Đồng Nai là vùng có những thuận lợi vào bậc nhất trong cả nước về phát triển nông nghiệp hàng hóa toàn diện với các loại cây trồng có giá trị kinh tế cao như cây ăn quả (bưởi, nhãn, chôm chôm, sầu riêng, Cam, quýt...), cây lương thực (lúa, bắp), cây công nghiệp (tiêu, điều, cà phê, cao su...)Đầu tư phân bón là bắt buộc trong sản xuất nông nghiệp để đạt năng suất cao và duy trì độ phì nhiêu của đất. Thực tế việc sử dụng phân bón vẫn còn mất cân đối, dẫn đến năng suất...
KẾT QUẢ HOẠT ĐỘNG BẢO TỒN QUỸ GEN VI SINH VẬT TRỒNG TRỌT GIAI ĐOẠN 2006-2010 Nguyễn Thu Hà1 SUMMARY Agriculture culture collection at soils and fertilizers research institute (Period 2006-2010) The establishment of an agriculture culture collection plays an important role to significantly support for biotechnological development The main activities of agriculture culture collection are preserving, collect, isolate, evaluate, taxonomy, document and research on application ability of microbes 673 strains from foreign and domestic including bacteria, yeasts and filamentous fungi were collected, isolated and preserved Slant agar, sterile distilled water, liquid paraffin, freeze-drying, methylcellulose, or liquid nitrogen freezing was used to preserve cultures to maintain the existent capacity and active biology of them 49 strains have been screened based on biological activity 88/183 evaluated strains (48,09%) of agriculture culture collection have multi functional biological activity (nitrogen fixing, phosphorous solubilizing, cellulose degradation, plant growth promoting, tolerant to high temperature, anti pathogenic bacteria, fungi and etc) Bergey’s key taxonomy, Kit API 20E, API 20NE, API 50CH, BIOLOG or sequence analysis of 16S rRNA genes was used for microbial taxonomy Microbes have been researched, evaluated and utilized in agriculture such as micro-biofertilizer or microbial inoculant 50 strains have been introduced to produce micro-biofertilizer or microbial inoculants Keyword: Strain, collect, isolate, preserve, evaluate, utilize, biological activity, micro-biofertilizer and microbial inoculant Viện Thổ nhng Nụng hoỏ I ĐặT VấN Đề Ngun gen vi sinh vật có vai trị vơ quan trọng chiến lược phát triển công nghệ sinh học Đây nguồn vật liệu khởi đầu cho kỹ thuật di truyền, công nghệ vi sinh công nghệ lên men Công tác lưu giữ bảo tồn nguồn gen vi sinh vật có ý nghĩa lớn phịng nghiên cứu công nghệ vi sinh Từ năm 1994, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam trước đây, Viện Thổ nhưỡng Nơng hóa giao nhiệm vụ bảo tồn quỹ gen vi sinh vật trồng trọt Nhiệm vụ công tác bảo tồn quỹ gen vi sinh vật trồng trọt bảo quản, thu thập, tuyển chọn, đánh giá, phân loại, tư liệu hóa, nghiên cứu khai thác sử dụng có hiệu nguồn gen vi sinh vật phục vụ phát triển bền vng [2, 3, 4] II VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHI£N CøU Vật liệu nghiên cứu Nguồn gen vi sinh vật Phương pháp nghiên cứu: Bảo quản chủng vi sinh vật phương pháp bảo quản thạch nghiêng, nước cất khử trùng, cát, parafin, lạnh sâu, methylcellulose (MC), đông khô nitơ lỏng, v.v [1, 4, 5] Phương pháp lấy mẫu theo TCVN TCN; mẫu đất, rễ thu thập theo đối tượng trồng (rau, đậu, lạc ) theo vùng sinh thái 3 Phân lập, tuyển chọn, xác định số đặc điểm sinh học ảnh hưởng điều kiện ni cấy đến hoạt tính sinh học chủng vi sinh vật xác định theo phương pháp nghiên cứu vi sinh vật thông thường Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật theo TCVN 4884:2005 [9] Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng vi khuNn, nấm gây bệnh theo 10 TCN 714:2006 [11], 10 TCN 867:2006 [12] Khả sinh tổng hợp IAA thô xác định theo phương pháp Salkowsky cải tiến Khả hình thành nốt sần xác định phương pháp trồng nhà lưới, cát vơ trùng, thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên, lần nhắc Chỉ tiêu theo dõi: N ốt sần tổng số Khả cố định nitơ xác định theo 10 TCN 299:97 [10] Khả phân giải xenlulo xác định theo TCVN 6168:2002 [8] 10 Khả phân giải phốt phát khó tan xác định theo TCVN 6167:1996 [7] 11 Khả chuyển hóa nitrat chủng vi sinh vật xác định cách đo hàm lượng N O2- máy quang phổ kế dựa vào phản ứng với thuốc thử Griss 12 Phương pháp phân loại chủng vi sinh vật: - Xác định tên vi sinh vật theo khóa phân loại Bergey [6] - Xác định tên vi sinh vật Kit API 20E, API 20N E, API 50CH máy BIOLOG: Dựa phản ứng sinh hóa chủng vi sinh vật 20, 50 95 nguồn bon khác - Xác định tên vi sinh vật phương pháp phân loại học phân tử dựa sở giải trình tự đoạn gen 16s ARN riboxom chủng vi khuNn nghiên cứu, so sánh với trình tự có sẵn ngân hàng gen quốc tế EMBL phương pháp FASTA 33 để định loại đến loài chủng vi sinh vật Phương pháp xử lý số liệu theo chương trỡnh thng kờ IRRISTAT III KếT QUả Và THảO LUậN Bảo quản nguồn gen vi sinh vật Quỹ gen vi sinh vật nông nghiệp lưu giữ 673 chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh vật bảo quản định kỳ cấy chuyển sau thời gian thích hợp (1, 3, hay 12 tháng), tùy thuộc vào nhóm chủng giống Nhiều phương pháp khác sử dụng bảo quản nguồn gen vi sinh vật (thạch nghiêng, nitơ lỏng, lạnh sâu (200C), Methylcellulose (MC), v.v Số lượng, chủng loại, nguồn gốc phương pháp bảo quản nguồn gen vi sinh vật trồng trọt trình bày bảng Bảng Số lượng, chủng loại, nguồn gốc phương pháp bảo quản nguồn gen vi sinh vật trồng trọt TT Đối tượng Vi khuẩn: Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Bradyrhizobium (cho đậu tương, đậu xanh, đậu đen, lạc), Enterobacter, Pseudomonas, Burkholderia, Lactobacterium, Nguồn gốc Số lượng Việt Nam Nhập nội 487 101 Hoạt tính sinh học Phương pháp bảo quản Cố định nitơ, phân giải lân, kích thích sinh trưởng, sinh polysacharit, ức chế vi khuẩn-nấm gây bệnh héo xanh, thối rễ, phân giải xenllulo, sinh axit amin, Thạch nghiêng, Thạch bán lỏng, Methylcellulose, O Lạnh sâu (-20 C), Nitơ lỏng, Flavobacteria, Klebsiella v.v chuyển hóa nitrat, v.v Đơng khơ Xạ khuẩn: Streptomyces Việt Nam Nhập nội 54 Phân giải xenlluloza Thạch nghiêng Nấm men: Candida, Rhodotorula, Saccharomyces, Pichia Việt Nam Nhập nội 11 Lên men sinh khối, sinh carotenoit, lên men rượu, ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh Thạch nghiêng Nấm sợi: Aspergilus, Fusarium, Penicilium, Rhizoctonia, Chetomium, Penicilium Việt Nam Nhập nội 12 Phân giải lân, gây bệnh thực vật, phân giải xenluloza Thạch nghiêng Tổng 673 Thu thập, phân lập làm giàu nguồn gen Thu thập, phân lập làm giàu nguồn gen nhiệm vụ bảo tồn quỹ gen vi sinh vật trồng trọt Giai đoạn 20062010, quỹ gen vi sinh vật tiến hành phân lập, tuyển chọn 49 nguồn gen vi sinh vật từ mẫu đất, mẫu rễ, lạc, đậu tương, rau, ngô, khoai tây, hồ tiêu, cà phê, v.v thu thập từ Hà Nội, Bắc Giang, Sơn La, Hưng Yên, Nam Định, Nghệ An, Thanh Hóa, Quảng Trị, v.v Đánh giá nguồn gen Phục vụ cho công tác tư liệu hoá, bảo quản khai thác sử dụng nguồn gen vi sinh vật, chủng vi sinh vật phân lập đánh giá đặc điểm vi sinh vật học (đặc điểm hình thái, tế bào), hoạt tính sinh học (cố định nitơ cộng sinh, cố định nitơ tự do, kích thích sinh trưởng thực vật, sinh polysacharit, phân giải tinh bột, phân giải xenlulo, phân giải phốt phát khó tan ức chế nấm-vi khuNn gây bệnh vùng rễ trồng, v.v ) Cùng với phát triển khoa học công nghệ, nhiều nghiên cứu thời gian gần cho thấy nhiều vi sinh vật có khả đa hoạt tính Vì vậy, việc đánh giá tính đa chức nguồn gen vi sinh vật lưu giữ nội dung quỹ gen vi sinh vật trồng trọt Kết đánh giá 183 nguồn gen vi sinh vật (thuộc Agrobacterium, Athrobacter, Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas xạ khuNn) có 88 nguồn gen đa hoạt tính (chiếm 48,09%); đặc biệt nhiều chủng số có hoạt tính sinh học Đây nguồn gen có giá trị, nghiên cứu khai thác sử dụng hợp lý Kết đánh giá hoạt tính sinh học nguồn gen vi sinh vật thể bảng Bảng Kết đánh giá hoạt tính sinh học nguồn gen vi sinh vật TT Nhóm vi sinh vật Agrobacterium Số lượng Chỉ tiêu đánh giá Kết đánh giá - Khả sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật (sinh IAA) - Khả sinh polysacharit - 2/8 nguồn gen Agrobacterium đánh giá (chiếm 25%) có hoạt tính sinh học; Nguồn gen Agrobacterium đánh giá có hàm lượng IAA hình thành đạt cao sau ngày ni cấy (46,08-180,0 µg/ml), trừ nguồn gen Ag 06 đạt cao sau ngày nuôi cấy - 2/8 nguồn gen Agrobacterium đánh giá có khả sinh polysacharit (hàm lượng polysacharit hình thành đạt 18,5 49,5 g/l TT Nhóm vi sinh vật Số lượng Chỉ tiêu đánh giá Kết đánh giá Athrobacter - Khả sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật (sinh IAA) - Khả sinh polysacharit - 1/5 nguồn gen Athrobacter đánh giá (chiếm 20%) có hoạt tính sinh học Nguồn gen Athrobacter đánh giá có hàm lượng IAA hình thành đạt cao sau 7-9 ngày ni cấy (16,94-134,8 µg/ml) - 1/5 nguồn gen Athrobacter đánh giá có khả sinh polysacharit (hàm lượng polysacharit hình thành đạt 6,8 g/l) Azotobacter 50 - Khả cố định nitơ - Khả sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật - Khả sinh polysacharit - 16/50 chủng Azotobacter đánh giá (chiếm 32%) có hoạt tính sinh học (cố định nitơ, sinh hoạt chất kích thích trưởng sinh thực vật sinh polysacharit); 24 chủng (chiếm 48%) có hoạt tính sinh học 10 chủng (chiếm 20%) có hoạt tính sinh học - 43/50 chủng Azotobacter đánh giá có khả cố định nitơ Hàm lượng etylen hình thành đạt từ 4,5 4327,6 nmol/ml/ngày; 24 chủng có hàm lượng etylen hình thành đạt >2000 nmol/ml/ngày; - 45/50 chủng Azotobacter đánh giá có khả sinh chất kích thích sinh trưởng Hàm lượng IAA hình thành đạt từ 7,61 - 95,16 µg/ml; - 18/50 chủng Azotobacter đánh giá có khả sinh polysacharit Hàm lượng polysacharit hình thành đạt 28 - 489 g/l Bacillus 46 - Khả sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật (sinh IAA thơ) - Khả phân giải kitin - Khả phân giải xenlluloza, bột giấy - Khả phân giải phốt phát khó tan - Khả ức chế nấm, vi khuẩn gây bệnh vùng rễ trồng - 44/46 chủng Bacillus (chiếm 95,65%) có khả sinh IAA thơ; chủng (chiếm 19,57%) có khả sinh IAA thơ 300 µg/ml - 34/46 chủng Bacillus (chiếm 73,91%) có khả phân giải kitin; có 14 chủng Bacillus (chiếm 30,44%) có khả phân giải kitin 30mm - 3/46 chủng Bacillus (chiếm 6,5%) có khả phân giải phốt phát canxi - 32 chủng Bacillus (chiếm 69,57%) có khả phân giải bột xenlulo bột giấy; có 13 chủng Bacillus (chiếm 28,26%) có đường kính vịng phân giải 30 mm - 24/46 chủng Bacillus (chiếm 52,17%) không ức chế VKHX yếu, 22 chủng Bacillus (chiếm 47,83%) có khả ức chế 1, 2, nguồn VKHX; có chủng Bacillus (chiếm 13,04%) có khả ức chế nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh Pseudomonas 40 - Khả sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng - Khả phân giải lân - Khả ức chế nấm, vi khuẩn gây bệnh vùng rễ - 40/40 chủng Pseudomonas (chiếm 100%) có khả sinh chất kích thích sinh trưởng; nhiên hàm lượng IAA hình thành khơng cao; hàm lượng IAA hình thành đạt từ 3,58 - 73,55 µg/ml - 8/40 chủng Pseudomonas (chiếm 20%) có khả phân giải phốt phát canxi; đường kính vịng phân giải đạt 3,0 - 14 mm Trong có chủng có đường kính vịng phân giải đạt 14 12 mm - 5/40 chủng Pseudomonas (chiếm 12,5%) có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc (Rastonia solanacearum) 7/40 chủng Pseudomonas (chiếm 17,5%) có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh thối hành (Erunia) - 2/40 chủng Pseudomonas (chiếm 5%) có khả ức chế nấm Fusarium 7/40 chủng Pseudomonas (chiếm 17,5%) có khả ức chế nấm Aspergillus niger 4/40 chủng Pseudomonas (chiếm 10%) có khả ức chế nấm Macrophomia Nhóm vi sinh vật TT Xạ khuẩn Tổng số Số lượng 34 Chỉ tiêu đánh giá Kết đánh giá - Khả phân giải xenllulo - Khả ức chế nấm, vi khuẩn gây bệnh vùng rễ trồng - Khả phân giải phốt phát khó tan - Khả chịu nhiệt O 60 C - 34/34 chủng xạ khuẩn (chiếm 100%) có khả phân giải xenlulo với đường kính vịng phân giải từ 1,0-5,2 cm Trong có 16 chủng xạ khuẩn (chiếm 47,06%) có đường kính vịng phân giải xenlulo 3,0 cm - 5/34 chủng xạ khuẩn (chiếm 14,71%) có khả phân giải phốt phát canxi Tuy nhiên khả phân giải phốt phát canxi chủng xạ khuẩn lưu giữ khơng cao, đường kính vịng phân giải đạt 0,5-0,8 cm - chủng xạ khuẩn (chiếm 26,47%) có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc Trong có chủng có đường kính vịng ức chế 2,1 cm - 23/34 chủng xạ khuẩn (chiếm 67,65%) có khả chịu nhiệt (sinh trưởng, phát triển điều kiện nhiệt độ 60OC) 183 Phân loại nguồn gen Nguồn gen vi sinh vật có phân loại chủ yếu dựa khóa phân loại (đặc điểm tế bào, khuNn lạc, đặc điểm sinh hóa nguồn gốc phân lập); kết phân loại mức độ sơ khởi ban đầu, chưa xác Để đảm bảo tính xác nguồn gen vi sinh vật, đề án tiến hành phân loại nguồn gen vi sinh vật kỹ thuật Kết phân loại nguồn gen vi sinh vật trình bày bảng Bảng Kết phân loại nguồn gen vi sinh vật STT Phương pháp phân loại Khóa phân loại (đặc điểm tế bào, khuẩn lạc, nguồn gốc ) Máy định danh vi khuẩn, nấm (BIOLOG) 16S ARN riboxom Phân loại vi sinh vật công việc cần nhiều kinh phí thời gian Để có đủ sở khoa học cho việc khai thác sử dụng nguồn gen vi sinh vật phục vụ sản xuất, thời Tư liệu thơng tin Tư liệu hóa nguồn gen vi sinh vật nội dung quan trọng bảo tồn quỹ gen vi sinh vật Cơ sở liệu nguồn gen vi sinh vật lưu giữ lập lý lịch theo mẫu quy định lưu giữ máy tính Khai thác sử dụng nguồn gen Để khuyến cáo cho đơn vị sử dụng nguồn gen, đề án tiến hành nghiên cứu điều kiện sinh trưởng phát triển Số lượng chủng vi sinh vật phân loại giai đoạn 2006-2010 49 45 gian tới đề án phải có nhiệm vụ phân loại tồn nguồn gen vi sinh vật có tiềm sử dụng đánh giá ảnh hưởng trồng; từ đề xuất giới thiệu nguồn gen vi sinh vật có tiềm cho sản xuất nông nghiệp Từ nguồn gen vi sinh vật bảo quản quỹ gen vi sinh vật trồng trọt, đề án kết hợp với đề tài, dự án nghiên cứu ứng dụng chủng vi sinh vật có hoạt tính cao cho sản xuất phân bón vi sinh vật đơn vị nghiên cứu triển khai Viện (xưởng sản xuất thử nghiệm vi sinh vật, sở Khoa học Công nghệ Đắk Lắk, công ty cổ phần Thiên sinh, Công ty Sản xuất Thương mại Thiên Phúc, công ty trách nhiệm hữu hạn Hữu Cơ, Viện Bảo vệ thực vật, v.v ); đồng thời quỹ gen vi sinh vật trồng trọt nguồn cung cấp vật liệu khởi đầu cho nghiên cứu sinh viên luận văn thực tập (trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Bách Khoa, Đại học Nông nghiệp Hà Nội, v.v ) N hiều sản phNm khoa học công nhận tiến kỹ thuật (phân bón vi sinh vật N itragin, Azogin, phân lân vi sinh, thuốc diệt chuột MIROCA, phân hữu vi sinh vật, phân bón vi sinh vật chức năng) sử dụng rộng rãi nhiều địa phương nước, đề án Quỹ gen vi sinh vật trồng trọt cung cấp chủng giống gốc Số lượng nguồn gen vi sinh vật khai thác sử dụng trình bày bảng Bảng Số lượng mục đích khai thác sử dụng nguồn gen vi sinh vật STT Mục đích sử dụng Số lượng Sản xuất phân bón vi sinh vật 15 Xử lý phế thải hữu rắn làm phân bón sinh học Sử dụng kiểm soát bệnh, dịch hại trồng Kiểm định 10 Giảng dạy, luận văn thực tập sinh viên trường đại học (Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Nông nghiệp Hà Nội) 10 Tổng cộng: 50 IV KÕT LUËN Bảo tồn quỹ gen vi sinh vật hoàn thành tốt nhiệm vụ đặt ra; đáp ứng mục tiêu đánh giá, lưu giữ, bảo tồn, phát triển, khai thác sử dụng có hiệu nguồn gen vi sinh vật trồng trọt phục vụ phát triển nông nghiệp bền vững Cụ thể sau: Lưu giữ, bảo quản thường xuyên 673 nguồn gen vi sinh vật đảm bảo độ sống sót hoạt tính sinh học Thu thập phân lập làm giàu thêm cho gen vi sinh vật trồng trọt 49 nguồn gen vi sinh vật có khả cố định nitơ cộng sinh, cố định nitơ tự do, phân giải xenlulo, phân giải kitin, kích thích sinh trưởng thực vật, sinh polysacharit, phân giải tinh bột, ức chế vi khuNn - nấm gây bệnh héo xanh chịu nhiệt Đánh giá xác định mức độ đa hoạt tính sinh học 183 nguồn gen vi sinh vật lưu giữ; phát 48,09% nguồn gen vi sinh vật có đa hoạt tính sinh học Điều có ý nghĩa sản xuất nơng nghiệp Đã tiến hành phân loại đến loài 49 nguồn gen vi sinh vật dựa theo khóa phân loại, BIOLOG giải trình tự gen 16S ARN riboxom Cơng tác tư liệu hóa nguồn gen tiếp tục hồn thiện cập nhật thơng tin theo mẫu quy định Quỹ gen vi sinh vật trồng trọt nguồn vật liệu khởi đầu cho công tác nghiên cứu, triển khai 50 nguồn gen vi sinh vật giới thiệu cho sản xuất phân bón chế phNm vi sinh vật; phục vụ phát triển nông-lâm nghiệp bền vững TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thu Hà CTV 2005 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp bảo quản thích hợp cho số chủng vi sinh vật, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, trang 94-98 Nguyên Ngọc Quyên CTV 1999 Quỹ gen vi sinh vật nơng nghiệp, Tạp chí ơng nghiệp công nghiệp thực ph m, 451, trang 29-30 Nguyễn Ngọc Quyên CTV 2002 Kết hoạt động đề án lưu giữ nguồn gen vi sinh vật nông nghiệp, Kết bảo tồn tài nguyên di truyền nông nghiệp, Nhà xuất Nông nghiệp, trang 182-188 Phạm Văn Toản CTV 2005 Lưu giữ, bảo tồn nguồn gen vi sinh vật nông nghiệp, Báo cáo hội thảo công tác thu thập, bảo tồn khai thác sử dụng nguồn gen vi sinh vật nông nghiệp, Hà ội 21/12/2005 Khursheed Ahmad Malik 1991 Maintenance of Microorganisms by simple methods Maintenance of Microorganisms 2nd Edn ISB 012-410351-0, pp 121-132 Peter H.A.Sneath, Nicholas S.Mair, John G Holt 1989 Bergey’s manual of systematic bacteriology TCVN 6167:1996 Phân bón vi sinh vật phân giải hợp chất photphat khó tan TCVN 6168:2002 Chế phNm vi sinh vật phân giải xenlulo 9 TCVN 4884:2005 Vi sinh vật thực phNm thức ăn chăn nuôi Phương pháp định lượng vi sinh vật đĩa thạch Kỹ thuật đếm khuNn lạc 30oC 10 10 TCN 299:97 Phân bón vi sinh vật cố định nitơ - Phương pháp xác định hoạt tính 11 10 TCN 714:2006 Vi sinh vật - Phương pháp đánh giá hoạt tính đối kháng vi khuNn gây bệnh héo xanh trồng cạn Rastonia solanacearum Smith 12 10 TCN 867:2006 Vi sinh vật - Phương pháp đánh giá hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ trồng cạn Người phản biện: TS Hồ Quang Đức ... trình thống kê IRRISTAT III KếT QUả Và THảO LUậN Bo qun nguồn gen vi sinh vật Quỹ gen vi sinh vật nông nghiệp lưu giữ 673 chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh vật bảo quản định kỳ cấy chuyển sau... sinh vật có tiềm sử dụng đánh giá ảnh hưởng trồng; từ đề xuất giới thiệu nguồn gen vi sinh vật có tiềm cho sản xuất nông nghiệp Từ nguồn gen vi sinh vật bảo quản quỹ gen vi sinh vật trồng trọt, ... sau: Lưu giữ, bảo quản thường xuyên 673 nguồn gen vi sinh vật đảm bảo độ sống sót hoạt tính sinh học Thu thập phân lập làm giàu thêm cho gen vi sinh vật trồng trọt 49 nguồn gen vi sinh vật có khả