Nghiên cứu khả năng cắt mạch chitosan bằng hydroperoxit kết hợp với sóng viba

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CẮT MẠCH CHITOSAN BẰNG HYDROPEROXIT KẾT HỢP VỚI SÓNG VIBA Giảng viên hướng dẫn: TS Đặng Trung Thành Sinh viên thực hiện: Đinh Thị Yến Nhi Mã số sinh viên: 58139024 Khánh Hòa, tháng 07/ 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CẮT MẠCH CHITOSAN BẰNG HYDROPEROXIT KẾT HỢP VỚI SÓNG VIBA GVHD: TS Đặng Trung Thành SVTH : Đinh Thị Yến Nhi MSSV: 58139024 Khánh Hịa, tháng 07/ 2020 ii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan kết đề tài: “Nghiên cứu khả cắt mạch Chitosan hydroperoxit kết hợp với sóng viba” cơng trình nghiên cứu cá nhân chưa công bố cơng trình khoa học khác thời điểm Khánh Hòa, tháng 07 năm 2020 Sinh viên thực Đinh Thị Yến Nhi i LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu quý thầy cô trường Đại học Nha Trang giúp đỡ tận tình truyền đạt cho kiến thức năm học qua Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy TS Đặng Trung Thành người định hướng truyền đạt kinh nghiệm cho tơi, giáo viên hướng dẫn thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô ThS Nguyễn Thị Thanh Hải giúp đỡ hướng dẫn nhiều q trình tơi thực đề tài nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cán quản lý Phịng thí nghiệm Công nghệ chế biến Kiểm nghiệm vi sinh tạo điều kiện thuận lợi hỗ trợ cho tơi thực tập phịng thí nghiệm Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ bạn bè động viên tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, tháng 07 năm 2020 Sinh viên thực Đinh Thị Yến Nhi ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT .v DANH MỤC CÁC BẢNG .vi DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ vii LỜI MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chitosan 1.1.1 Cấu trúc hóa học Chitosan 1.1.2 Một số tính chất Chitosan 1.1.3 Ứng dụng Chitosan 1.2 Tổng quan chitosan phân tử lượng thấp 1.2.1 Một số ứng dụng COS .10 1.2.2 Một số phương pháp sản xuất chitosan phân tử lượng thấp 11 1.2.3 Nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp Việt Nam .12 1.3 Tổng quan sóng viba 13 1.3.1 Nguyên lý hoạt động lò vi sóng 13 1.3.2 Tính chất, nguồn gốc chế tác động vi sóng .14 1.3.3 Ứng dụng vi sóng cơng nghệ 15 1.4 Tổng quan Escherichia coli .17 1.5 Cơ chế cắt mạch chitosan yếu tố ảnh hưởng đến khả cắt mạch chitosan hydroperoxit 18 1.5.1 Cơ chế cắt mạch H2O2 sở khoa học phương pháp .18 1.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả thủy phân chitosan 20 iii 1.6 Cơ chế kháng khuẩn yếu tố ảnh hưởng đến khả kháng khuẩn chitosan 21 1.6.1 Cơ chế kháng khuẩn chitosan 21 1.6.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả kháng khuẩn chitosan 22 1.6.3 Một số nghiên cứu tính kháng khuẩn chitosan phân tử lượng thấp 25 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 2.1 Vật liệu nghiên cứu .27 2.2 Máy móc thiết bị sử dụng .28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 28 2.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ H2O2, thời gian vi sóng thời gian nghỉ lần vi sóng đến phản ứng cắt mạch chitosan .30 2.4 Phương pháp phân tích 41 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Xác định chế độ cắt mạch chitosan hydroperoxit 42 3.1.1 Xác định nồng độ H2O2 thích hợp thủy phân cắt mạch chitosan 42 3.1.2 Xác định thời gian vi sóng thích hợp thủy phân cắt mạch chitosan .43 3.1.3 Xác định thời gian nghỉ lần vi sóng thích hợp thủy phân cắt mạch chitosan .45 3.2 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chitosan chitosan phân tử lượng thấp Escherichia coli .47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .50 TÀI LIỆU THAM KHẢO .51 PHỤ LỤC 57 iv DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT STT Ký hiệu viết tắt Diễn giải Da Khối lượng phân tử đơn vị Dalton DD Độ deacetyl COS Chitosan oligosaccharide MW Khối lượng phân tử LMWC Chitosan trọng lượng phân tử thấp CTS Chitosan PTLT Phân tử lượng thấp VSV Vi sinh vật GlcN Glucosamine 10 GlcNAc N- acetylglucosamine v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lượng chitin, canxi carbonate số loài sinh vật biển chủ yếu Bảng 1.2 Thành phần chitin vỏ côn trùng .4 Bảng 1.3 Các dung dịch acid thường sử dụng để hòa tan chitosan .5 Bảng 1.4 Bảng phân chia xạ sóng điện từ/ánh sáng 13 vi DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo Chitin Chitosan Hình 1.2 Cơng thức hóa học chung Chitin Chitosan Hình 1.3 Ngun lý hoạt động lị vi sóng 14 Hình 1.4 Minh họa chế cắt mạch chitosan H2O2 (a) trình phá vỡ cấu trúc kết tinh, (b) trình phân cắt phần không kết tinh 19 Hình 1.5 Ảnh hưởng nồng độ H2O2 đến Mw chitosan 20 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 29 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ H2O2 thích hợp 31 Hình Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian vi sóng thích hợp 33 Hình Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian nghỉ lần vi sóng thích hợp .35 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát khảo sát khả kháng khuẩn chitosan chitosan phân tử lượng thấp 37 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả kháng khuẩn chitosan chitosan phân tử lượng thấp 37 Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ H2O2 đến khối lượng phân tử chitosan (kDa) 42 Hình 3.2 Ảnh hưởng thời gian vi sóng đến khối lượng phân tử chitosan (kDa) 44 Hình 3.3 Ảnh hưởng thời gian nghỉ lần vi sóng đến khối lượng phân tử chitosan (kDa) 45 Hình 3.4 Quy trình sản xuất chitosan PTLT 46 Hình 3.5 Biểu đồ so sánh khả kháng khuẩn chitosan nguyên liệu chitosan phân tử lượng thấp với khối lượng: Mw= 676,93 kDa; Mw= 21,92 kDa; Mw= 35,76 kDa; Mw = 114,55 kDa 48 vii LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam nằm bên bờ Tây Biển Đơng, biển lớn Thái Bình Dương, có diện tích khoảng 3.448.000 km2, có bờ biển dài 3260 km Vùng nội thủy lãnh hải rộng 226.000 km2, vùng biển đặc quyền kinh tế rộng triệu km2 với 4000 hòa đào, tạo nên 12 vịnh, đầm phá với tổng diện tích 1160 km2 che chắn tốt dễ trú đậu tàu thuyền Năm 2019, tốc độ tăng giá trị sản xuất thủy sản đạt 6,25% so với năm 2018, tổng sản lượng đạt khoảng 8,15 triệu tấn, tăng 4,9% sản lượng khai thác đạt 3,77 triệu tấn, tăng 4,5%, nuôi trồng đạt 4,38 triệu tấn, tăng 5,2% Kim ngạch xuất ước đạt 8,6 tỷ USD Diện tích ni tơn đạt 720 nghìn ha, sản lượng tôm nước lợ ước đạt 750 nghin 98,3% so với năm 2018, tơm sú ước đạt 270.000 tấn, tôm chấn trắng đạt 480.000 tấn.[55] Hiện ngành chế biển thủy sản mặt hàng sản xuất xuất cịn dạng thơ, khoảng 70% xuất dạng nguyên liệu, sơ chế, bán thành phẩm tươi/ sống/ đông lạnh Các sản phẩm giá trị gia tăng từ tơm cịn ít, chiếm khoảng 30%[55] Bên cạnh trình sản xuất sản phẩm thủy sản tạo nguồn phế liệu tương đối lớn, chiếm 40 – 70% khối lượng nguyên liệu Nguồn phế liệu thải ngày lại vấn đề quan tâm, khơng có biện pháp xử lý thích hợp gây nhiễm mơi trường nghiêm trọng Vì u cầu xử lý phế liệu thủy sản đông lạnh mà chủ yếu vỏ tôm, cua, ghẹ ngày trở nên cấp bách Ở Việt Nam, phế liệu tôm chủ yếu dùng để sản xuất thức ăn gia súc, chitin, chitosan thô với chất lượng thấp để xuất Phần nhỏ dùng để sản xuất chitosan chất lượng cao, olygochitosan glucosamin Tuy nhiên, việc ứng dụng chúng sống cịn nhiều hạn chế Ngun nhân chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu lĩnh vực cơng bố, chitosan có trọng lượng phân tử lớn, khơng tan nước nên có nhiều hạn chế cho việc ứng dụng Để cải thiện khả hoà tan hoạt tính sinh học chitosan, người ta sản xuất loại chitosan phân tử lượng thấp.[16] Oligochitosan sản xuất từ chitosan thơng qua q trình cắt mạch chitosan cách sử dụng enzyme khử hóa chất hóa học sử dụng acid như: HCl, H2SO4 CH3COOH Ngồi ra, Q trình khử polymer chitosan thực với có mặt chất oxy hóa như: O3, NaNO2, H2O2 Trong thuốc  Chuẩn bị chủng vi khuẩn & Pha hỗn dịch vi khuẩn - Mỗi chủng vi khuẩn thử nghiệm trước ngày cần cấy vào mơi trường thạch khơng có chất ức chế (thạch dinh dưỡng, thạch máu thạch não tim), để tạo khuẩn lạc riêng rẽ - Ủ đĩa thạch qua đêm 370C Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc hòa tan vào 2ml nước muối sinh lý vô trùng trộn máy trộn Vortex - Độ đục huyền dịch vi khuẩn so sánh với độ đục chuẩn 0,5 McFarland giấy trắng có kẻ vạch đen Lưu ý, cần phải trộn ống đục chuẩn trước dùng - Nếu huyền dịch vi khuẩn khơng có độ đục với độ đục chuẩn 0,5 McFarland, điều chỉnh độ đục cách cho thêm nước muối sinh lý cho thêm vi khuẩn - Pha loãng 100 lần huyền dịch có độ đục tương đương độ đục McFaland cách lấy 20µl huyền dịch cho vào 2ml nước muối sinh lý để huyền dịch nồng độ 106 vi khuẩn /ml - Ngồi chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn cách lấy khuẩn lạc từ đĩa thạch nuôi cấy qua đêm cho vào môi trường (canh thang Mueller-Hinton, canh thang não tim, canh thang trypton soy) Ủ 370C vi khuẩn mọc đục, sau điều chỉnh để có độ đục huyền dịch vi khuẩn phù hợp cho thử nghiệm Lưu ý: luôn phải làm song song thử nghiệm với chủng chuẩn Quốc tế để kiểm tra chất lượng qui trình  Láng vi khuẩn lên đĩa thạch - Sử dụng huyền dịch nồng độ 106 vi khuẩn/ml (trong vòng 15 phút) láng lên mặt thạch - Hút huyền dịch vi khuẩn thừa bỏ - Để khô mặt đĩa thạch cách đặt chúng vào tủ ấm 15 phút trước đặt kháng sinh  Đặt khoanh giấy kháng sinh 59 - Lấy khoanh giấy kháng sinh khỏi tủ lạnh tủ âm, không mở nắp, để nhiệt độ phòng khoảng để ổn định làm giảm nước tích tụ khoanh giấy kháng sinh - Khoanh giấy kháng sinh đặt sớm tốt, vòng 15 phút sau láng vi khuẩn lên đĩa thạch - Sử dụng dụng cụ để đặt kháng sinh (Disk-dispensing apparatus), dụng cụ phải đóng nắp chặt, cất trở lại vào tủ lạnh làm ấm nhiệt độ phòng trước sử dụng - Có thể sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt khoanh giấy kháng sinh lên đĩa thạch dùng dụng cụ để đặt khoanh giấy kháng sinh nhẹ nhàng lên đĩa thạch - Không nên đặt khoanh giấy lên đĩa thạch 90mm - Không di chuyển khoanh giấy tiếp xúc với mặt thạch để tránh vòng ức chế chồng chéo lên gây sai số đo vòng ức chế - Để đĩa thạch nhiệt độ phòng 30 phút cho kháng sinh từ khoanh giấy khuếch tán mặt thạch - Lộn ngược đĩa thạch ủ ấm 370C vòng 18 - 20  Đọc phân tích kết - Sau ủ ấm lấy đĩa thạch khỏi tủ ấm Đo ghi lại kích thước vịng vơ khuẩn (dùng thước đo từ mặt sau đĩa không mở nắp) chủng chuẩn - So sánh kết chủng chuẩn với bảng chuẩn Nếu phù hợp nghĩa qui trình thực đúng, tiếp tục đọc kết vịng vơ khuẩn chủng thử nghiệm Nếu khơng phù hợp, qui trình thực chưa hóa chất sinh phẩm hỏng, khơng phù hợp, cần phải tiến hành lại - So sánh kích thước vịng vơ khuẩn chủng thử nghiệm với vịng ức chế chuẩn (bảng 1), sau ghi lại kết loại kháng sinh thử nghiệm là: nhạy cảm (S), trung bình (I) kháng (R) - Nếu có tượng khuẩn lạc mọc vịng ức chế xuất thay đổi tính kháng vi khuẩn huyền dịch vi khuẩn bị trộn lẫn vào với 60 Các khuẩn lạc nên nuôi cấy, phân lập thử nghiệm lại tính nhạy cảm với kháng sinh 1.3 Phương pháp xác định độ ẩm theo TCVN 3700: 1990 Cốc sấy sấy khô nhiệt độ 1050C khoảng 16 đến khối lượng không đổi, sau đặt vào bình hút ẩm để làm nguội Cân cốc để xác định khối lượng cốc sấy W1 Mẫu sấy cho vào cốc ta cân khối lượng W2 Sấy mẫu cốc 1050C khoảng 16 đến khối lượng khơng đổi, sau lấy mẫu cốc cho vào bình hút ẩm để làm nguội Cân mẫu cốc xác định khối lượng W3 Tất khối lượng tính đơn vị gram Hàm lượng ẩm tính theo cơng thức: % Hàm lượng ẩm = (w2 −w3 ) (w2 −w1 ) *100% 61 PHỤ LỤC KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Bảng PL2.1 Ảnh hưởng nồng độ H2O2 đến KLPT chitosan Nồng độ H2O2 (%) KLPT chitosan (KDa) 606,8a ± 0,27 114,43b ± 0,66 1,5 69,83c ± 1,21 38,6d ± 0,47 2,5 37,76de ± 0,99 36,44e ± 0,58 Các giá trị bảng có ký tự giống khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p