cho Se vitamin E có khả ngăn ngừa ung thư tuyến tiền liệt (Klein , Lippman cộng 2003) Vì vậy, người nên bổ sung lượng Se cần thiết cho thể thông qua việc sử dụng thuốc vitamin có chứa Se, thơng qua ăn uống dinh dưỡng hàng ngày So với Se vô cơ, Se hữu cho an toàn khả dụng sinh học bổ sung chế độ ăn uống Se vô (Abdulah, Miyazaki et al 2005) Ngày nay, nguồn Se chế độ ăn uống người loại hạt, ngũ cốc, thịt, trứng sản phẩm từ sữa Một nguồn Se hấp dẫn khác men selen hóa chi phí thấp hàm lượng cao SeMet (Rampler 2009) Các loài Se khác có đóng góp khác cho việc ngăn ngừa ung thư KẾT LUẬN Trong nghiên cứu thành công việc tách dạng Asen bao gồm AsB, As (III), DMA, MMA As (V) bước đầu nghiên cứu phân tích dạng Selen bao gồm SeMeCys, Se (IV), SeDLMet, Se (VI) mẫu nước, gạo, nước mắm, cá, huyết thanh, nước tiểu, thuốc thực phẩm chức hệ ghép nối HPLC- ICPMS Kết thu sau: Đã phát triển phương pháp phân tích HPLC-ICP-MS dùng cho phân tích dạng asen Các thơng số đặc trưng phương pháp phân tích LOD, LOQ, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, nghiên cứu đánh giá Độ lặp lại độ xác phương pháp phân tích HPLC-ICP-MS cải thiện đáng kể sử dụng nội chuẩn thông qua van bơm mẫu sau cột Độ lặp lại tín hiệu phân tích tăng lên 1-2 lần 22 Đã nghiên cứu cách hệ thống, chi tiết ảnh hưởng pha động (cụ thể hàm lượng cacbon pha động) tới tín hiệu phân tích Kết thực nghiệm tín hiệu phân tích asen selen tăng có mặt cacbon pha động tín hiệu asen phụ thuộc vào gradient pha động Đánh giá xác nhận giá trị sử dụng phương pháp thông qua mẫu CRM cho phân tích asen tổng, mẫu CRM cho phân tích dạng tồn As Kết thực nghiệm khơng có khác mặt thống kê kết phân tích giá trị ghi nhận chứng Điều có nghĩa phương pháp phân tích nêu nghiên cứu hồn tồn có giá trị sử dụng phân tích dạng asen mẫu thực phẩm phân tích asen tổng Đã áp dụng phương pháp nêu vào phân tích dạng asen, selen asen, selen tổng số loại mẫu khác Kết thu tin cậy Bên cạnh dạng asen dạng selen chính, số dạng tồn khác asen selen phát Với kết đạt luận án mở hướng nghiên cứu phân tích dạng tồn asen selen mẫu thực phẩm, môi trường, sinh học mẫu thuốc, thực phẩm chức có chứa selen tìm hiểu liên quan dạng asen selen nguồn gốc nhiễm để có phương thức phịng ngừa nắm bắt độc tính chúng Phương pháp phân tích sử dụng để đánh giá nguồn gốc phơi nhiễm As selen tới người, đặc biệt phơi nhiễm dạng asen khác 23 Các cơng trình khoa học liên quan đến luận án [1] Nguyễn Mạnh Hà, Trần Quang Thành, Nguyễn Hà Trang, Phạm Tiến Đức,Tạ Thị Thảo,Từ Bình Minh, Lê Văn Chiều, Chu Đình Bính, (2017),“Phân tích dạng tồn arsen mẫu cá biển phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao ghép nối với detector khối phổ kế nguồn plasma cao tần cảm ứng (HPLC-ICPMS)”, Tạp chí Hóa học, 55(E1,2), trang 94 – 98 [2] Nguyễn Mạnh Hà, Nguyễn Thị Dung, Chu Thị Huệ, Tạ Thị Thảo, Nguyễn Thị Hồng Yến, Từ Bình Minh, Đỗ Hồng Qn, Chu Đình Bính, (2018), “Phân tích dạng tồn asen mẫu nước mắm phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao ghép nối với detector khối phổ kế nguồn plasma cao tần cảm ứng (HPLC-ICPMS)”, tạp chí Hóa lý sinh, 23(4), trang 80 – 86 [3] Nguyễn Mạnh Hà, Vũ Hải Anh, Từ Bình Minh, Chu Đình Bính, Nguyễn Thị Hương Giang, (2018) “Phân tích dạng asen phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao ghép nối với detector khối phổ kế nguồn plasma cao tần cảm ứng sử dụng buồng phản ứng động học (HPLC-ICP-DRC-QMS)”, tạp chí Phân tích Hóa lý sinh học, 23(5), trang 194 - 203 [4] Nguyễn Mạnh Hà, Nguyễn Thị Dung, Ngô Quý Trung, Bùi Thị Lan Anh, Tạ Thị Thảo, Từ Bình Minh, Chu Đinh Bính, Nguyễn Thị Hồng Yến, (2018),“Định lượng dạng Selen dược phẩm phương pháp HPLC ghép nối với ICPMS”, Tạp Chí Hóa học, T56 6E1, 5-9 [5] Manh Ha Nguyen, Tien Duc Pham, Thi Lien Nguyen, Hai Anh Vu, Thi Thao Ta, Minh Binh Tu, Thi Hong Yen Nguyen and Dinh Binh Chu, (2018),“Speciation Analysis of Arsenic Compounds by HPLC-ICPMS: Application for Human Serum and Urine”, Journal of Analytical Methods in Chemistry, https://www.hindawi.com/journals/jamc/2018/9462019/ [6] Manh Ha Nguyen, Hai Anh Vu,, Hong An Vu Thi, Quan Do Hong, Xuan Hoang Dang, Thi Ngoc Bich Nguyen, Hong Quan Trinh, Thuy Ly Bich, Tien Thanh Nguyen, Dung Le Van, Minh Binh Tu and Dinh Binh Chu (2019), “Speciation analysis of arsenic compounds by high performance liquid chromatography in combination with inductively coupled plasma dynamic reaction cell quadrupole mass spectrometry: Application for Vietnamese rice sample”, Journal of Analytical Methods in Chemistry, https://www.hindawi.com/journals/jamc/2019/5924942/ 24 ... lượng xác dạng khác asen selen mẫu cần thiết Với lý trên, lựa chọn đề tài ? ?Nghiên cứu xác định lượng vết dạng Asen selen phương pháp ghép nối sắc kí lỏng hiệu cao với khối phổ Plasma cảm ứng HPLC-ICP-MS? ??... độc asen 1.2 Các dạng tồn chuyển hóa dạng selen 1.2.1 Độc tính ứng dụng ảnh hưởng selen đến sức khỏe người 1.3 Các phương pháp phân tích dạng Asen selen 1.3.1 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao ghép. .. vơ Se(IV), Se(VI), DMDSe, SeMet phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao HPLC ghép nối với khối phổ plasma cảm ứng ICPMS Ứng dụng phương pháp phân tích để phân tích dạng asen đối tượng mẫu như: Nước, nước