NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  BÙI THỊ YẾN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  Người thực hiện: Bùi Thị Yến NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa : QH2015.Y Người hướng dẫn : PGS TS Đinh Đoàn Long ThS Phạm Thị Hồng Nhung Hà Nội – 2020 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, tơi may mắn nhận nhiều giúp đỡ quý báu vật chất, tinh thần thầy cô, bạn bè Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ kính trọng lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đinh Đoàn Long, ThS Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người trực tiếp hướng dẫn tơi, dạy tận tình suốt q trình thực nghiên cứu hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn Đỗ Thị Lệ Hằng, bạn Đỗ Hạnh Nguyên giúp đỡ, hỗ trợ tơi thực hành thí nghiệm Các thầy cô, bạn không trang bị cho kinh nghiệm kỹ chun mơn mà cịn truyền cho tơi tình u, lịng nhiệt huyết với nghiên cứu ln sẵn sàng giúp đỡ tơi gặp khó khăn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Y Dược học sở hết lòng quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi thực nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn cán Viện dược liệu - Bộ Y tế khơng quản ngại khó khăn thu thập cung cấp mẫu vật giúp đỡ thực đề tài cách thuận lợi Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, toàn thể thầy cô giáo Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội cho kiến thức quý báu trình học tập nhà trường Chúng trân trọng cảm ơn tài trợ kinh phí Bộ Khoa học Cơng nghệ Việt Nam cho đề tài mã số NVQG-2018/02 PGS.TS Đinh Đoàn Long chủ trì để thực nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn yêu thương đến gia đình, người thân bạn bè, người bên cổ vũ, động viên tạo điều kiện giúp đỡ thời gian học tập thực đề tài khóa luận Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2020 Tác giả Bùi Thị Yến DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT bp Cặp bazơ (base pair) DNA Deoxyribo Nucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide 5’ Triphosphate Genbank Ngân hàng liệu gen quốc tế H.helix Hedera helix L (Thường xuân) H.nepalensis Hedera nepalensis K.Koch (Dây thường xuân) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) ITS Vùng đệm mã (Internal transcribed spacer) Kit Thermo GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) ML Maximum Likelihood NCBI Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (National Center for Biotechnology Information) NJ Neighbor - Joining OD Mật độ quang học (Optical Density) PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) RNA Ribo Nucleic Acid UPGMA Unweighted PairGroup with Method using arthmetic Averages DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thông tin mẫu thực vật nghiên cứu 19 Bảng 3.1 Nồng độ OD260/280 DNA tổng số của mẫu nghiên cứu 24 Bảng 3.2.Thành phần chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân dịng đoạn gen ITS 27 Bảng 3.3 Các haplotype nghiên cứu .30 Bảng 3.4 Khoảng cách di truyền (phía bên trái) số lượng nucleotide sai khác (phía bên phải) 11 nhóm mẫu nghiên cứu H.nepalen sis (AJ131238.1), H.helix (AM503887.2), H sinensis (GU054623.1) Kalopanax septemlobus (MH711151.1) 31 Bảng 3.5 Vị trí nucleotide sai khác so sánh trình tự BioEdit 32 Bảng 3.6 Các trình tự tham chiếu Genbank .35 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc tổng qt vùng rDNA thực vật Hình 1.2 Dạng phát sinh lồi biết rõ nguồn gốc .11 Hình 1.3 Cây Dây thường xuân H nepalensis 13 Hình 1.4 Phân bố địa lý H nepalensis miền Bắc nước ta 14 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 21 Hình 2.2 Hiển thị kết giải trình tự qua phần mềm BioEdit 23 Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số số mẫu gel agarose 1,2 % .24 Hình 3.2 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi phản ứng nhân dòng gen ITS 26 Hình 3.3 Tối ưu nồng độ DNA phản ứng nhân dòng gen ITS 26 Hình 3.4 Tối ưu nồng độ mồi phản ứng nhân dịng gen ITS 27 Hình 3.5 Kết PCR nhân dòng gen ITS số mẫu 28 Hình 3.6 Kết hiển thị giải trình tự mẫu H1 qua phần mềm BioEdit 28 Hình 3.7 Kết so sánh BLAST mẫu H4 H nepalensis (AJ131238) 29 Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại xây dựng phương pháp UPGMA dựa thị phân tử ITS .35 Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại xây dựng phương pháp NJ dựa thị phân tử ITS 36 Hình 3.10 Cây phát sinh chủng loại xây dựng phương pháp ML dựa thị phân tử ITS 36 Hình 4.1 Phân bố địa lý haplotype Dây thường xuân tỉnh Lào Cai, Hà Giang, Lạng Sơn 46 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Đa dạng phân loại sinh học 1.1.1 Khái niệm đa dạng sinh học .3 1.1.2 Đa dạng di truyền .3 1.1.3 Thực trạng đa dạng sinh học Việt Nam 1.1.4 Các phương pháp phân loại học .4 1.2 Cơng cụ phân tích đa dạng di truyền tiến hóa .6 1.2.1 Tổng quan thị DNA .6 1.2.2 Các kỹ thuật chị DNA 1.2.3 Vùng đệm mã (Internal Transcribed Spacer - ITS) 1.2.4 Các phương pháp xây dựng phát sinh chủng loại 10 1.3 Tổng quan Dây thường xuân (Hedera nepalensis K Koch) 13 1.3.1 Phân loại học loài Hedera nepalensis K Koch 13 1.3.2 Đặc điểm hình thái phân bố địa lý .14 1.3.3 Giá trị y học 14 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 2.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.1.1 Vật liệu thực vật .19 2.1.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 20 2.1.3 Thiết bị 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu .21 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 21 2.2.2 Nhân dịng đoạn gen đích kỹ thuật PCR 22 2.2.3 Giải trình tự 22 2.3.4 Xử lý số liệu phân tích kết 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 i 3.1 Tách chiết DNA tổng số 24 3.2 Kết nhân dòng đoạn gen ITS phản ứng PCR 25 3.2.1 Kết phản ứng tối ưu 25 3.2.2 Kết nhân dòng gen ITS từ mẫu thực vật 28 3.3 Giải trình tự 28 3.4 Độ tương đồng trình tự gen ITS khuếch đại 29 3.5 Cây phát sinh chủng loại dựa vùng gen ITS 30 3.5.1 Lựa chọn mơ hình 30 3.5.2 Khoảng cách di truyền 30 3.5.3 Xây dựng chủng loại 35 CHƯƠNG BÀN LUẬN .37 4.1 Tách chiết DNA tổng số 37 4.2 Tối ưu quy trình nhân dịng gen ITS phản ứng PCR giải trình tự 38 4.3 Khoảng cách di truyền 40 4.5 So sánh phương pháp xây dựng phát sinh chủng loại 41 4.5.1 Phương pháp UPGMA 41 4.5.2 Phương pháp Neighbor- Joining 42 4.5.3 Phương pháp Maximum LikeLihood .42 4.6 Dự đoán bảo tồn chọn tạo giống 43 4.7 So sánh với phân tích hình thái học .44 4.8 Phân tích địa lý mẫu nghiên cứu .45 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 ii ĐẶT VẤN ĐỀ Trên giới nước ta xu hướng sử dụng dược liệu sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ thực vật ngày tăng cao Theo số liệu Tổ chức Y tế giới (WHO), khoảng 80% dân số nước phát triển có nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu liên quan đến y học cổ truyền [23] Trong gần 20 năm trở lại đây, ước tính có khoảng 40 - 50% thuốc đưa thị trường trực tiếp gián tiếp có nguồn gốc từ hợp chất thiên nhiên [25] Tại Mỹ, doanh số bán thực phẩm chức có nguồn gốc từ thực vật tăng 8,5%, đạt tổng doanh thu khoảng tỷ USD năm 2017 [51] Cây dược liệu coi kho tàng vô giá cung cấp hợp chất sinh học phục vụ nghiên cứu phát triển thuốc, thành phần thiếu ngành dược liệu, góp phần phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng, nâng cao đời sống phát triển kinh tế - xã hội [23] Đây lý ngày có nhiều lồi thuốc đầu tư nghiên cứu, mở rộng quy mô sản xuất để phát triển thành sản phẩm chất lượng đáp ứng cho thị trường [23] Họ Nhân Sâm (Araliaceae) thực vật cung cấp nhiều thuốc quý, dân gian sử dụng lâu đời Tuy nhiên, loài chi Hedera họ cịn biết đến Việt Nam Trong chi này, Thường xuân (Hedera helix) Dây thường xuân (Hedera nepalensis) hai loài nghiên cứu nhiều [19] Ở châu Âu, Thường xuân sử dụng từ lâu đời, sản phẩm tiếng khắp giới siro ho Prospan® Cơng ty Engelhard Arzneimitel GmbH&Co.KG (Cộng hòa Liên bang Đức) Ở Việt Nam, Thường xuân địa Dây thường xuân ghi nhận phân bố nhiều vùng núi cao miền Bắc hai lồi có hình thái dễ nhầm lẫn Một số nghiên cứu dược lý ghi nhận Dây thường xuân có nhiều tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, hạ đường huyết, giảm đau, kháng viêm…[32, 39, 43, 57] Mặc dù có tiềm dược lý vậy, song nghiên cứu Dây thường xuân Việt Nam hạn chế, đặc biệt nghiên cứu đa dạng di truyền Khai thác dược liệu q mức, khơng có định hướng kiểm sốt chặt chẽ đe dọa trực tiếp đến nguồn tài ngun thuốc nước ta Do đó, cơng tác bảo tồn đa dạng sinh học, nguồn gen quý mối quan tâm hàng đầu nhà quản lý Nhà nước Đánh giá mức độ đa dạng di truyền nguồn gen thuốc kết hợp với phân tích thành phần hóa học giống cho phép chọn lọc giống sản xuất hiệu hợp chất quan tâm Qua đó, thơng tin nguồn gen giúp đưa chiến lược bảo tồn phát triển thuốc tiềm cách hiệu bền vững Hiện nay, thị DNA trở thành công cụ hỗ trợ đắc lực cho nghiên cứu phân loại, phân tích đa dạng sinh học Nó giúp xác định khoảng cách di truyền đặc trưng cấp độ cá thể, quần thể phục vụ bảo tồn chọn giống [14, 26, 38] Vùng đệm mã (Internal Transcribed Spacer, viết tắt ITS) thị phân loại tốt thực vật Song ITS có phải thị tốt để đánh giá mức độ đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân Việt Nam hay không? Để tìm lời giải cho câu hỏi chúng tơi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân (Hedera nepalensis K Koch) Việt Nam dựa thị ITS” với hai mục tiêu: Xây dựng quy trình tối ưu nhân dịng vùng gen ITS Dây thường xuân Định danh khoa học mẫu Dây thường xuân thu thập Việt Nam thông qua xây dựng phát sinh loài dựa thị phân tử ITS Để thực mục tiêu nghiên cứu trên, tiến hành nội dung nghiên cứu sau: Tách chiết DNA tổng số 45 mẫu Dây thường xuân Tối ưu quy trình nhân dịng gen ITS với cặp mồi đặc hiệu Nhân dòng gen ITS kỹ thuật PCR giải trình tự gen Phân tích số liệu thu xây dựng phát sinh chủng loại việc đột biến có ý nghĩa phát sinh lồi hay khơng hay đặc điểm mơi trường sống xuất đột biến để thích nghi So sánh ba phát sinh chủng loại sử dụng ba phương pháp khác cho thấy: Cây chạy phương pháp UPGMA cho dạng với độ tin cậy nhánh cao so với phương pháp lại NJ ML DNA chứa tế bào chất nhân, tế bào chất DNA lại gồm DNA lục lạp DNA ty thể Tất thị gen nhân, thị gen lục lạp hay ty thể có hiệu nghiên cứu đa dạng di truyền phân loại tùy cấp độ Hệ gen lục lạp có mức đột biến tính bảo thủ thấp so với hệ gen nhân [14] Trong gen ty thể có mức độ đột biến thấp hệ gen nhân có tỷ lệ thay nucleotide nhanh nhiều lần [28] Chính mà thị gen nhân nói chung hay thị gen ITS nói riêng, hữu ích phân biệt lồi gần gũi chí phân biệt thứ lồi Trong nghiên cứu này, dựa thị ITS, hai loài H helix H nepalensis phân tách cách rõ ràng, có tới 09/600 vị trí nucleotide sai khác chiếm 1,5%, chứng tỏ vùng gen ITS biến đổi nhanh Trong phân tích gen matK mẫu Dây thường xuân thu thập Việt Nam tác giả Đỗ Hạnh Nguyên, cho 02/792 vị trí sai khác lồi Chỉ thị gen ITS phân tách tốt hai loài H nepalensis H helix tương tự với kết Vargas cộng (1999) Theo đó, phát sinh chủng loại mà tác giả cơng bố chia làm nhánh chính: (i) Nhánh loài lưỡng bội (ii) Nhánh loài đa bội Trong nhánh loài lưỡng bội bao gồm 06 loài, có chứa H nepalensis H.helix Hai lồi phân tách rõ ràng với với số tin cậy cao (97% 91%) [56] Trong H nepalensis H sinensis gần gũi hơn, số tách nhánh cịn mức gây tranh cãi Thơng qua nghiên cứu, chúng tơi nhận thấy vai trị phân loại thị ITS phân biệt loài chi với 4.6 Dự đoán bảo tồn chọn tạo giống Trong tiêu chuẩn hóa dược liệu, nhà chọn giống phải chọn nguồn gen đồng suất, chất lượng để đảm bảo chất lượng dược liệu theo GACP-WHO Sự đa dạng nguồn gen mức bất lợi cho việc chọn giống để tiêu chuẩn hóa thành phần hoạt chất ổn định Tuy nhiên, thực tiễn ni trồng với mục đích thu thập nguồn gen để bảo tồn, đồng mức lại không đáp ứng đủ đa dạng thành phần Hiện nay, với hỗ trợ phương pháp nghiên cứu kết hợp phân tích hình thái, thành phần hóa học thị DNA, việc tiêu chuẩn hóa quy trình chọn giống, nhân giống trồng trọt trở 43 nên thuận lợi với loài thuốc Thơng qua phân tích phát sinh chủng loại xây dựng dựa thị gen ITS, cho dự đoán định hướng để bảo tồn chọn tạo giống Theo nghiên cứu trước đây, Việt Nam xuất loài Dây thường xuân (H nepalensis) tỉnh miền núi phía Bắc Tuy nhiên, phạm vi nghiên cứu cho thấy khả tương đồng cao mẫu nghiên cứu với lồi khác H sinensis hay H.helix Phân loại hình thái cho biết có 04 mẫu thuộc H helix H3, HH, H48, H52 (haplotype N3, N8, N9) Ngoại trừ mẫu HH thu Vườn thực vật Hoa Nam, Trung Quốc làm đối chứng, mẫu H helix Việt Nam nhập trồng bị hoang dại hóa tự nhiên theo thời gian Theo kết phân loại nghiên cứu này, dựa vào thị ITS, có thêm 03 mẫu thuộc haplotype N3 (H9, H13, H14) tương đồng cao (100%) với H helix đối chứng Những mẫu nguồn gen quý để làm dược liệu dựa sở nhiều nghiên cứu tác dụng sản phẩm thuốc ho tiếng Prospan, Đức Như cần có đối chiếu lại tài liệu phân tích hình thái, đồng thời tiến hành nghiên cứu mặt hóa học để khẳng định tồn hoang dại H helix Việt Nam Tương tự, xuất haplotype N5, N6, N10 gần gũi với H sinensis cần nghiên cứu sâu để có định hướng bảo tồn H nepalensis vậy, dựa thị ITS, loài xuất haplotype (N1, N2, N4, N7, N11) chiếm tỉ lệ lớn Cần phân tích thành phần hóa học để biết H nepalensis có thành phần tương tự H helix hay khơng, thay hay khơng, có haplotype cho tỷ lệ hoạt chất cao nhất, từ có định hướng chuẩn hóa nguồn gen Dược liệu Chính vậy, nghiên cứu chúng tơi góp phần giúp phân loại sơ nguồn gen chi Hedera Việt Nam nói riêng, để có định hướng bảo tồn chọn tạo nguồn gen Dược liệu 4.7 So sánh với phân tích hình thái học Một lần khẳng định lại haplotype N1, N2, N4, N7, N11 thuộc loài H nepalensis; số mẫu thuộc haplotype N3 (HH, H52), haplotype N8, N9 thuộc loài H helix hồn tồn tương đồng với phân loại hình thái Riêng haplotype N5, N6, N10 lại có xu hướng tách nhánh sang lồi H sinensis; haplotype N3 có mẫu H9, H13, H14 tách sang nhánh H helix thay sơ nhận định H nepalensis phân tích hình thái học đặt dấu hỏi để tiếp tục tiến hành phân tích kỹ lưỡng mẫu Một luận điểm khác tin cậy mã hiệu Genbank AJ131238.1 H nepalensis lấy làm trình tự tham chiếu giống 44 100% với nhóm N1 tác giả Vargas cộng công bố năm 1999 sử dụng mẫu Dây thường xuân Lào Cai, Việt Nam [56] Về chứng phân tử phân tách loài H nepalensis H helix rõ ràng trước kể đến tranh cãi nhiều phân định hai loài H nepalensis H sinensis Trong nghiên cứu này, phát vị trí sai khác nucleotide loài 389 (C>A), 407 (G>A) 522 (A>C) thuộc vùng ITS2 Loài Dây thường xuân mô tả đặt tên theo hệ thống phân loại lưỡng phân lần tác giả K.Koch với tên khoa học Hedera nepalensis K.Koch vào năm 1853 Đến năm 1929, tác giả Wien gộp loài khác H sinensis vào loài H nepalensis, cho loài H nepalensis K.Koch tên đồng danh H sinensis Tuy nhiên gần Jun Wen nghiên cứu đặc điểm hình thái DNA chi Hedera giới (chỉ thị gen nhân – 2002; thị gen lục lạp – 2003) cho lồi Hedera nepalensis có thứ H.nepalensis var sinensis H.nepalensis var nepalensis [18, 19] Loài tham chiếu H sinensis (GU054623.1) tham khảo ngân hàng Genbank kết nghiên cứu Li & Wen 2013 [41] Vậy liệu nhóm mẫu chúng tơi có nằm trường hợp phân vân này? 4.8 Phân tích địa lý mẫu nghiên cứu Tỉnh Lào cai có tổng cộng 12/44 mẫu bao gồm 04 haplotype N1 (chiếm 58,3%), N3 (chiếm 25%), N8 (chiếm 8,35%), N9 (chiếm 8,35%) Tỉnh Hà Giang có 28/44 mẫu bao gồm 08 haplotype N1 (chiếm 50%), N2 (chiếm 17,7%), N4 (chiếm 10,7%), N5 (chiếm 10,7%), N7 (chiếm 7,1%), N11 (chiếm 3,8%) Tỉnh Lạng Sơn có 3/44 mẫu chứa 02 haplotype N6 (chiếm 66,7%), N10 (chiếm 33,3%) Đà lạt có 1/44 mẫu chứa haplotype N3 Hình 4.1 thể phân bố địa lý haplotype tỉnh miền Bắc nước ta Trong tỉnh thu thập mẫu nghiên cứu, hầu hết mẫu cho kết phân tích tương đồng cao với H helix thuộc Sa Pa, Lào Cai Tỉnh Hà Giang Lạng Sơn khơng có xuất lồi Do Sa Pa, Lào cai khu vực tiềm có chứa xuất H helix có đặc điểm mơi trường khí hậu thổ nhưỡng phù hợp cho lồi Trong Hà Giang trung tâm đa dạng H nepalensis chứa haplotype loài Lạng Sơn Đà Lạt có số mẫu thu thập nên chưa thể có nhận định cụ thể Tuy nhiên hai vùng vùng tiềm mẫu Lạng Sơn (H49, H50, H51) có trình tự tương đồng cao với H sinensis; 01 mẫu Đà Lạt phân loại tương đồng với H helix Do 45 khuyến cáo thu thập thêm mẫu khu vực để có nhìn tổng quan đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân hai tỉnh Lạng Sơn Đà Lạt Hình 4.1 Phân bố địa lý haplotype Dây thường xuân tỉnh Lào Cai, Hà Giang, Lạng Sơn Vị trí địa lý phân bố mẫu cho thấy đa dạng tiến hóa nguồn gen Dây thường xuân Theo đó, nhóm phân loại H nepalensis có phân bố chủ yếu Sa Pa, Lào Cai huyện tỉnh Hà Giang; nhóm H sinensis có Đồng Văn, Hà Giang Lộc Bình, Lạng Sơn; H helix bao gồm Sa Pa, Lào Cai Đà Lạt, Lâm Đồng Với số mẫu nghiên cứu tại, sơ nhận định có phân bố địa lý giống (cấp huyện) có xu hướng xếp lại thành nhóm Ví dụ huyện Hồng Su Phì có mẫu H4, H27, H28, H31 – H34, H38, H42 – H44 huyện Xí Mần có mẫu H29, H30 thuộc H nepalensis; huyện Lộc Bình, Lạng Sơn có H49, H50, H51 thuộc nhóm H sinensis Tuy nhiên, huyện có lồi khác Sa Pa, Lào Cai có chứa H nepalensis (H1, H2, H5, H6, H45 – H47) H helix (H3, H9, H13, H14, H48); Đồng Văn, Hà Giang có chứa H nepalensis (H18 – H26, H37, H40) H sinensis (H16, H17, H35) 46 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã xây dựng thành cơng quy trình nhân dịng vùng gen ITS với độ dài khoảng 858 bp mẫu Dây thường xuân thu thập Việt Nam Đã xây dựng thành công phát sinh chủng loại dựa thị ITS 45 mẫu Dây thường xuân Xác định 11 haplotype haplotype N1 chiếm tỷ lệ cao (46,7%), có trình tự tương đồng 100% với trình tự H.nepalensis (mã số AJ131238) cơng bố Genbank Trong đó, 32 mẫu thuộc loài Hedera nepalensis; 06 mẫu thuộc loài Hedera sinensis; 07 mẫu thuộc loài Hedera helix Kiến nghị Tiếp tục thu thập mẫu Dây thường xuân Việt Nam để đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen khắp nước Mở rộng phân tích thêm số thị phân tử khác GBSSI, RAPD, trnK, …hoặc kết hợp hai hay nhiều thị phân tích đồng thời để cung cấp thêm thơng tin quan hệ di truyền tiến hóa nguồn gen Dây thường xuân Nghiên cứu thêm thành phần hóa học, tác dụng dược lý mẫu để tìm kiếm nguồn gen thị cho giống sản xuất hoạt chất hàm lượng cao 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Nguyễn Tiến Bân (2003), Danh lục loài thực vật Việt Nam, Tập 2, Tr 1076 [2] Võ Văn Chi (1999), Cây cỏ có ích Việt Nam, Nhà xuất Giáo Dục Tập 1, Tr 711 [3] Võ Văn Chi (1999), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học [4] Nguyễn Anh Diệp, Ninh Trần, and Nguyễn Xuân Quỳnh (2007), Nguyên tắc phân loại sinh vật, NXB Khoa học Kỹ thuật [5] Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, Quyển [6] Đỗ Bích Huy (1993), Tài nguyên thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kĩ thuật [7] Đỗ Bích Huy (2004), "Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam (tập 1)", Nhà xuất Khoa học kĩ thuật Hà Nội [8] Đỗ Tất Lợi (1993), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học [9] Vũ Đức Lợi, Nguyễn Tiến Vững, and Lê Thị thu Hường (2017), Tài nguyên thuốc, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội [10] Đinh Đoàn Long and Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở di truyền học phân tử tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội [11] Phan Kế Long, Vũ Đình Duy, Phan Kế Lộc et al (2014), "Mối quan hệ di truyền mẫu Sâm thu Lai Châu sở phân tích trình tự nucleotide vùng matK ITS–rDNA", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 12(2) [12] Trần Văn Ơn (2004), Thực vật dược phân loại thực vật, NXB Y học [13] Đặng Ngọc Thanh and Trần Đức Lương (2018), "Thực trạng xu hướng phát triển phân loại học sinh vật", Khoa học & Công nghệ Việt Nam [14] Nguyễn Đức Thành (2014), "Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật", Tạp chí Sinh học, 36(3) [15] Nguyễn Thị Thu Thảo, "Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen dây thường xuân (Hedera nepalensis k koch) Việt Nam dựa thị GBSSI," Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học, Khoa Y Dược - Đại học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội, 2019 [16] Lê Sỹ Vinh (2014), Nhập môn Tin sinh học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội TIẾNG ANH [17] Ghulam Abbas, Hidayat Hussain, Ahmed Hamaed et al (2019), "The Management of Diabetes Mellitus-Imperative Role of Natural Products Against Dipeptidyl Peptidase-4, α-Glucosidase and Sodium-Dependent Glucose Co-Transporter (SGLT2)", Bioorganic chemistry, 86, pp.305 -315 [18] Jennifer Ackerfield and Jun Wen (2002), "A morphometric analysis of Hedera L.(the ivy genus, Araliaceae) and its taxonomic implications", Adansonia, 24(2), pp.197-212 [19] Jennifer Ackerfield and Jun Wen (2003), "Evolution of Hedera (the ivy genus, Araliaceae): insights from chloroplast DNA data", International Journal of Plant Sciences, 164(4), pp.593-602 [20] Bruce G Baldwin, Michael J Sanderson, J Mark Porter et al (1995), "The ITS region of nuclear ribosomal DNA: a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny", Annals of the Missouri botanical garden, pp 247277 [21] Danka Bošeľová, Jana Žiarovská, Lucia Hlavačková et al (2016), "Comparative analysis of different methods of Hedera helix DNA extraction and molecular evidence of the functionality in PCR", Acta Fytotechnica et Zootechnica, 19(4), pp.144-149 [22] Thomas D Bruns, Thomas J White, and John W Taylor (1991), "Fungal molecular systematics", Annual Review of Ecology and systematics, 22(1), pp 525-564 [23] Shi-Lin Chen, Hua Yu, Hong-Mei Luo et al (2016), "Conservation and sustainable use of medicinal plants: problems, progress, and prospects", Chinese medicine, 11(1), p.37 [24] J Hugo Cota-Sánchez, Kirsten Remarchuk, and Kumary Ubayasena (2006), "Ready-to-use DNA extracted with a CTAB method adapted for herbarium specimens and mucilaginous plant tissue", Plant Molecular Biology Reporter, 24(2), p.161 [25] Gordon M Cragg, David J Newman, and Kenneth M Snader (1999), "Natural products in drug discovery and development", Journal of natural products, 60(1), pp.1-29 [26] Rob DeSalle and Paul Goldstein (2019), "Review and Interpretation of Trends in DNA Barcoding", Frontiers in Ecology and Evolution, 7, p.302 [27] Torsten Eriksson, Malin S Hibbs, Anne D Yoder et al (2003), "The phylogeny of Rosoideae (Rosaceae) based on sequences of the internal transcribed spacers (ITS) of nuclear ribosomal DNA and the trnL/F region of chloroplast DNA", International Journal of Plant Sciences, 164(2), pp.197211 [28] Brandon S Gaut, "Molecular clocks and nucleotide substitution rates in higher plants," in Evolutionary biology, ed: Springer, 1998, pp 93-120 [29] Jayadri Sekhar Ghosh, Samik Bhattacharya, and Amita Pal (2017), "Molecular phylogeny of 21 tropical bamboo species reconstructed by integrating non-coding internal transcribed spacer (ITS1 and 2) sequences and their consensus secondary structure", Genetica, 145(3), pp.319-333 [30] D Grivet and RJ Petit (2002), "Phylogeography of the common ivy (Hedera sp.) in Europe: genetic differentiation through space and time", Molecular Ecology, 11(8), pp.1351-1362 [31] R Keith Hamby and Elizabeth A Zimmer, "Ribosomal RNA as a phylogenetic tool in plant systematics," in Molecular systematics of plants, ed: Springer, 1992, pp 50-91 [32] Ammara Rasheed Hammad Ismail, Ihsan-ul Haq, Laila Jafri, Nazif Ullah, Erum Dilshad, Moniba Sajid, Bushra Mirza (2017), "Five Indigenous Plants of Pakistan with Antinociceptive, Anti-Inflammatory, Antidepressant, and Anticoagulant Properties in Sprague Dawley Rats", Evid Based Complement Alternat Med , 2017 [33] David M Hillis and James J Bull (1993), "An empirical test of bootstrapping as a method for assessing confidence in phylogenetic analysis", Systematic biology, 42(2), pp.182-192 [34] Hammad Ismail, Ammara Rasheed, Ihsan-ul Haq et al (2017), "Five indigenous plants of Pakistan with Antinociceptive, anti-inflammatory, antidepressant, and anticoagulant properties in Sprague Dawley rats", Evidence-based Complementary and alternative medicine, 2017 [35] Laila Jafri, Samreen Saleem, Tamara P Kondrytuk et al (2016), "Hedera nepalensis K Koch: A Novel Source of Natural Cancer Chemopreventive and Anticancerous Compounds", Phytotherapy research, 30(3), pp.447-453 [36] Laila Jafri, Samreen Saleem, Nazif Ullah et al (2017), "In vitro assessment of antioxidant potential and determination of polyphenolic compounds of Hedera nepalensis K Koch", Arabian Journal of Chemistry, 10, pp.S3699S3706 [37] Krishna P Kollipara, Ram J Singh, and Theodore Hymowitz (1997), "Phylogenetic and genomic relationships in the genus Glycine Willd based on sequences from the ITS region of nuclear rDNA", Genome, 40(1), pp.5768 [38] W John Kress (2017), "Plant DNA barcodes: Applications today and in the future", Journal of systematics and evolution, 55(4), pp.291-307 [39] Laila Jafri, Samreen Saleem, Ihsan-ul-Haq et al (2017), "In vitro assessment of antioxidant potential and determination of polyphenolic compounds of Hedera nepalensis K Koch", Arabian Journal of Chemistry, 10(2) [40] Mingai Li, Jörg Wunder, Gaetano Bissoli et al (2008), "Development of COS genes as universally amplifiable markers for phylogenetic reconstructions of closely related plant species", Cladistics, 24(5) [41] Rong Li and Jun Wen (2013), "Phylogeny and biogeography of Dendropanax (Araliaceae), an amphi-Pacific disjunct genus between tropical/subtropical Asia and the Neotropics", Systematic Botany, 38(2) [42] Rong Li and Jun Wen (2016), "Phylogeny and diversification of Chinese Araliaceae based on nuclear and plastid DNA sequence data", Journal of Systematics and Evolution, 54(4) [43] T Li, H Pan, Y Feng et al (2015), "Bioactivity-guided isolation of anticancer constituents from Hedera nepalensis K Koch", South African Journal of Botany, 100 [44] Gitte Petersen and Ole Seberg (1996), "ITS regions highly conserved in cultivated barleys", Euphytica, 90(2) [45] Péter Poczai and Jaakko Hyvönen (2010), "Nuclear ribosomal spacer regions in plant phylogenetics: problems and prospects", Molecular biology reports, 37(4) [46] Qamar H, Rehman S, and Chauhan D (2019), "Current Status and Future Perspective for Research on Medicinal Plants with Anticancerous Activity and Minimum Cytotoxic Value", Curr Drug Targets, 20(12), pp.1227-1229 [47] Adam R Rivers, Kyle C Weber, Terrence G Gardner et al (2018), "ITSxpress: software to rapidly trim internally transcribed spacer sequences with quality scores for marker gene analysis", F1000Research, [48] Naruya Saitou and Masatoshi Nei (1987), "The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees", Molecular biology and evolution, 4(4) [49] Samreen Saleem, Laila Jafri, Ihsan ul Haq et al (2014), "Plants Fagonia cretica L and Hedera nepalensis K Koch contain natural compounds with potent dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) inhibitory activity", Journal of ethnopharmacology, 156 [50] Conrad L Schoch, Keith A Seifert, Sabine Huhndorf et al (2012), "Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi", Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(16) [51] Tyler Smith, Kimberly Kawa, Veronica Eckl et al (2018), "Herbal Supplement Sales in US Increase 8.5% in 2017, Topping $8 Billion Strongest sales growth in more than 15 years bolstered by continued popularity of Ayurvedic herbs and new formulations of botanicals with general health and nutrition benefits", HerbalGram, 119 [52] Peter HA Sneath and Robert R Sokal (1973), Numerical taxonomy The principles and practice of numerical classification [53] Y Sun, DZ Skinner, GH Liang et al (1994), "Phylogenetic analysis of Sorghum and related taxa using internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA", Theoretical and applied genetics, 89(1) [54] Virginia Valcárcel, Omar Fiz, and Pablo Vargas (2003), "Chloroplast and nuclear evidence for multiple origins of polyploids and diploids of Hedera (Araliaceae) in the Mediterranean basin", Molecular Phylogenetics and Evolution, 27(1) [55] Nong Van Duy, TRIEU LE NGOC, Nguyen Duy Chinh et al (2016), "A new variety of Panax (Araliaceae) from Lam Vien Plateau, Vietnam and its molecular evidence", Phytotaxa, 277(1) [56] Pablo Vargas, Hugh A McAllister, Cynthia Morton et al (1999), "Polyploid speciation inHedera (Araliaceae): Phylogenetic and biogeographic insights based on chromosome counts and ITS sequences", Plant Systematics and Evolution, 219(3-4) [57] Hammad Ismail Waleed Javed Hashmi, Furrukh Mehmood,Bushra Mirza (2018), "Neuroprotective, antidiabetic and antioxidant effect of Hedera nepalensis and lupeol against STZ + AlCl3 induced rats model", DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 26(2) [58] Jun Wen, Gregory M Plunkett, Anthony D Mitchell et al (2001), "The evolution of Araliaceae: a phylogenetic analysis based on ITS sequences of nuclear ribosomal DNA", Systematic Botany, 26(1) [59] Songzhi Xu, Dezhu Li, Jianwu Li et al (2015), "Evaluation of the DNA barcodes in Dendrobium (Orchidaceae) from mainland Asia", PloS one, 10(1) [60] Ziheng Yang (2007), "PAML 4: phylogenetic analysis by maximum likelihood", Molecular biology and evolution, 24(8) TRANG WEB [61] http://www.botanicayjardines.com/hedera-nepalensis/ Ngày truy cập ngày 20/05/2020 PHỤ LỤC Quy trình tách chiết DNA tổng số theo khuyến cáo kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, M) ã Thờm 350 àL Lysis Buffer A vào ống 1,5 mL có sẵn mẫu thực vật ( ≤100 mg mẫu tươi ≤20 mg mẫu khô nghiền sử dụng nito lỏng cối chày sứ) • Trộn Vortex 10-20 giõy ã Thờm 50 àL Lysis Buffer B v 20 µL RNase A Chuyển tồn dung dịch vào ống 1,5 ml, vortex tốc độ tối đa để trộn mẫu • Ủ 20 phút 65oC khối n nhit kt hp lc ã Thờm 130 àl dung dịch Precipitation Solution, đảo ngược ống lần ủ phút đá • Ly tâm hỗn hợp phút 14.000 vịng/phút • Chuyển dịch vào ống 1,5 mL (khơng cung cấp) • Thêm 400 µL Plant gDNA Binding Solution 400 µL ethanol 96% Trộn mẫu • Chuyển nửa dung dịch sang Spin column Ly tâm phút 8.000 vòng/phút Loại bỏ dung dịch thu ống sau ly tâm, giữ lại collection tube • Lặp lại bước với nửa dung dịch cịn lại • Thêm 0,5 mL Wash Buffer I vào cột • Ly tâm phút 10.000 vòng/phút Bỏ dịch thu được, sử dụng lại collection tube • Thêm 0,5 mL Wash Buffer II vào cột • Ly tâm phút 15.000 vòng/phút Bỏ dịch thu được, sử dụng lại collection tube • Ly tâm phút 15.000 vòng/phút Bỏ dịch thu collection tube • Chuyển Spin Column vào ống 1,5 ml (khơng cung cấp) • Thêm 100 µl Elution Buffer Ủ 10 phút nhiệt độ phịng Ly tâm phút 10.000 vịng/phút • Lặp lại bước lần với 50 µl Elution Buffer PHỤ LỤC So sánh trình tự Nucleotide nhóm trình tự tham chiếu Genbank 10 20 30 40 50 60 70 | | | | | | | | | | | | | | N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 AJ131238.1 Hedera nepalensis AM503887.2 Hedera helix GU054623.1 Hedera sinensis MH711151.1 Kalopanax septemlob CA N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 AJ131238.1 Hedera nepalensis AM503887.2 Hedera helix GU054623.1 Hedera sinensis MH711151.1 Kalopanax septemlob T N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 C CA GCA GA A C GA C C C GT C C C C C GA A CA T GT T A C CA TA T C C T C C - GGGT GA G G GA C G G G G G GA GC GCAA GT T C C T C CAA G 80 90 100 110 120 130 140 | | | | | | | | | | | | | | CA C G GA A C C TA C C T GGT C G G G GA T T C GC C C C T T T T T T C GGGT GGT C C T C GC C T GA A CAA C GA C A A C C C C C GGC GC GA A A A G T G 150 160 170 180 190 200 210 | | | | | | | | | | | | | | GC CAA G GA A A T CAAA C T GA A C T GA A C GC T T C T CA C C C GT T T GC GGGC T A T T GGCA A GA GGC GT C T T T C T AAA T C N10 N11 AJ131238.1 Hedera nepalensis AM503887.2 Hedera helix GU054623.1 Hedera sinensis MH711151.1 Kalopanax septemlob N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 AJ131238.1 Hedera nepalensis AM503887.2 Hedera helix GU054623.1 Hedera sinensis MH711151.1 Kalopanax septemlob A G C T C T T G A 220 230 240 250 260 270 280 | | | | | | | | | | | | | | CAAA C GA C T C T C GGCAA C G GA T A T C T C GGC T T C T C GCA T C GA T GA A GA A C GT A GC GA A A T GC GA T A C T T G 290 300 310 320 330 340 350 | | | | | | | | | | | | | | N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 AJ131238.1 Hedera nepalensis AM503887.2 Hedera helix GU054623.1 Hedera sinensis MH711151.1 Kalopanax septemlob GT GT GA A T T GCA GA A T C C C GT GA A C CA T C GA GT C T T T GA A C GCAA GT T GC GC C C GA A GC CA T T A GGC T GA 360 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | | | N1 N2 G G G CA C G T C T G C C T G G G C G T CA C G CA T GA C G T C G C C C C C CA A C C T C G C T C T CA C T C G T G G GA G T T G T T G C N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 AJ131238.1 Hedera nepalensis AM503887.2 Hedera helix GU054623.1 Hedera sinensis MH711151.1 Kalopanax septemlob N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 AJ131238.1 Hedera nepalensis AM503887.2 Hedera helix GU054623.1 Hedera sinensis MH711151.1 Kalopanax septemlob G GA C T G A A A G C A C A A A A A C G 430 440 450 460 470 480 490 | | | | | | | | | | | | | | GGGGC G GA T A C T GGC C T C C C GT GC T C T CA T C C GTAC T C T T T G GGT T GGC C CAAA T GT C GA GT C C T T GGC GA C G GA C 500 510 520 530 540 550 560 | | | | | | | | | | | | | | N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 AJ131238.1 Hedera nepalensis AM503887.2 Hedera helix GT CA C GA CAA GT GGT GGT T GT AAAAA GC C C T A C C C C C C C C T T C T C C T GT C GT GC GGT C C GGC GC GT C T GC C GA CA A AG T T AG AG T AG GA A C T GU054623.1 Hedera sinensis C MH711151.1 Kalopanax septemlob T T A C T A T A G 570 580 590 | | | | | | | N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 AJ131238.1 Hedera nepalensis AM503887.2 Hedera helix GU054623.1 Hedera sinensis MH711151.1 Kalopanax septemlob C T C C GT GA C C C T GT T GT GC C GT T C CT G G G G CAA T G C GC GCA C T C C GA ... Ladder (Thermo Scientific) 2.1.3 Thi? ??t bị Các trang thi? ??t bị dụng cụ thí nghiệm tiến hành Phịng thí nghiệm môn Y Dược học sở - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Các thi? ??t bị bao gồm: Cân phân tích,... chống angiogen Chúng sử dụng rộng rãi tính có sẵn, giá phải tác dụng phụ tối thi? ??u [46] Tác dụng chống oxi hóa Nghiên cứu thi? ??t kế để xác định hợp chất polyphenolic (có tác dụng chống oxy hóa) phân... (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl) ABTS (2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) Trong đó, môi trường lipid đánh giá khả chống oxy hóa đánh giá số hóa (TBARS – Thiobarbituric Acid Reactive Substances) Cơ