Luan van thac si Hoa hoc

Treân cô sôû Hesperidin, moät flavonoid ñöôïc chieát taùch töø voû quít, chuùng toâi tieán haønh toång hôïp Hesperetin.Theo caùc taøi lieäu, Hesperidin vaø Hesperetin laø nhöõng hôïp cha[r]

Luận văn thạc só

MỞ ĐẦU

Từ thời xa xưa, người biết sử dụng dược thảo để chữa bệnh hiệu Cho đến nay, nhà khoa học xác định phần lớn cấu trúc hóa học hợp chất có cỏ có hoạt tính sinh dược học, giải thích chế chữa bệnh dân gian hợp chất Từ đó, làm giàu tăng tác dụng sinh dược chúng Không dừng lại việc nghiên cứu hợp chất có cấu trúc từ cỏ, người cịn nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất có hoạt tính sinh dược học mạnh hơn, góp phần vào lĩnh vực chăm sóc sức khỏe người ngày nâng cao

Trên sở Hesperidin, loại flavonoid có nhiều thuộc họ cam quít, đặc biệt với hàm lượng lớn vỏ quít, loại có sẵn trồng nhiều Việt Nam, chúng tơi thủy phân Hesperetin Hesperetin loại flavonoid nghiên cứu nhiều giới tác dụng lên nhiều loại bệnh khác Với mong muốn góp phần vào việc nghiên cứu sâu cho việc sử dụng tốt hợp chất thiên nhiên Việt Nam, thực đề tài này, bước đầu tổng hợp hợp chất trung gian Triacetyl Hesperetin để tiến hành tổng hợp vài dẫn xuất Hesperetin sau này, xét nghiệm tính kháng nấm, kháng khuẩn hợp chất tìm Từ làm tảng để thực bước tổng hợp dẫn xuất khác nghiên cứu sâu

Luận văn thạc só

Phần I:

TỔNG QUAN

Luận văn thạc só

I FLAVONOID.

I.1 Phân bố [1],[3]

Flavonoid nhóm hợp chất lớn thường gặp thực vật Hơn nửa rau thường dùng có chứa flavonoid Cho đến có khoảng 4000 chất xác định cấu trúc Chỉ riêng nhóm flavon flavonol với nhóm OH OCH3 theo lý thuyết gặp 38.627 chất Phần lớn

chất flavonoid có màu vàng Tuy nhiên, số có màu xanh, tím, đỏ, số khác khơng có màu

Trong thực vật có số nhóm hợp chất khác khơng thuộc flavonoid lại có màu vàng Carotenoid, Anthranoid, Xanthon

I.2 Cấu trúc hóa học [1],[2],[3]

Flavonoid chất màu thực vật, có cấu trúc 1,3-diphenylpropan nghĩa vòng benzen A B nối qua dây có carbon hay nói cách khác khung gồm vịng bezen A B nối với qua mạch carbon ( C6-C3-C6) Cấu trúc vịng kín mở

Cách đánh số tùy theo dây C3 đóng hay hở Nếu dây C3 đóng, đánh số

bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxigen mang số đánh tiếp đến vòng A, vòng B đánh số phụ Nếu dây C3 hở, đánh số vịng B đánh

số phụ vòng A

Cấu trúc flavonoid

Thường flavonoid có mang nhiều nhóm –OH vị trí nhân A vị trí 3; 4; nhân B Các flavonoid diện dạng tự dạng glycosid Các đường thường gặp đường D- glucose; kế D-galactose; L-Rhamnose; L-Arabinose; D-Xylose; D-Apiose acid Uronic

Luận văn thạc só

Trong đa số trường hợp mạch carbon đóng vịng với vịng A tạo nên dị vịng C có chứa oxy Dị vịng C Dihydroxy pyran, -pyron,

Dihydro -pyron

Dihydropyran -pyron Dihydro -pyron

Tại vịng có đính nhiều nhóm hydroxy tự thay phần, chất chúng polyphenol có tính acid

Các polyphenol phản ứng lẫn qua nhóm hydroxy để tạo thành phân tử phức tạp liên kết với hợp chất khác oza (dạng glycozide), protein

I.3 Phân loại flavonoid.[1],[3]

Sự phân loại flavonoid dựa vào vị trí gốc aryl (vịng B) mức độ oxy hóa mạch carbon

I.3.1 Flavon.

Flavon có cấu trúc chung vịng benzen A B vòng B gắn vào vòng C (pyran) qua dây nối C2

Cấu trúc chung Flavon

Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 4

O O O O O O A C B

2' 3' 4'

6

6' 5' O

Luận văn thạc só

Flavon thường gặp Apigenin Luteolin

Apigenin Luteolin

Hiện nay, người ta phát 130 hợp chất flavon dạng tự glycoside

I.3.2 Flavanon.

Flavanon khác với flavon chỗ khơng có nối đơi vị trí C2 C3 Tất

các flavanon phát có nhóm OH vịng A B Trong tự nhiên chúng thường có bên cạnh flavon tương ứng, có nhiều họ Rosaceae, Rutaceae, Leguminosaea, Asteraceae Chất tiêu biểu Naringin, Prunnin, Hesperidin

Flavonon Naringin

Prunnin Hesperidin

Luận văn thạc só

Flavanon chất không màu làm phản ứng với cyanidin cho màu rõ flavon, ngồi flavanon có điểm chảy thấp flavon tương ứng

I.3.3 Flavonol.

Khác với flavon có thêm nhóm OH C3 Flavonol phổ biến tự

nhieân

Flavonol

Flavonol kết tinh từ vàng nhạt đến vàng Hai chất quan trọng thường gặp Kaemferol, Quercetin, thứ đến Myricetin

Kaempferol Quercetin

Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 6 O

O

OH

O

OH

O OH HO

OH

OH O

OH

O OH HO

Luận văn thạc só

Thống kê 1000 lồi thuộc thực vật hạt kín thấy 48% lồi có Kaempferol, 26% lồi có Quercetin Myricetin chiếm 10% tổng số lồi có flavonol

Myricetin

Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 7 O

OH

O OH HO

OH

Luaän văn thạc só

I.3.4 Dihydroflavonon.

Cấu trúc giống flavonol nối đôi C2-C3 Còn gọi

3-hydroxyflavanol flavanol

Chất phổ biến đơn giản 7-hydroxydihidroflavonol

Dihyroflavonol 7-hydroxydihydroflavonol

I.3.5 Chalcon.

Chalcon có vịng A B nối với mạch hở carbon, khơng có dị vịng flavonoid khác số thứ tự carbon vòng B

Trong tự nhiên, chalcon có nhóm OH vịng A B, chất có màu vàng đến vàng cam, tạo màu vàng tươi nhiều loại hoa Chalcon có chủ yếu số hoa họ Cúc-Asteraceae Chalcon có phận khác vỏ, lá, gỗ, quả, rễ số loài Acacia… chất chalcon phổ biến Butein Để nhận biết chalcon, dùng amoniac khói kiềm thuốc lá, màu chuyển sang đỏ cam hay đỏ

Chalcon Butein

Luận văn thạc só

I.3.6 Dihydrochalcon.

Là chalcon dây nối đôi ,  Loại gặp tự nhiên Chất tiêu

biểu Phloridzin (trong táo), chất có đặc tính ngăn hấp thu glucose ruột non ngăn tái hấp thu glucose tiểu quản thận Một số dihydrochalcon có vị gấp 2000 lần đường mía

Phloridzin I.3.7 Auron.

Là nhóm flavonoid có màu vàng sáng Khung auron có 12 carbon flavonoid khác, dị vòng C có cạnh Số lượng phân bố hạn chế Chất tiêu biểu Sulfuretin (có nhiều loại hoa), Aureusidin

Aureusidin Sulfureti

Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 9 HO O OH Gl OH O 4'   O O CH OH OH 4 5

6 7 2' 3'

Luận văn thạc só

I.3.8 Anthoxyanidin (2-phenylbenzo pyrilium).

Luận văn thạc só

Về cấu trúc, nhóm khác flavonoid khác chỗ khơng có nhóm carbonyl C4

và luôn có nhóm oza gắn vào OH Các oza phổ biến glucoza, galactoza, arabinoza, fructoza Sau thủy phân

chúng cho anthoxyanin laø Pelargonidin

Pelargonidin màu vàng cam hồng, Xyanidin màu hồng xỉn Delfinidin màu đỏ tím

Xyanidin Delfinidin

I.3.9 Leucoanthoxyanidin.

Là 3,4-diol flavan, khơng màu, gặp acid biến thành anthoxyanidin có màu hồng đỏ, phổ biến cây, vỏ gỗ

3,4-diol flavan I.3.10 Isoflavon.

Luận văn thạc só

Là nhóm isoflavonoid phổ biến có nhiều giá trị tác dụng chữa bệnh, thường gặp họ Rosaceae, Amaranthaceae, Iridacea, ví dụ: Daidzein có sắn dây, Formonometin có cam thảo

Cấu truùc Isoflavon Daidzein: R1 = R2 = H

Formonometin: R1 = H, R2 = CH3

I.3.11 Rotenoid.

Người ta biết khoảng 15 chất rotenoid, chất điển hình Rotenon có thuốc cá Derris elliptica Tác dụng quan trọng nhóm hợp chất diệt sâu bọ, hạn chế khả thu nhận oxy sâu bọ

Học viên Nguyễn Thị Bích Trâm Trang 12 O

O

O

O R1O

Cấu trúc chung cuûa Rotenoid Rotenon

I.3.12 Neoflavonoid.

Thuật ngữ Neoflavonoid dùng để nhóm hợp chất có khung 4-aril croman Chất phân lập calophylolid chiết từ hạt Mù u Calophyllum inophyllum số lồi Calophyllum khác, họ Guttiferae

Cấu trúc Neoflavonoid Calophylolid

I.3.13 Biflavonoid. O O O O O O O C CH3 CH2 OCH3 OCH3 O 1 2 3 4 2' 3' 4' 5' 6' 8 7 6 5

CH3 O

O

Harborne xem Biflavonoid dime Apigenin Ví dụ nhóm Biflavon Flavanonyl-flavon gọi nhóm Agathisflavon

Agathisflavon

I.4 Vai trò Flavonoid.[1],[3]

I.4.1 Vai trò Flavonoid

 Các nhóm phenol flavonoid có vai trị hịa tan chất di

chuyển dễ dàng qua màng sinh lý Một số flavonoid có tác dụng số chất chống oxy hóa, bảo vệ acid Ascorbic (vitamin C) – thành phần quan trọng tế bào thực vật Một số có tác dụng ức chế enzym chất độc

 Nhiều cơng trình nghiên cứu tác dụng ức chế kích thích sinh trưởng

cây flavonoid Nhóm chức hydroxy có vai trị định tác dụng này, ví dụ : ổi, flavonoid có nhóm OH vị trí 4’ làm tăng cường hoạt tính enzym flavonoid có OH 3’ 4’ lại có tính ức chế Flavonoid cịn tham gia vào hơ hấp-quang hợp

 Flavonoid đóng vai trị tạo màu sắc hấp dẫn cho cây, góp phần thúc đẩy

sự sinh tồn phát triển hoa Nhờ hệ thống thị giác đặc biệt, sâu bọ nhạy cảm với màu sắc cỏ Thực nghiệm cho thấy, lồi ong thích màu xanh màu vàng, lồi bướm thích màu hồng trắng, lồi ruồi thích màu trắng, lồi chim sâu lại thích màu

O

O OH

HO

OH O

O

OH

đỏ Trong việc tạo màu, flavon, flavonol, auron, chalcon cho màu vàng, anthocyanine cho màu hồng, đỏ, tím xanh thẫm

 Một số flavonoid khơng màu có đóng vai trị chất bảo vệ

cây Vị đắng khó chịu flavonoid làm cho động vật ăn cảm giác ngon khơng thích ăn loại cỏ Quercetin với nồng độ thấp có cảm giác ngon, với liều 0.2% gây ức chế tiết nước bọt

I.4.2 Vai trò flavonoid y hoïc.

 Powers (1964) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn 24 loại flavonoid

trên 10 chủng vi khuẩn Hầu hết flavonoid ức chế hô hấp tái sinh sản nồng độ 1-2 mol môi trường glucoza Với 24 chất

khử khơng có chất khơng có tác dụng số 10 vi khuẩn thử

 Trong chương trình sàng lọc chất tác dụng với khối u phát số

flavonoid có tác dụng với số dạng ung thư Các dẫn chất flavonoid có khả dập tắt gốc tự HO, ROO Các gốc sinh tế bào nhiều nguyên nhân sinh cạnh ADN gây ảnh hưởng nguy hại gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh lão hoá Một số tài liệu gần có nói đến tác dụng chống ung thư số chất Leucocyanidin, Leucopelargonidin tác dụng kháng HIV số dẫn chất thuộc nhóm flavon Chrysin, Acacetin 7-- -D-galactopyranosid

Eupatoretin : R=Me ) Centaureidin

 Flavonoid tạo phức với ion kim loại mà ion kim loại

này xúc tác nhiều phản ứng oxy hố Các flavonoid có 3,5,3’,4’-hydroxy có khả liên kết tốt với ion kim loại theo phức oxychromon, oxycarbonyl 3’,4’-orthodioxyphenol

 Thành phần màng tế bào có chất lipid dễ bị peroxyd hoá, tạo

những sản phẩm làm rối loạn trao đổi chất dẫn đến hủy hoại tế bào Đưa chất chống oxy hoá flavonoid vào thể bảo vệ tế bào có khả ngăn ngừa nguy : xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá, tổn thương xạ, thối hố gan

 Một tác dụng quan trọng flavonoid nâng cao tính bền thành

mạch máu Flavonoid với acid ascorbic tham gia trình hoạt động enzym oxy hố – khử Flavonoid cịn ức chế tác động hyaluronidase Enzym làm tăng tính thấm mao mạch, enzym thừa gây tượng xuất huyết da mà y học gọi bệnh thiếu vitamin P (P-avitaminose) Các chế phẩm chứa flavonoid chiết từ loài Citrus Cemaflavon, Circularine,… flavonoid từ bạc hà Daflon, Diosmin, flavonoid từ hoa hoè (Rutin) với nhiều biệt dược khác chứng minh tác dụng làm bền thành mạch, làm giảm tính “dịn” tính thấm mao mạch Tác dụng hợp lực với acid Ascorbic Tác dụng có liên quan đến cấu trúc flavonoid Thực nghiệm cho thấy flavonoid có nhóm OH tự vị trí 3’, 4’ có tác dụng tốt nâng cao tính bền vững thành mạch Rutin chất tiêu biểu tác dụng

 Flavonoid dùng trường hợp rối loạn tĩnh mạch, tĩnh mạch

bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, trĩ, bệnh nhãn khoa xung huyết kết mạc, rối loạn tuần hồn võng mạc Các dẫn chất Anthocyanisid có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc chứng minh có tác dụng tăng thị lực vào ban đêm

 Tác dụng chống độc flavonoid thể làm giảm thương tổn gan, bảo

vệ chức gan số chất độc đưa vào thể súc vật thí nghiệm (CCl4, Benzen, Ethanol, CHCl3, Quinin, Norarseol,…) tác

Glycogen gan tăng Sự tích lũy Glycogen có ý nghĩa quan trọng việc nâng cao chức giải độc gan Việc sử dụng số cỏ điều trị viêm gan, xơ gan, bảo vệ tế bào gan hiệu : Artiso, có biệt dược Chophytol, Silibum marianum có biệt dược “Legalon”, bụp dấm –Hibiscus sabdariff

 Tác dụng kích tiết mật thể chất thuộc nhóm flavanon, flavon,

flavonol vaø flavan -3-ol

 Flavonoid thể tác dụng chống co thắt tổ chức nhẵn (túi mật,

ống dẫn mật, phế phản,…) Thí du ï: Apigenin có tác dụng làm co thắt phế quản gây Histamin, Acethylcholin

 Trên máy tiết niệu, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, flavanon,

flavonol thể tác dụng thông tiểu rõ rệt Thí dụ : Scoparosid Sarothammis seoparius, Lespecapitosid caây Lespedeza capitata, Quercitrin diếp cá, Orthosiphol râu mèo Orthosiphonis

 Tác dụng chống loét flavanon chalcon glycoside rễ cam thảo

đã ứng dụng chữa đau dày Một số dẫn chất khác catechin, 3-O-methycatechin thử nghiệm thấy có tác dụng chống loét

Tác dụng chống viêm nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, flavanon, dihydroflavonol, anthocyanin… chứng minh thực nghiệm chất flavonoid ức chế đường sinh tổng hợp prostagladin Người ta sử dụng Rutin, Citrin, Leucodelphinidin, Quercetin để điều trị ban đỏ, viêm da, tổn thương da màng nhầy

 Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavonol, flavan-3-ol,

anthocyanin Quercetin, Rutin, Myricetin, hỗn hợp Catechin trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp Thí nghiệm làm phục hồi tim bị ngộ độc CHCl3 , Quinin, Methanol, bình thường lại rối loạn nhịp

 Cao chiết từ Bạch Ginko biloba chứa dẫn chất 3-rutinosid

hoàn máu động mạch, tĩnh mạch, mao mạch Thuốc dùng cho người có biểu lão suy, rối loạn trí nhớ, khả làm việc trí óc sút kém, tập trung tư tưởng, hay cáu gắt Trên hệ thần kinh số flavon glycoside hạt táo Ziziphus vulgavis var Spinsus (chứa Spinosin, Swertisin dẫn chất acyl Spinosin) có tác dụng an thần rõ rệt

 Một số nhóm hợp chất flavonoid có tác dụng estrogen Hiện tượng xẩy

thai cừu Úc vấn đề lớn nghiên cứu phổ biến Nguyên nhân chủ yếu gây tượng cừu ăn lồi có chất Isoflavon Genistein với hàm lượng 0.7% Thực nghiệm chứng minh chất có tác dụng estrogen chuột nhắt Tác dụng estrogen giải thích có giống cấu trúc hóa học chúng với chất estrogen tổng hợp Dietylstiboestrol

Genistein Dietylstibostrol

O

O OH HO

OH

OH

II HESPERIDIN.

II.1 Các loại có chứa Hesperidin.

Hesperidin thuộc nhóm flavonoid, tìm thấy lồi thuộc họ cam qt quít, cam, chanh, bưởi… Hesperidin chiếm hàm lượng lớn vỏ qt

Mô tả qt [4],[5].

- Tên khoa học : Citrus deliciosa Tenore, Citrus nobilis var deliciosa Swigle, Citrus reticulata Blanco.

- Thuộc họ : Cam qt ( Rutaceae ) a) Mô tả cây.

Cây qt loại nhỏ, mọc so le, đơn, mép có cưa, vỏ có mùi thơm đặc biệt Hoa nhỏ, màu trắng, mọc đơn độc kẽ Quả hình cầu hai đầu dẹt, màu vàng cam hay đỏ, vỏ mỏng nhẵn hay sần sùi, dễ bóc, mùi thơm ngon, nhiều hạt

b) Phân bố, thu hái chế biến.

Quít loại trồng khắp nơi nước ta Nhiều tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Thừa Thiên, Nam Định, Hà Nam, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Bắc Giang, Bắc Ninh, … Tại Trung Quốc, ngồi lồi với qt ta, người ta cịn trồng số lồi qt khác : Đại Hồng Cam ( Citrus chachiensis hay Citrus nobilis var chachiensis Wong ), Phúc Quyết ( Citrus tangeriana Hort et Tanaka hay Citrus reticulata var deliciosa H H Hu ) Châu ( Citrus erythrosa Tanaka hay Citrus reticulata Blanco var erythrosa H H Hu ) Ở Việt Nam, ngồi qt ngọt, ta cịn nhiều loại quít khác chưa xác định tên khoa học : quít giấy, quít tàu, quít nuốm, …

c) Thành phần hóa học.

II.2 Cấu tạo Hesperidin.[8],[13],[15],[16]

 Các tên thường gọi : Hesperidin;

Hesperetin-7-rhamno-glucoside; Hesperetin-7-rutinoside vaø (S)-7-[[6-0-(6-deoxy-alpha-L-mannop-yranosyl)-beta-D-glucopyranosyl]-2, 3-dihydro-5-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one

 Công thức phân tử : C28H34O15

 Khối lượng phân tử : 610.55  Công thức cấu tạo :

Hình 1: Cấu trúc hóa học Hesperidin.

II.3 Tính chất vật lý.[6],[8]

Hesperidin có dạng bột vô định hình, màu trắng, không màu, không mùi, không vị

Hesperidin khó tan nước (độ hịa tan : gam hịa tan 50 lít nước) Độ tan tăng dần dung môi sau : Benzen, Chloroform, nước, Axeton, Methanol Tan tốt dung dịch kiềm

Tnc = 258  262 0C

OH H H H OH OH H H CH3

O O CH2

II.4 Ứng dụng Hesperidin.

 Chữa bệnh dân gian [5].

Trong y học cổ truyền, vỏ quít trở thành vị thuốc phổ biến nhân gian, thường tiêu thụ lượng lớn để làm thuốc chữa ho, tiêu thực, trừ đờm, riêng hạt dùng để chữa chứng vị có hiệu Hesperidin từ vỏ qt có tác dụng làm bền thành mạch, chữa trĩ, lợi mật, kháng nấm, kháng khuẩn chống ngưng tập tiểu cầu

 Trong chữa trị ung thư [7]

Ung thư đại tràng loại ung thư ác tính Tăng ăn mỡ, giảm lượng carbohydrat tăng tỷ lệ ung thư đại tràng

Ung thư đại tràng xảy người ăn nhiều rau Điều giải thích sau:

- Ăn nhiều rau có khả loại trừ carcinogen thịt mỡ

- Rau chứa nhiều chất anticarcinogen, phong bế phát triển ung thư đại tràng Thực tế thí nghiệm động vật, người ta thấy thành phần rau ngăn cản phát sinh ung thư Hiện người ta biết rau giàu flavonoid, chất làm giảm tỷ lệ ung thư đại tràng

Một cơng trình nghiên cứu năm 1997 Nhật có liên quan đến flavonoid ung thư đại tràng sử dụng chất: Diosmin Hespiridin từ thuộc họ cam chanh để theo dõi hiệu phòng ung thư chúng

Diosmin Hespiridin hai chất thuộc flavonoid, người ta biết rõ chúng có chất antioxydant, tác dụng chống viêm tác dụng ức chế tổng hợp prostaglandin Sự làm thay đổi sinh hợp prostaglandin làm biến điệu sinh ung thư đại tràng người động vật Cả hai dùng riêng rẽ phối hợp làm giảm tỷ lệ ung thư đại tràng chuột

Mặt khác người ta thấy Diosmin Hesperidin có tác dụng chống biến dị, làm biến điệu enzym chuyển hoá thuốc tác dụng chống khởi phát ung thư giống tác nhân ngăn cản hoá học chống ung thư đại tràng khác

hạn chế tốc độ sinh tổng hợp polyamin (như Diamin, Spermidin Spermin ), mà chất có liên quan chặt chẽ đến tốc độ tăng sinh sản số mô, tăng nồng độ ODC thấy sau biểu tác nhân carcinogen Vậy làm giảm ung thư đại tràng chất flavonoid nói nghĩa qua ức chế ODC dẫn đến tổng hợp polyamin giảm máu sinh sản biểu mơ đại tràng từ bị giảm

 Hesperidin, Hesperetin giúp ngăn ngừa chữa trị bệnh tim.[14],[20].

Hesperidin Hesperetin làm giảm nguy phát triển bệnh tim mạch : xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, … gây enzym HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA) Hesperidin Hesperetin ức chế enzym HMG-CoA, tác nhân gián tiếp tổng hợp acid mevalonic-hợp chất trung gian trình tổng hợp sterol isoprenoid làm tăng lượng cholesterol máu

Một nguyên nhân gây bệnh tim mạch tác dụng enzym ACAT (Acyl CoA cholesterol-O-ocyltransferase), enzym đẩy mạnh ester hóa cholesterol máu, làm phát triển đại thực bào lipic thành mạch tạo nên chứng xơ vữa động mạch Hesperidin Hesperetin có tác dụng ức chế hoạt tính ACAT, góp phần đẩy lùi nguy mắc phải bệnh tim mạch

 Hesperidin, Hesperetin ảnh hưởng lên chuyển hóa xương.[12], [15],

[17],[24]

Hesperidin, Hesperetin có khả kích thích hình thành ức chế thối hóa xương Hoạt tính phosphatase alcalin chuyển hóa tạo hình xương kích thích có mặt Hesperidin, Hesperetin Với phát minh này, Hesperidin Hesperetin vừa nguồn dinh dưỡng, vừa dược phẩm quan trọng cho người việc phát triển xương, phòng chống bệnh loãng xương

 Hesperidin, Hesperetin giúp ngăn ngừa chữa trị bệnh gan.[20].

Một số nghiên cứu cho thấy Hesperidin Hesperetin đưa vào sử dụng để phòng ngừa chữa trị bệnh gan : viêm gan, xơ gan, ung thư gan

Hesperidin sử dụng rộng rãi dược phẩm, mỹ phẩm thực phẩm Hesperidin chất có hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, hypolipidemic, kháng khối u, làm bền vững thành mao mạch, ngăn ngừa chảy máu điều chỉnh huyết áp Hesperidin ức chế enzym : phospholipase A2, lipoxygennase, HMG-CoA reductase cyclo-oxygenase

Hesperidin làm tăng độ bền thành mao mạch làm giảm độ thấm mao mạch Hesperidin sử dụng để làm giảm sốt dị ứng khác ức chế phóng thích histamine Và hoạt tính chống ung thư giải thích ức chế tổng hợp polyamine

Ngoài Hesperidin cịn làm tăng hoạt tính vitamin-C, đóng vai trị “vitamin P”, sử dụng việc điều trị bệnh chảy máu lợi bệnh thiếu vitamin-C

III HESPERETIN.

III.1 Caáu taïo.[8],[18]

 Các tên thường gọi : Hesperetin; 4-Methyl este xianidanon;

3,5,7-Trihydroxi-4-metoxiflavon; (S)-2,3-dihydro-5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4-H-1-bezopyran-4-one

 Công thức phân tử : C16H14O6

 Khối lượng phân tử : 302.27  Cơng thức cấu tạo :

Hình : Cơng thức cấu tạo Hesperetin

III.2 Tính chất vật lý.[6],[8]

Hesperetin có dạng tinh thể hình kim hay lục giác, màu trắng, không mùi, không vị

Ít tan nước, Chloroform, Benzen Tan Methanol, Axeton dung dịch kiềm

Tnc = 226  228 0C

O

OH

OCH3

O HO

III.3 Phản ứng điều chế.[19]

Hesperetin điều chế phản ứng thủy phân Hesperidin môi trường acid

Glucose Rhamnose Hesperetin

III.4 Ứng dụng Hesperetin.

 Hesperetin chất chống oxy, có khả làm hiệu

peroxynitrite [23]

Peroxynitrit chất oxy hóa hoạt động hai tác nhân oxy hóa superoxide ( O2- ) nitric oxyde ( NO), oxy hóa thành phần tế bào : protein thiết yếu, no-protein thiols, ADN, protein tỉ trọng thấp, màng nhày phospholipid Peroxynitrite đóng góp làm phát sinh bệnh nguy hiểm đột quỵ, bệnh tim, tâm thần, xơ vữa động mạch thiếu enzym nội sinh ngăn cản (ONOO)- hoạt động.

H2SO4

O OH OCH3 O HO OH C6H12O6 C6H12O5

OH H H H OH OH H H CH3

O O CH2

Hesperetin chứng minh có khả làm (ONOO)- hiệu

quả đáng tin cậy Hesperetin chứng tỏ khả bảo vệ tế bào từ tác nhân gây hại (ONOO)- Phát loại thuốc đặc hiệu làm (ONOO)

-là bước ngoặt lớn lĩnh vực chữa bệnh

 Hesperetin làm giảm nguy ung thư [21]

Hesperetin làm giảm nguy phát triển ung thư Các nhà khoa học nhận dạng vài bioflavonoid từ họ cam quít ức chế cytochrome enzym P450 Tác hại enzym nghiêm trọng, chúng kích hoạt procarcinogen : khói thuốc, thuốc trừ sâu, … trở thành chất sinh ung thư Các procarcinogen tự sinh ung thư, trở thành chất sinh ung thư sau vào thể người

Hesperetin có khả ức chế enzym P450 1B1- tránh chuyển tác nhân procarcinogen thành chất sinh ung thư, làm giảm nguy ung thư vú, tuyến tiền liệt ức chế trình giảm hocmon sinh dục nữ enzym gây Không ngăn chặn enzym P450 1B1, Hesperetin cịn có tác dụng mạnh lên khối u Ảnh hưởng Hesperetin lên enzym P450 1B1 dẫn đến nhiều khả việc chữa bệnh hóa học trị liệu

 Hesperetin có khả chữa trị bệnh da hiệu viêm da, mụn

trứng cá, …[25].

Đối với bệnh viêm tuyến nhờn da, mụn trứng cá, … Hesperetin chứng nhận dược phẩm sử dụng an tồn, có hiệu điều trị thẩm mỹ cao so với phương pháp chữa trị khác Hesperetin tác động trực tiếp lên tiết bả nhờn da bả nhờn Hesperetin làm giảm lượng bả nhờn, dầu da da đầu tóc mà khơng gây tác dụng phụ teratogenecity, suy yếu tuyến yên, thể suy yếu nam kết hợp với antiandrogens acid retinoid Hơn Hesperetin ức chế phát triển vi khuẩn P acnes, loại vi khuẩn gây mụn trứng cá

IV TRIACETYL HESPERETIN.[8],[26]

IV.1 Cấu tạo.

 Cơng thức phân tử : C22H20O9

 Khối lượng phân tử : 428  Cơng thức cấu tạo :

Hình : Công thức cấu tạo Triacetyl Hesperetin.

IV.2 Tính chất vật lý.

Triacetyl Hesperetin có dạng bột, vô định hình, màu trắng, không vị Tan tốt Aceton, Etylacetat, tan Methanol, Ethanol, dung dịch kiềm, không tan Ether dầu hỏa

Tnc= 139  1410C

O

O

OCH3

O O

C H3C

O

O C O CH3

C O

IV.3 Điều chế.

Hesperetin Triacetyl Hesperetin

IV.4 Ứng dụng.

Triacetyl Hesperetin chất trung gian để tổng hợp dẫn xuất Hesperetin có hoạt tính sinh học cao Diosmin, Diosmetin có nhiều ứng dụng quan trọng lĩnh vực y học

O

OH

OCH3

O HO

OH

C O

CH3

CH3COONa (CH3CO)2O

O

O

OCH3

O O

C H3C

O

V XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN.

V.1 Các phương pháp định tính phát tính kháng khuaån.

Phương pháp cho ta thấy rõ phạm vi tác dụng hiểu biết sơ khả loại kháng khuẩn tố giai đoạn thô

V.1.1 Phương pháp trộn thuốc vào môi trường thạch.[9]

Chất chiết pha lỗng với dung dịch đệm có nồng độ xác định Dung dịch trộn với môi trường nuôi cấy, để nhiệt độ 480C – 500C, sau đổ

ra hộp lồng với lượng định Khi thạch đông lại ta cấy chủng vi sinh vật chuẩn bị từ trước Dùng que cấy vô trùng lấy chủng vi sinh vật gốc cấy lên mặt môi trường thạch thành vạch thẳng Để hộp lồng điều kiện thích hợp, từ 18 đến 20 cho vi khuẩn mọc lên

Chúng ta nhận định kết quan sát vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc, hay không mọc so với mẫu đối chứng

V.1.2 Phương pháp đục lỗ môi trường thạch.[9]

Trong hộp lồng, đổ mơi trường thạch nóng chảy, để đơng lại, sau cấy vi khuẩn khắp mặt Dùng ống khoan lỗ có kích thước quy định khoan vào thạch để tạo lỗ tròn Đổ mẫu thuốc cần nghiên cứu vào lổ trịn để vào tủ ấm 370C sau 18 giờ.

Phương pháp cho kết rõ ràng, chất kháng khuẩn ngấm trực tiếp vào mơi trường

V.1.3 Phương pháp thấm giấy. [9]

Giấy thấm cắt thành hình trịn có đường kính khoảng 33.5 – 34.0 mm, sấy vô trùng Cho mẫu giấy thấm vào dung dịch có chứa chất kháng khuẩn, hong khô Đặt giấy lên mặt môi trường thạch gieo cấy vi khuẩn, cất vào tủ ấm 370C sau 18 -20 giờ, đem đọc kết Chỗ thạch có chất kháng

Phương pháp thích hợp phát loại vi khuẩn có hoạt tính mạnh Ngồi ảnh hưởng nhiều đến lượng vi khuẩn cho vào mơi trường thí nghiệm khơng định

V.1.4 Phương pháp ống trụ “Heatley”.[9]

Dùng hộp lồng có đường kính 10 cm, đáy bằng, đổ vào khoảng 10 ml môi trường thạch đun chảy, đặc lại Đun chảy bình mơi trường thạch khác có chứa 20 ml, chờ nhiệt độ mơi trường trở 420C - 440C, cho vào 0.2

ml vi khuẩn cấy vào canh thang mọc tốt, trước 12 giờ, lắc mơi trường vi khuẩn đổ hộp thạch nói lớp mỏng khoảng ml Lớp đông lại sau 10 – 15 phút Đặt lên mặt lớp thạch vịng kim loại khơng gỉ, vịng cao 9.6mm, đường kính ngồi 7.2 mm, đường kính mm, vịng kim loại có khối lượng khơng nhẹ q 1.7 gam để đảm bảo độ lún vào thạch Đổ dung dịch cần nghiên cứu vào vịng nói với nồng độ khối lượng định, nhẹ nhàng để vào tủ ấm 370C khoảng 18 Sau thời gian

này ta thấy vi khuẩn phát triển thành màu trắng đục, khắp mặt môi trường, cịn quanh vịng kim loại có vùng trong, vùng chứng tỏ vi khuẩn không mọc

Phương pháp thường dùng cho việc phát tính kháng khuẩn, có ưu điểm đảm bảo an tồn cho người thực hành kỹ thuật, bị nhiễm trùng, kết rõ ràng

V.1.5 Phương pháp đào rãnh Fleming (1932).[9]

Phương pháp dùng để kiểm nghiệm tính kháng khuẩn giống điều chế Penixilin Môi trường thạch nấu chảy đổ vào hộp lồng, chờ cho đông lại, dùng dao nhỏ vô trùng cắt hai đường song song gần hộp ( hai đường cách 0.3 cm ), bỏ thỏi thạch đi, đổ dung dịch thuốc định thử vào rãnh Cấy vi khuẩn thành đường thẳng góc với rãnh Để vào tủ ấm 370C

khoảng 18 Đọc kết cách đo vùng vô khuẩn từ chân rãnh trở V.1.6 Phương pháp viên nén Đặng Văn Ngữ (1956).[9].

Các mẫu thuốc nghiền nát, ép thành viên hình trụ, cao 0.8 cm, đường kính –2 cm Đặt viên lên hộp môi trường thạch, đặt hộp tủ lạnh 40 C giờ, để hoạt chất kháng khuẩn từ dược liệu khuếch

dùng dụng cụ đặc biệt phun lên mặt môi trường lớp vi khuẩn, đậy nắp lại, để vào tủ ấm 370 C 12 -18 Đọc kết cách đo vùng vơ

khuẩn quanh viên nén

Phương pháp tránh phải dùng nhiều vòng kim loại phải dùng thiết bị cồng kềnh khác Cũng cần phải thận trọng để tránh lây lan phải dùng loại vi khuẩn độc để thí nghiệm

V.1.7 Phương pháp thử chất kháng khuẩn bay hơi. [9] Phương pháp Rundat đề xuất lần nghiên cứu chất kháng khuẩn bay từ hạt đu đủ

Nội dung phương pháp : dùng hai hộp lồng có đường kính nhau, đổ mơi trường thạch nóng chảy vào hộp lồng phía đáy, mơi trường đông lại, cấy vi khuẩn thành đường thẳng Nữa hộp lồng để chất tinh dầu hay thực vật có chất bay giã dập Gắn khe hở băng dính paraphin, để vào tủ ấm 370 C, sau 12 -18 đọc kết quả, so

sánh với đối chứng Chất bay có tác dụng ức chế tiêu diệt vi sinh vật đem thử

Phương pháp cho phép phát chất bay mang tính kháng khuẩn mà phương pháp kể phát

V.1.8 Phương pháp sắc ký kháng khuẩn. [9]

Việc phân tích kháng khuẩn tố giai đoạn đầu trình nghiên cứu phương pháp sắc ký giấy nhà bác học Ichida (80) áp dụng trước tiên, sau nhiều người cải tiến thêm Mặc dù có nhiều tài liệu đề cập đến việc sử dụng phương pháp sắc ký giấy nay, chưa có quan điểm thống hệ thống hóa kháng khuẩn tố phương pháp

băng giấy môi trường thạch cấy vi khuẩn, để nhiệt độ 370 C 12

giờ cho vi khuẩn phát triển ta vùng vô khuẩn vết sắc ký mang hoạt tính kháng khuẩn

Phương pháp có ưu điểm tách biệt chất kháng khuẩn khỏi nhiều chất khác Xác định số Rf vết kháng khuẩn, cho phép ta

sâu nghiên cứu thành phần cấu trúc chúng

V.1.9 Phương pháp đại Vanden Benergher Vlietlinck (1994).[12 ].

Phương pháp tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật phiến vi lượng 96 giếng mẫu chiết theo bước :

Bước : Sàng lọc sơ tìm chất chiết có hoạt tính;

Bước : Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) chất có hoat tính.

Nấm vi khuẩn trì môi trường dinh dưỡng Các chủng kiểm định hoạt hóa trước tiến hành thử nghiệm mơi trường dinh dưỡng dịch thể (24 vi khuẩn, 48 nấm)

Mẫu thử hòa tan chiết phẩm dung môi Dimethyl sulfoxid (DMSO) 100%, với – 10 thang nồng độ pha loãng từ dịch gốc nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng Vi sinh vật kiểm định sau hoạt hóa, pha lỗng mơi trường dinh dưỡng nồng độ tương đương 0.5 đơn vị McLand (khoảng 108 vsv/ml) Để tủ ấm 370C thời gian 24 đối với

vi khuẩn 300C thời gian 48 nấm Sau đọc kết tính

giá trị ức chế tối thiểu (MIC)

Mẫu thơ có MIC  200 g/ml; mẫu tinh có MIC  50g/ml có hoạt tính

V.2 Các loại vi khuẩn, vi nấm sử dụng để xác định hoạt tính.[10],[11] V.2.1 Vi khuẩn.

 Staphylococcus aureus :

- Là vi khuẩn Gram (+), không giáp mô, không tạo bào tử

- Sức đề kháng : nhạy cảm với Penicilin, Authromycin Ampicilin - Khả gây bệnh :

+ gây ung nhọt, áp xe, + viêm vú bò, cừu,

+ gây nhiễm trùng máu dẫn đến viêm phổi, viêm thận cấp, viêm tuyến sữa viêm tủy xương

 Bacillus subtilis :

- Là vi khuẩn Gram (+), trực khuẩn - Là vi khuẩn có lợi, có mặt đường ruột

 Pseudomonas aeruginosa :

- Là vi khuẩn Gram (-), có tiêm mao, vi khuẩn sinh sắc tố màu xanh

- Khả gây bệnh :

+ Gây bệnh mủ xanh người động vật, + viêm bàng quan, viêm tai có mủ người

 E.coli:

- Là vi khuẩn Gram (-), không bào tử

- Sức đề kháng : nhạy cảm với Chloramphenicol, Streptomycine, Sulfamid, Trimrthoprim

- Khả gây bệnh : E.coli có sẵn ruột, thể bị suy yếu, sức đề kháng giảm E.coli gây bệnh :

+ Gây tiêu chảy,

+ bệnh phù thủng heo con, + viêm ruột

 Enterococcus faecalis :

- Enterococcus phụ nhóm Streptococcus, nhóm D - Là vi khuẩn Gram (+), dạng cầu, không bào tử

- Khả gây bệnh : da, đường tiêu hóa, dày, ruột niệu sinh dục

V.2.2 Naám.

- Là loại nấm mốc có khả sinh độc tố gây ung thư Aflatoxin - Đặc điểm hình dạng : hình bơng màu lục, cuống sinh bào tử

+ Aspergillus flavus : thể bình, hay tầng bọng Bơng hình phóng xạ hay hình cột lỏng lẻo, cuống sinh bào tử

+ Aspergillus oryzae : cuống sinh bào tử dài – mm Thể bình hai lớp, già màu nâu

- Khả gây bệnh Aflatoxin :

+ Ở gia súc : - Khi trúng độc cấp tính : chết đột ngột - Khi trúng độc mãn tính : vật ăn, chậm lớn, sụt cân

- Khi nhiễm độc kéo dài : gây ung thư + Ở người : gây ung thư

 Trichoderma sp :

- Thuộc dạng vi nấm, sống mơi trường đất

Phần II :

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU :

Trên sở Hesperidin, flavonoid chiết tách từ vỏ qt, chúng tơi tiến hành tổng hợp Hesperetin.Theo tài liệu, Hesperidin Hesperetin hợp chất có hoạt tính sinh học cao, kháng nấm, kháng khuẩn tốt, chất chống oxy hóa mạnh Bên cạnh Hesperidin Hesperetin, chúng tơi cịn nghiên cứu tổng hợp Triacetyl Hesperetin-một hợp chất trung gian, để tiến hành tổng hợp dẫn xuất Hesperetin sau

Mục tiêu nghiên cứu đề tài : - Tách chiết Hesperidin, - Tổng hợp Hesperetin,

- Tổng hợp Triacetyl Hesperetin,

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm Hesperidin, Hesperetin Triacetyl Hesperetin

Sơ đồ : Sơ đồ nghiên cứu Lựa chọn ngun

liệu (vỏ qt)

Xử lý ngun liệu

Chiết tách Hesperidin

Tinh chế Hesperidin

Khảo sát q trình tổng hợp Hesperetin

Tinh chế Hesperetin

Khảo sát trình tổng hợp Triacetyl Hesperetin

Tinh chế Triacetyl Hesperetin Định tính, định lượng

Xác định cấu trúc

Hoạt tính sinh học Xác định tính chất

sản phẩm

Đánh giá tính chất, khả ứng dụng Hesperidin tinh

Hesperetin tinh

A PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

I LỰA CHỌN XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU.

Trong lồi thực vật có Việt Nam, qt có hàm lượng Hesperidin cao, đặc biệt vỏ quít với hàm lượng 3.0% tính theo dược liệu khơ kiệt Vì chúng tơi chọn ngun liệu vỏ quít

Sơ đồ : Xử lý ngun liệu Vỏ qt

Loại tạp

Nghiền mịn

Vỏ qt dạng bột

II TÁCH CHIẾT HESPERIDIN

II.1 Phương pháp điều kiện chiết Hesperidin.

Hesperidin hợp chất tan nhiều dung môi, độ tan tăng dần dung môi sau:

+ Benzen + Chloroform + Nước

+ Aceton + Methanol

+ Dung dịch NaOH loãng

Hesperidin tan tốt dung dịch NaOH loãng Tuy nhiên chiết Hesperidin từ bột vỏ qt dung dịch NaOH lỗng phương pháp ngâm dầm, tốn nhiều thời gian hiệu suất chiết không cao Do chúng tơi chọn phương án chiết Hesperidin từ vỏ qt dung mơi Methanol

Điều kiện tiến hành

Chúng tơi chọn điều kiện tối ưu để tiến hành chiết tách Hesperidin sau:

 Dụng cụ chiết : soxhlet

 Chiết loại chất béo, chất màu :

+ Dung moâi : Ether dầu hỏa

+ Nhiệt độ chiết : nhiệt độ sơi dung dịch

 Chiết Hesperidin :

+ Dung moâi : Methanol

Quy trình chiết :

Sơ đồ :Quy trình chiết Hesperidin Bột vỏ qt

Chiết chất béo, chất màu

Lọc Dịch chiết

Methanol

(Thu hồi dung môi)

Lọc

Dịch chiết Chiết Hesperidin

Lọc, rửa

Hesperidin thô

bã Ether dầu hỏa

MeOH lạnh

II.2 Tinh cheá Hesperidin.

Hesperidin chiết xuất đem tinh chế kết tinh nhiều lần Methanol

Sơ đồ : Quy trình tinh chế Hesperidin. Hesperidin thơ

Hòa tan Metanol

Lọc nóng

Dịch lọc

Loại bớt dung mơi

Kết tinh

Lọc, rửa

Saáy

Hesperidi n tinh

Nước qua lọc Cặn

III NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỔNG HỢP HESPERETIN

III.1 Điều kiện quy trình tổng hợp.

Điều kiện tiến hành :

Chúng tơi chọn điều kiện tối ưu để tiến hành trình thuỷ phân Hesperidin thành Hesperetin sau :

- Khối lượng nguyên liệu : gam Hesperidin

- Lượng MeOH : 100 ml

- Lượng H2SO4 96% : ml

- Nhiệt độ phản ứng : tsôi dung dịch

- Thời gian phản ứng :

- Quá trình thủy phân khuấy liên tục

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng thời gian, lượng Methanol, acid H2SO4

Chúng chọn quy trình tổng hợp Hesperetin sau :

Sơ đồ : Quy trình thủy phân Hesperidin thành Hesperetin. Hesperidin

Thủy phân

Lọc

Thu hồi dung moâi Methanol

H2SO4 96%

Dd NaCl 15% Ethylacetat

Sấy

Hespereti n thô

rửa Nước

cất

III.2 Tinh chế Hesperetin.

Hesperetin tổng hợp đem tinh chế kết tinh nhiều lần Ethanol

Hesperetin thô

Hòa tan Ethanol

Lọc nóng

Dịch lọc

Loại bớt dung mơi

Kết tinh

Lọc, rửa

Saáy

Hespereti n tinh

Nước qua lọc Cặn

Sơ đồ : Quy trình tinh chế Hesperetin.

IV NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỔNG HỢP TRIACETYL HESPERETIN

IV.1 Điều kiện quy trình tổng hợp.

Điều kiện tiến hành :

Chúng tơi chọn điều kiện tối ưu để tiến hành trình tổng hợp Hesperetin thành Triacetyl Hesperetin sau :

- Khối lượng nguyên liệu : 0.2000 gam Hesperetin - Lượng CH3COONa : 0.075 gam

- Lượng (CH3CO)2O : ml

- Nhiệt độ phản ứng : tsôi dung dịch

- Thời gian phản ứng : phút - Quá trình phản ứng khuấy liên tục

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng thời gian, lượng (CH3CO)2O, lượng

Chúng tơi chọn quy trình tổng hợp Triacetyl Hesperetin sau :

Sơ đồ : Quy trình tổng hợp Hesperetin thành Triacetyl Hesperetin. Hesperetin

Ester hoùa

Cốc nước đá

Lọc, rửa

Saáy CH3COONa

Nước cất

IV.2 Tinh cheá Triacetyl Hesperetin.

Triacetyl sau tạo thành đem tinh chế kết tinh nhiều lần Ethanol

Sơ đồ : Quy trình tinh chế Hesperetin. Nước lạnh

Triacetyl Hesperetin thô

Hòa tan Ethanol

Lọc nóng

Dòch lọc

Loại bớt dung mơi

Kết tinh

Lọc, rửa

Saáy

Triacetyl Hesperetin

tinh

V NHẬN DANH SẢN PHẨM.

Sản phẩm nhận danh phương pháp phân tích hoá lý đại : sắc ký lớp mỏng, đo nhiệt độ nóng chảy, UV-Vis, IR, HPLC, LC-MS, 1

H-NMR, 13C-NMR.

B THỰC NGHIỆM.

I LỰA CHỌN XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU.

Nguyên liệu sử dụng vỏ quiùt khơ mua khu vực bán thuốc bắc đường Hải Thượng Lãn Ông, đem sàng để loại tạp chất : đất, cát; sấy khơ nhiệt độ 50-600C Sau nghiền mịn, bảo quản kín để tránh hút ẩm trở lại

II TÁCH CHIẾT HESPERIDIN.

II.1 Phương pháp điều kiện chiết tách Hesperidin Các điều kiện tiến haønh :

- Nhiệt độ chiết : nhiệt độ sôi dung dịch - Dung môi : Ether dầu hỏa, Methanol - Chiết liên tục soxhlet

II.2 Tinh chế Hesperidin.

Kết tinh lại Methanol

Cân 0.5 gam Hesperidin thơ, hịa tan 750 ml Methanol Đun sôi khuấy nhẹ khuấy từ tan hồn tồn Lọc nóng dung dịch thiết bị lọc hút chân không Dịch qua lọc tiếp tục sử dụng cô quay chân không để loại bớt dung môi, để lạnh dung dịch, Hesperidin kết tinh lại, lọc, rửa, sấy chân không 800C Đem cân Hesperidin thu để tính hiệu suất tinh

cheá

III NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỔNG HỢP HESPERETIN.

III.1 Khảo sát trình tổng hợp Hesperidin thành Hesperetin.

Laáy gam Hesperidin tinh, 100 ml Methanol vaø ml H2SO4 96% cho vaøo

trong Lấy dung dịch đem lọc qua phễu lọc hút chân không, hỗn hợp phản ứng hịa tan vào 400 ml Ethylacetat, sau rửa với 100 ml dung dịch NaCl 15% (1 lần), 150 ml nước cất (3 lần), tiếp tục sử dụng cô quay chân không để loại bớt dung môi Sản phẩm thu đem sấy chân không 80oC đến khối

lượng khơng đổi, thu cân thơ

Hình : Hệ thống đun hồi lưu.

Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tổng hợp : - Thời gian phản ứng : 4, 5, 6,

- Lượng dung môi tham gia phản ứng : 50, 75, 100, 125, 150 ml Methanol

- Lượng xúc tác tham gia phản ứng : 3, 4, 5, 6, ml H2SO4 96%

Sau khảo sát yếu tố, chọn thông số phù hợp Thơng số sử dụng để tiếp tục khảo sát yếu tố

III.2 Tinh cheá Hesperetin

Keát tinh lại ethanol :

Cân gam Hesperetin thô, hòa tan 50 ml Ethanol 800 thêm 0.2 gam

than hoạt tính, đun sơi khuấy nhẹ khuấy từ tan hoàn toàn

1

2

3

1 : OÁng sinh hàn : Nhiệt kế : Bình cầu

IV NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỔNG HỢP TRIACETYL HESPERETIN.

IV.1 Khảo sát trình tổng hợp Hesperetin thành Triacetyl Hesperetin.

Lấy 0,2 gam Hesperetin tinh, ml Anhydric acetic 0.2 gam Natri acetat cho vào bình cầu sau đun hồi lưu cách cát, khuấy nhẹ khuấy từ, dung dịch khuấy sôi phút Lấy dung dịch đem đổ vào hỗn hợp nước đá, khuấy để yên cho sản phẩm kết tinh xuống Lọc rửa lại thật với nước lạnh phễu lọc Buchner Sản phẩm thu đem sấy chân không 80oC đến khối lượng không đổi, thu cân thô.

Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tổng hợp : - Thời gian phản ứng : 1, 5, 10, 15 20 phút

- Lượng dung môi tham gia phản ứng : 1, 2, 3, 4, ml Anhydric acetic

- Lượng xúc tác tham gia phản ứng : 0.025, 0.05, 0.075, 0.10, 0.125 gam Natri acetat

Sau khảo sát yếu tố, chọn thông số phù hợp Thơng số sử dụng để tiếp tục khảo sát yếu tố

IV.2 Tinh cheá Triacetyl Hesperetin.

Kết tinh lại Ethanol :

Cân gam Triacetyl Hesperetin thơ, hịa tan 20 ml Ethanol, đun sôi khuấy nhẹ khuấy từ tan hồn tồn, lọc nóng dung dịch giấy lọc, để yên cho tinh thể kết tinh, lọc áp suất thấp để thu tinh thể Triacetyl Hesperetin, sau sấy chân khơng 80oC Đem cân Triacetyl Hesperetin thu

V NHAÄN DANH SẢN PHẨM.

V.1 Nhận danh Hesperidin.

Xác định sắc ký lớp mỏng, nhiệt độ nóng chảy, UV-Vis, IR, LC-MS : V.1.1 Sắc ký lớp mỏng, đo nhiệt độ nóng chảy.

- Sắc ký lớp mỏng :

Hồ tan Hesperidin vào dung dịch MeOH Dịch MeOH vừa pha chấm lên mỏng Silicagel chạy với hệ dung môi n-butanol – acid acetic - nước với tỷ lệ :1 : (lấy lớp trên) Bản mỏng loại 25DC-Alufolien 20x20 cm, Kiesegel 60 F254, Merk

- Đo nhiệt độ nóng chảy :

Chọn ống mao quản thủy tinh có độ dày nhau, đường kính 1-12 mm, dài 70 -100 mm, đầu hàn kín Ống phải thật khơ, cho Hesperidin vào ống mao quản, sau xác định điểm chảy máy đo điểm chảy Điểm chảy đo lần, kết lấy trung bình lần đo điểm chảy Sử dụng máy đo điểm chảy ELECTRONTHERMAL 9000 phịng hợp chất thiên nhiên Viện Cơng nghệ Hóa học Việt Nam

V.1.2 Xác định phổ UV–Vis.

Pha dung dịch Hesperidin Methanol với nồng độ xác định Dùng máy UV 2450 Shimadzu Viện Cơng Nghệ Hố Học, đo độ hấp thu dung dịch vùng bước sóng từ 200 - 800 nm Quan sát phổ, xác định cực đại

V.1.3 Xaùc định phổ IR

V.1.4 Xác định phổ LC-MS.

Phổ LC-MS ghi hệ thống Sắc ký lỏng cao áp LC 1090 Hewlett Parkard ghép khối phổ hãng MSD-Trap 1100 Aginent

V.2 Nhaän danh Hesperetin.

Xác định sắc ký lớp mỏng, nhiệt độ nóng chảy, UV-Vis, IR, HPLC : V.2.1 Sắc ký lớp mỏng, đo nhiệt độ nóng chảy.

Tương tự phần V.1.1

V.2.2 Xác định phổ UV-Vis. Tương tự phần V.1.2

V.2.3 Xác định phổ IR. Tương tự phần V.1.3

V.2.4 Xác định phổ HPLC.

Phổ HPLC ghi hệ thống Sắc ký lỏng cao áp LC 1090 Hewlett Parkard

V.3 Nhaän danh Triacetyl Hesperetin.

Xác định sắc ký lớp mỏng, nhiệt độ nóng chảy, UV-Vis, IR, HPLC, NMR : V.3.1 Sắc ký lớp mỏng, đo nhiệt độ nóng chảy.

Tương tự phần V.1.1

V.3.2 Xác định phổ UV–Vis. Tương tự phần V.1.2

V.3.3 Xác định phổ IR Tương tự phần V.1.3

V.3.5 Xác định NMR.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR ghi máy cộng hưởng từ

VI XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN.

Các mẫu thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên – Viện KH & CN Việt Nam

VI.1 Các loại vi khuẩn, nấm thử nghiệm.

Việc thử nghiệm tiến hành chủng sau :

 Vi khuaån :

- Vi khuaån Gr(-) : + Escherichia coli,

+ Pseudomonas aeruginosa - Vi khuaån Gr(+) :

+ Bacillus subtillis ,

+ Staphylococcus aureus

 Naám :

- Nấm sợi :

+ Aspergillus niger, + Fusarium oxysporum - Naám men :

+ Candida albicans,

VI.2 Môi trường thử nghiệm.

Nấm vi khuẩn trì môi trường dinh dưỡng : Saboraud dextrose broth Trypease soya broth (TSB)

VI.3 Chất thử nghiệm.

- Hesperidin, - Hesperetin,

- Triacetyl Hesperetin

VI.4 Tiến hành khảo sát.

Phần 3 :

I TÁCH CHIẾT HESPERIDIN.

I.1 Tách chiết Hesperidin.

 Hiệu suất chiết Hesperidin Methanol:  (%) = mm'* 100%

= 6.1002170 * 100%

= 6.22%

m’: khối lượng Hesperidin thu (gam) m : khối lượng vỏ quít đem chiết (gam)

I.2 Tinh cheá Hesperidin.

Hesperidin chiết xuất đem tinh chế kết tinh nhiều lần Methanol Kiểm tra sắc ký lớp mỏng cho thấy có vết trịn đẹp, với Rf = 0.58

 Hiệu suất tinh chế Hesperidin : Khối lượng Hesperidin tinh

H% =  * 100 %

Khối lượng Hesperidin thô

II NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỔNG HỢP HESPERETIN

II.1 Khảo sát trình tổng hợp.

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng thời gian, lượng Methanol, acid H2SO4

96% lên khối lượng sản phẩm phản ứng :

II.1.1 Khảo sát thời gian phản ứng. Điều kiện thí nghiệm:

+ Khối lượng nguyên liệu : 5,0000 gam Hesperidin

+ Lượng dung môi tham gia phản ứng : 100 ml MeOH , ml H2SO4 96%

+ Nhiệt độ phản ứng : nhiệt độ sôi dung dịch

Bảng : Kết khảo sát biến đổi Hesperidin thành Hesperetin theo thời gian phản ứng

Thời gian (giờ)

Khối lượng Hesperetin

thu (gam) 1.4190 1.8086 2.3616 2.3612 2.3614

Đồ thị : Biểu diễn biến đổi khối lượng sản phẩm Hesperetin theo thời gian 0.5 1.5 2.5

0 10

Thời gian (giờ)

 Nhận xét :

- Thời gian phản ứng ảnh hưởng lớn đến phản ứng

- Từ đến lượng sản phẩm tăng tương đối đáng kể, nhiên tiếp tục tăng thêm thời gian khối lượng sản phẩm không thay đổi nên xem thời gian phản ứng tối ưu

- Sau làm tinh lần, qua kết sắc ký lớp mỏng với dung môi khai triển n-BuOH : AcOH : H2O = :1 :5 (lấy lớp trên),

tất mẫu thí nghiệm cho vết, điều chứng tỏ phản ứng xảy thuận lợi, sản phẩm Hesperetin Sử dụng điều kiện để khảo sát yếu tố

II.1.2 Khảo sát lượng Methanol tham gia phản ứng

Điều kiện thí nghieäm :

- Khối lượng nguyên liệu : 5,0000 gam Hesperidin

- H2SO4 96% : ml

- Thời gian phản ứng :

- Nhiệt độ phản ứng : nhiệt độ sôi dung dịch Bảng : Kết khảo sát biến đổi Hesperidin thành Hesperetin theo lượng

Methanol tham gia phản ứng

Lượng dung môi (ml) 50 75 100 125 150

Khối lượng Hesperetin

Đồ thị :Biểu diễn khối lượng sản phẩm Hesperetin theo lượng MeOH tham gia phản ứng

 Nhaän xeùt :

- Lượng sản phẩm thay đổi theo lượng Methanol Khi ta thay đổi thể tích Methanol từ 50 -100 ml khối lượng Hesperetin tăng vọt đạt giá trị cao 100 ml Sau khối lượng sản phẩm khơng thay đổi ta tăng thêm lượng MeOH

- Khi tăng thêm lượng MeOH giúp q trình hịa tan Hesperidin tốt Do vậy, phản ứng hết lượng Hesperidin khối lượng sản phẩm khơng đổi, ta tiếp tục tăng lượng MeOH

II.1.3.Khảo sát lượng H2SO4 96% tham gia phản ứng

Điều kiện thí nghieäm :

- Khối lượng nguyên liệu : gam Hesperidin - Thời gian phản ứng :

- Lượng MeOH :100 ml

0 0.5 1.5 2.5

0 50 100 150 200

Lượng dung môi (ml)

Bảng : Kết khảo sát biến đổi Hesperidin thành Hesperetin theo lượng H2SO4 96%

H2SO4 96%(ml)

Khối lượng Hesperetin thu (gam)

1.7180 2.2105 2.3616 2.3611 2.3616

Đồ thị :Biểu diễn khối lượng sản phẩm Hesperetin theo lượng H2SO4 96%

tham gia phản ứng.

 Nhận xét :

- Lượng acid có ảnh hưởng lớn đến phản ứng, đóng vai trị tác nhân cắt mạch

- Lượng sản phẩm thay đổi theo lượng acid Khi tăng lượng acid đến ml khối lượng sản phẩm tăng đạt giá trị cao ml

- Khi tăng thêm lượng acid (6 ml, ml) lượng sản phẩm khơng đổi (vì phản ứng chuyển hố hết thành Hesperitin) với lượng acid không làm cháy sản phẩm 0.5 1.5 2.5

0

Lượng acid (ml)

 Kết luận :

Dựa kết phản ứng trên, ta chọn điều kiện tối ưu cho phản ứng tổng hợp Hesperetin sau :

- Khối lương nguyên liệu : gam Hesperidin

- Lượng MeOH : 100 ml

- Lượng H2SO4 96% : ml

- Nhiệt độ phản ứng : tsôi dung dịch

- Thời gian phản ứng :

- Lượng sản phẩm : 2.3616 gam Hesperetin

 Hiệu suất phản ứng tổng hợp Hesperetin :

Khối lượng Hesperetin thu 610.55 H% =  *  * 100 %

Khối lượng Hesperidin đem phản ứng 302.27

= 95.40 %

610.55 = phân tử lượng Hesperidin 302.27 = phân tử lượng Hesperetin

II.2 Tinh cheá Hesperetin.

Hesperetin tổng hợp đem tinh chế kết tinh nhiều lần Ethanol Kiểm tra sắc ký lớp mỏng cho thấy có vết trịn đẹp, với Rf =

0.93

 Hiệu suất tinh chế Hesperetin : Khối lượng Hesperetin tinh

H% =  * 100 %

Khối lượng Hesperetin thô

III NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỔNG HỢP TRIACETYL HESPERETIN.

III.1 Khảo sát trình tổng hợp Hesperetin thành Triacetyl Hesperetin.

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng thời gian, lượng (CH3CO)2O, lượng

CH3COONa lên khối lượng sản phẩm phản ứng :

III.1.1 Khảo sát thời gian phản ứng. Điều kiện thí nghiệm :

- Khối lượng nguyên liệu : 0.2000 gam Hesperetin - Lượng dung môi (CH3CO)2O : ml

- Lượng CH3COONa : 0.2000 gam

- Nhiệt độ phản ứng : nhiệt độ sôi dung dịch Bảng :Kết khảo sát biến đổi Hesperetin thành Triacetyl

Hesperetin theo thời gian phản ứng

Thời gian (phút) 10 15 20

Khối lượng Triacetyl Hesperetin thu (gam)

Đồ thị : Biểu diễn khối lượng sản phẩm Triacetyl Hesperetin theo thời gian.

 Nhaän xeùt :

- Thời gian phản ứng ảnh hưởng lớn đến phản ứng

- Sau thời gian phút khối lượng sản phẩm đạt giá trị cao

- Tiếp tục tăng thời gian (5, 10, 15, 20 phút) khối lượng sản phẩm giảm dần cho thấy kéo dài thời gian phản ứng sản phẩm phản ứng giảm phản ứng chuyển dịch theo chiều làm giảm khối lượng sản phẩm

- Sau làm tinh lần, qua kết sắc ký lớp mỏng với dung môi khai triển n-BuOH : AcOH : H2O = :1:5 (lấy lớp trên),

tất mẫu thí nghiệm có vết, điều chứng tỏ phản ứng xảy thuận lợi, sản phẩm Triacetyl Hesperetin Sử dụng điều kiện để khảo sát yếu tố

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

0 10 15 20 25

Thời gian (phút)

K

h

ối

l

ươ

ïn

g

(g

III.1.2 Khảo sát lượng (CH3CO)2O tham gia phản ứng

Điều kiện thí nghiệm :

- Khối lượng nguyên liệu : 0.2000 gam Hesperetin - Lượng CH3COONa : ml

- Thời gian phản ứng : phút

- Nhiệt độ phản ứng : nhiệt độ sôi dung dịch

Bảng : Kết khảo sát biến đổi Hesperetin thành Triacetyl Hesperetin theo lượng (CH3CO)2Otham gia phản ứng

Lượng (CH3CO)2O (ml)

Khối lượng Triacetyl

Hesperetin thu (gam) 0.1652 0.2124 0.2376 0.2373 0.2369

Đồ thị : Biểu diễn khối lượng sản phẩm Triacetyl Hesperetin theo lượng (CH3CO)2O tham gia phản ứng

 Nhận xét :

- Lượng sản phẩm thay đổi theo lượng (CH3CO)2O Khi ta thay

đổi thể tích (CH3CO)2O từ - ml khối lượng Triacetyl

Hesperetin tăng vọt đạt giá trị cao ml Sau khối

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

0

Lượng dung môi (ml)

lượng sản phẩm không thay đổi ta tăng thêm lượng (CH3CO)2O

- Khi tăng thêm lượng (CH3CO)2Osẽ giúp trình phản ứng xảy

ra theo chiều thuận Tuy nhiên tăng đến nồng độ thích hợp khối lượng sản phẩm khơng đổi

III.1.3 Khảo sát lượng CH3COONa tham gia phản ứng

Điều kiện thí nghiệm :

- Khối lượng nguyên liệu : 0.2000 gam Hesperetin - Lượng (CH3CO)2O : ml

- Thời gian phản ứng : phút

- Nhiệt độ phản ứng : nhiệt độ sôi dung dịch

Bảng : Kết khảo sát biến đổi Hesperetin thành Triacetyl Hesperetin theo lượng CH3COONa tham gia phản ứng

Lượng CH3COONa (gam) 0.025 0.05 0.075 0.10 0.125

Khối lượng Triacetyl Hesperetin thu (gam)

Đồ thị : Biểu diễn khối lượng sản phẩm Triacetyl Hesperetin theo lượng xúc tác CH3COONa tham gia phản ứng

 Nhận xét :

- Lượng sản phẩm thay đổi theo lượng CH3COONa Khi ta thay

đổi lượng CH3COONa từ 0.025 - 0.075 gam khối lượng

Triacetyl Hesperetin tăng vọt đạt giá trị cao 0.075 gam Sau khối lượng sản phẩm không thay đổi ta tăng thêm lượng CH3COONa

 Kết luận :

Dựa kết khảo sát trên, ta chọn điều kiện tối ưu cho phản ứng tổng hợp Triacetyl Hesperetin sau :

- Khối lượng nguyên liệu : 0.2000 gam Hesperetin - Lượng CH3COONa : 0.075 gam

- Lượng (CH3CO)2O : ml

- Nhiệt độ phản ứng : tsôi dung dịch

- Thời gian phản ứng :1 phút

- Lượng sản phẩm : 0.2376 gam Triacetyl Hesperetin

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

0 0.05 0.1 0.15

Lượng xúc tác (g)

 Hiệu suất phản ứng tổng hợp Triacetyl Hesperetin :

Khối lượng Triacetyl Hesperetin thu 302.16 H% =  *  * 100 %

Khối lượng Hesperetin đem phản ứng 428 = 83.87 %

302.27 = phân tử lượng Hesperetin

428 = phân tử lượng Triacetyl Hesperetin

III.2 Tinh cheá Triacetyl Hesperetin.

Triacetyl Hesperetin sau tạo thành đem tinh chế kết tinh nhiều lần Ethanol Kiểm tra sắc ký lớp mỏng cho thấy vết tròn đẹp, với Rf = 0.93

 Hiệu suất tinh chế Triacetyl Hesperetin : Khối lượng Triacetyl Hesperetin tinh H% =  * 100 %

Khối lượng Triacetyl Hesperetin thô

IV NHẬN DANH SẢN PHẨM.

IV.1 Nhận danh Hesperidin.

Hesperidin sau tinh chế nhiều lần Methanol đươc sử dụng để nhận danh :

IV.1.1 Sắc ký lớp mỏng, T0 nc - Dạng bột mịn

- Màu sắc : màu trắng

- Sắc ký lớp mỏng với dung môi khai triển : n-butanol : acid acetic : H2O = :1 :5 (lấy phần trên) : cho vệt tròn màu

vàng nâu

- Nhiệt độ nóng chảy (T0

nc ) : 258  2600

IV.1.2 Phoå UV-Vis (Ethanol).

Kết phổ UV-Vis cho thấy có mũi cực đại :(xem phụ lục 1). +  = 285 nm

+  = 329 nm

IV.1.3.Phổ IR.

Kết phổ IR cho thấy : (xem phuï luïc 4)

- Mũi 3472 cm-1 : dao động liên kết –OH - Mũi 2917 cm-1 : dao động liên kết –CH - Mũi 1648 cm-1 : dao động liên kết –C=O - Mũi 1606 cm-1 : dao động liên kết C=C

IV.1.4 Phổ LC – MS :(xem phụ lục 7,10,11,12)

 Phổ LC :

Điều kiện phân tích :

- Cột : ZORBAX SB_C18, 4.6 x 150 mm, m, (P/N

883975-902)

- Pha động : A : H2O 50%

B : MeOH 50%

Gradient : at : 50% B at : 80% B at 10 : 100% - Tốc độ : ml/min

- Nhiệt độ : 400C

- Đầu dò : DAD 254 nm, bandwith : 4nm, Ref : off Kết cho thấy độ mẫu : 94.48% (xem phụ lục 7)

 Phoå MS :

Điều kiện phân tích :

+ Dung môi : Acetonitril

+ Nhiệt độ nguồn tạo ion : 3500C.

+ Chế độ phân tích negative : [M - H+ ].

Kết (xem phụ lục 11) cho : [M - H+ ] = 609.

 Biện luận :

- Mẫu Hesperidin sau làm tinh có nhiệt độ nóng chảy 2580C Kết sắc ký lớp mỏng với dung môi khai triển : n-butanol : acid acetic : H2O ( :1 :5 lấy phần trên) cho vệt tròn màu vàng

- Phổ UV-Vis có mũi hấp thu cực đại  = 285 nm  = 329 nm,

có băng II vùng (275 – 295 nm), băng I vùng (300 – 330 nm) đặc trưng cho hệ thống benzoyl cinamoyl vòng A B flavanon

Kết so sánh điểm chảy, phổ UV-Vis Hesperidin dùng nhận danh Hesperidin tài liệu :

Chất khảo sát Điểm chảy (0C)

max (nm)

Hesperidin / nhận danh 258  260 285 329

Hesperidin / taøi lieäu 258  262 283 326

- Phổ IR cho mũi hấp thu đặc trưng nhóm OH, C=O, C=C C-H hợp chất hydrocacbon

- Phoå LC – MS :

+ Kết phổ HPLC cho thấy độ mẫu : 94.48%

+ Khối Phổ MS cho kết [M – H+] = 609, tương ứng với m/z =

610 phân tử lượng Hesperidin

Các kết nhận danh so với số liệu Hesperidin cho phép nhận định sản phẩm chiết tách có Hesperidin

IV.2 Nhận danh Hesperetin.

Hesperetin sau tinh chế nhiều lần Ethanol sử dụng để nhận danh :

IV.2.1 Sắc ký lớp mỏng, T0 nc. - Dạng tinh thể hình lục giác - Màu sắc : màu trắng

- Sắc ký lớp mỏng với dung môi khai triển : n-butanol : acid acetic : H2O = :1 :5 (lấy phần trên) : cho vệt tròn màu

vàng nâu

- Nhiệt độ nóng chảy (T0

nc ) : 227  2300C

Kết phổ UV-Vis cho thấy có mũi cực đại : (xem phụ lục 2) +  = 288 nm

IV.2.3.Phổ IR

Kết phổ IR cho thấy : (xem phụ lục 5)

- Mũi 3498 cm-1 : dao động liên kết –OH.

- Mũi 3116 cm-1 : dao động liên kết –CH.

- Mũi 1641 cm-1 : dao động liên kết C=O.

- Mũi 1508 cm-1 : dao động liên kết C=C vòng thơm.

- Mũi 1176 cm-1 : dao động liên kết C-O.

IV.2.4 Phổ HPLC.(phụ lục 8).

Điều kiện phân tích :

- Cột : ZORBAX SB_C18, 4.6 x 150 mm, m, (P/N

883975-902)

- Pha động : A : H2O 50%

B : MeOH 50%

Gradient : at : 50% B at : 80% B at 10 : 100% - Tốc độ : ml/min

- Nhiệt độ : 400C

- Đầu dò : DAD 254 nm, bandwith : 4nm, Ref : off Kết cho thấy độ mẫu : 98.14% (xem phụ lục 8)

 Biện luận :

acetic : H2O ( :1 :5 lấy phần trên) cho vệt tròn màu vàng

nâu

- Phổ UV-Vis có mũi hấp thu cực đại  = 288 nm, có băng II

vùng (275 – 295 nm), băng I vùng (300 – 330 nm) đặc trưng cho hệ thống benzoyl, cinamoyl vòng A B flavanon Kết so sánh điểm chảy, phổ UV-Vis Hesperetin dùng nhận danh Hesperetin tài liệu :

Chất khảo sát Điểm chảy (0C)

max (nm)

Hesperetin / nhaän danh 227  230 288

Hesperetin / tài liệu 226  228 288

- Phổ IR cho mũi hấp thu đặc trưng nhóm OH, C=O, C=C C-H hợp chất hydrocacbon

- Kết phổ HPLC cho thấy độ mẫu : 98.14%

Các kết nhận danh so với số liệu Hesperetin cho phép nhận định sản phẩm tổng hợp Hesperetin

IV.3 Nhaän danh Triacetyl Hesperetin.

Triacetyl Hesperetin sau tinh chế nhiều lần Ethanol đươc sử dụng để nhận danh :

IV.3.1 Sắc ký lớp mỏng, T0 nc. - Dạng bột vơ định hình - Màu sắc : màu trắng

- Sắc ký lớp mỏng với dung môi khai triển : n-butanol : acid acetic : H2O = :1 :5 (lấy phần trên) : cho vệt trịn màu

vàng nâu

- Nhiệt độ nóng chảy (T0

IV.3.2 Phoå UV-Vis (Methanol).

Kết phổ UV-Vis cho thấy có mũi cực đại : (xem phụ lục 3) +  = 315 nm

+  = 261 nm

IV.3.3.Phổ IR.

Kết phổ IR cho thấy : (xem phụ lục 6)

- Mũi 1771 cm-1 : dao động liên kết C=O ester.

- Mũi 1692 cm-1 : dao động liên kết C=C vòng thơm.

- Mũi 1436 cm-1 : dao động biến dạng bất đối xứng liên

keát –CH3

- Mũi 1373 cm-1 : dao động biến dạng đối xứng liên kết

–CH3

- Mũi 1192 cm-1 : dao động liên kết C-O.

IV.3.4.Phổ HPLC (Xem phụ lục 9).

Kết cho thấy độ mẫu : 84.34%

IV.3.5 Phoå NMR

Kết 1H-NMR(xem phụ lục 13, 14, 15).

Bảng : 1H-NMR cuûa Triacetyl Hesperetin.

3

- CH3 (3 x OAc)

- OCH3

H3a H3b H2 H8 H6 H5’ H2’ H6’

2.264 ( x 3H, s) 2.273 ( x 3H, s) 2.295 ( x 3H, s) 3.794 ( x 3H, s)

3.300 – 3.240 (1H, dd, J = 13Hz vaø J = 16.5Hz) 2.736 – 2.697 (1H, dd, J = 3Hz vaø J = 16.5Hz) 5.630 – 5.604 (1H, dd, J = 13Hz vaø J = 3Hz) 6.691 – 6.687 (1H, d, J = 2Hz)

6.875 – 6.871 (1H, d, J = 2Hz) 7.186 – 7.169 (1H, d, J = 8.5Hz) 7.304 – 7.300 (1H, d, J = 2Hz)

7.422 – 7.401 (1H, dd, J = 2Hz vaø J = 8.5Hz)

Kết 13C-NMR (xem phụ lục16, 17, 18)

Bảng 8: 13C-NMR củaTriacetyl Hesperetin.

Ví trí C Loại C Độ chuyển dịch hóa học ( , ppm )

- OCOCH3

- OCOCH3

3 - OCH3

2 10 5’ 2’ 6’ 1’ 3’ 4’

- CH3

C tứ cấp C = O

- CH2

- CH3

- CH - CH - CH - CH - CH - CH C tứ cấp C tứ cấp C tứ cấp C tứ cấp C tứ cấp

4 C tứ cấp C tứ cấp C = O

155.814 162.819 189.350

 Biện luận :

- Mẫu Triacetyl Hesperetin sau làm tinh có nhiệt độ nóng chảy 1350C Kết sắc ký lớp mỏng với dung môi khai triển :

n-butanol : acid acetic : H2O ( :1 :5 lấy phần trên) cho vệt tròn

màu vàng nâu

- Phổ UV-Vis có mũi hấp thu cực đại  = 261 nm  = 315 nm,

có băng II vùng (275 – 295 nm), băng I vùng (300 – 330 nm) đặc trưng cho hệ thống benzoyl cinamoyl vòng A B

Kết so sánh điểm chảy Triacetyl Hesperetin dùng nhận danh Triacetyl Hesperetin tài liệu :

Chất khảo sát Điểm chảy (0C)

Triacetyl Hesperetin / nhận danh 135  139

Triacetyl Hesperetin / tài liệu 139  141

- Phổ IR cho mũi hấp thu đặc trưng nhóm C=O, C=C C-H hợp chất hydrocacbon

+ nhoùm CH + nhoùm CH2

+ nhoùm CH3

- Kết phổ 1H-NMR cho thấy phân tử có 20 nguyên tử Hidro, gồm :

+ nguyên tử H vị trí H’

2, H’6, H’5, H8, H6 đặt trưng cho

C-H vòng thơm A, B

+ nguyên tử H nhóm - CH3 gốc ester

+ nguyên tử H nhóm –CH3 gốc ether

+ nguyên tử H nhóm –CH2 –

+ nguyên tử H nhóm – CH

- Kết phổ HPLC cho thấy độ mẫu : 84.34% Kết hợp kết T0

nc, UV-Vis, IR, HPLC, 1H-NMR, 13C-NMR cho

phép kết luận sản phẩm tổng hợp phù hợp công thức phân tử C22H20O9

Triacetyl Hesperetin Công thức cấu tạo Triacetyl Hesperetin tổng hợp sau :

O O O C O CH3 O C O H3C

O C O H3C

O CH3 H H H H H H H H 1 2 3 4 10 5 6

7 9 1'

V XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN. (xem phụ lục 19).

Chúng tơi tiến hành thử nghiệm tính kháng nấm kháng khuẩn Hesperidin, Hesperetin Triacetyl Hesperetin nhằm xác định so sánh hoạt tính sinh học sản phẩm Việc thử nghiệm tiến hành theo phương pháp đại Vanden Bergher Vlietlinck

Bảng : Kết xác định tính kháng nấm kháng khuẩn.

Vi khuẩn Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC : g/ml)

Hesperidin Hesperetin Triacetyl Hesperetin E.coli P aeruginosa B.subtilis S aureus ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) 25 ( - ) ( - ) 50 50

Nấm Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC : g/ml)

Hesperidin Hesperetin Triacetyl Hesperetin Nấ m mốc Asp.niger F.oxysporum ( - ) 50 ( - ) ( - ) ( - ) 50 ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) Naá m men C.albicans S.cerevisiae

 Nhận xét :

- Hesperidin kháng nấm F.oxysporum

Phaàn 4:

Trong năm gần đây, nhà khoa học giới Việt Nam tập trung ngiên cứu tìm kiếm loại thuốc chữa bệnh, phụ gia dùng thực phẩm, mỹ phẩm… có nguồn gốc từ thiên nhiên để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe cho người ngày nâng cao Trên sở đó, chúng tơi thực đề tài xuất phát từ vỏ qt, loại có sẵn trồng nhiều Việt Nam, tổng hợp nên số hợp chất để góp phần vào lĩnh vực nghiên cứu chữa bệnh Việt Nam

Qua trình nghiên cứu, chúng tơi có kết sau : Tách chiết Hesperidin, tiến hành thủy phân Hesperetin Quá trình

được thực với hiệu suất cao, sản phẩm tương đối tinh khiết (Hesperidin : 94.48%, Hesperetin : 98.14%)

2 Xác định điều kiện tối ưu để tổng hợp Hesperetin

3 Xác định điều kiện tối ưu để tổng hợp Triacetyl Hesperetin

4 Bằng phương pháp phân tích hóa lý đại đo nhiệt độ nóng chảy, UV, IR, HPLC, LC-MS, 1H-NMR, 13C-NMR xác định

được cấu trúc sản phẩm tổng hợp

5 Kết xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cho thấy : Hesperetin Triacetyl Hesperetin có hoạt tính mạnh so với Hesperidin

Đồng thời với kết này, tiếp tục phát triển nghiên cứu tổng hợp, thử nghiệm chuyên sâu hợp chất chiết xuất dẫn xuất chúng, khai tác tối ưu hoạt tính sinh học nhằm góp phần vào việc tổng hợp loại thuốc phòng chống, chữa trị bệnh nan y Việt Nam giới

Các kiến nghị cho nghiên cứu :

1 Tiếp tục nghiên cứu tổng hợp thêm số dẫn xuất khác từ Hesperetin từ vài flavonoid khác

2 Thử nghiệm thêm chủng vi khuẩn, vi nấm khác để có cách nhìn tổng quát hoạt tính sản phẩm Thử tác động loài động vật chuột, thỏ …

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu, Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, Nhà xuất Y học, 1985.

[2] Nguyễn Kim Phi Phụng, Các phương pháp nhận danh, trích ly, lập hợp chất hữu cơ, Học phần cao học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, 2000 - 2001

[3] Nguyễn Ngọc Hạnh, Tách chiết cô lập hợp chất tự nhiên, Giáo trình cao học, 2002

[4] Dược Điển Việt Nam III, NXB Y học, 2002.

[5] Đỗ Tất Lợi, Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, 2001

[6] Nguyễn Hương Thảo, Võ Văn Lẹo, Ngô Thu Vân, Trần Hùng, Khảo sát Flavonoid từ vỏ quít, Tạp chí Dược học - số 5/2001.

[7] Đái Duy Ban, Lữ thị Cẫm Vân, Đái Thị Ngân Hà, Đái Thị Hằng Nga, Phòng chống ung thư, NXB Y học, 1998.

[8] Nguyễn Đình Chức; Ngơ Tuấn Kỳ, Sách tra cứu hóa sinh, NXB Khoa học Kỹ Thuật, 1984

[9] Nguyễn Đức Minh, Tính kháng khuẩn Cây Thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, 1975

[10] Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ Vi sinh vật, Trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM,1996

[11] Nguyễn Đức Lượng, Phạm Minh Tâm, Vệ sinh an toàn thực phẩm, Đại học Kỹ Thuật Tp.HCM

[13] Davicco Marie-Jeanne (FR); Horcajada Marie Noelle (FR); Morad Christine (FR); Coxam Veronique (FR), Use of Hesperidin or one of its derivatives for Making a madicine for bone formation stimulation, Agronomique Inst Nat Rech (FR), 2004-01-08.

[14] Bok Song Hae (KR); Son Kwang Hee (KR); Jeong Tae Sook (KR); Kwon Byoung Mog (KR); Kim Young Kook (KR); Choi Doil (KR); Kim Sung Uk; Bae Ki Hwang Ingyu (KR); Moon Surk Sik (KR); Kwon Young Kook (KR); Ahn Jung Ah (KR); Lee Eun Sook (KR), Hesperidin and Hesperetin as 3- Hydroxy- 3- Methylglutaryl CoA (HMG-CoA) reductase inhibitor, Korea inst science technology (KR), 2004-03-25

[15] Hesperidin, www.phytochemicals.info/phytochemicals /hesperidin.php-8k-

[16] Hesperidin, www.nutritional-supplement-info.com/hesperidin.html-8k [17] Hesperidin, www.enzy.com/products/searchresults.asp?txtingred [18] Hesperetin,

www.pdrhealth.com/drug_info/nmdrugprofiles/nutsupdrugs/hes_0318.sht

ml-11k-

[19] Robert E.Wingard, Palo, Calif, Conversion of Hesperidin into Hesperetin, Pritchett et al., J Amer Chem Soc., 68, 2018 (1946) Looker et al., J Org Chem., 25, 1829 (1960)

[20] Song –Hae Bok (KR); Tae – Sook Jeong (KR); Myung Choi (KR), Hesperidin and Hesperetin as inhibitor of Acyl CoA cholesterol–o-acyltransferase, inhibitting the accumlation of macrophage-lipid complex on the arterial endothelium, and preventing or treating hepatic diseases in a mammal, Korea Inst Science Technology (KR), 2000–12-27.

[22] Miyake Toshio (JP); Yumoto Takashi(JP), Enzyme-reated Hesperidin, Producing the same and Methol of Using Enzyme-treated Hesperidin, Hayashibara Biochem Lab (JP), 1998-02-25

[23] Ji Young Kim, Kyung Jin Jung, Jae Sue Choi, Hae Young Chung, Hesperetin : a Potent Antioxidant Againt Peroxynitrite, Taylor & Francis, Volume 38, Number July, 2004

[24] Hiroshge Chiba, Mariko Uehara, Xinxiang Wang, Ritsuko Masuyama, Kazuharu suzuki, Kazuki Kanazawa, Yoshiko Ishimi, Hesperidin, a Citrus flavonoid, Inhibits Bone Loss and Decreases Serum and Hepatic Lipids in Ovariectomized Mice, The American Society for Nutritional Sciences J. Nutr.133:1892-1897, June 2003

[25] Warren Raphael (US); Akadiri Adebolat (US), Methods of Using Hesperetin for Sebum Control and Treatment of Acne, Procter and Gamble (US), 1996–12–24

Phaàn :

TÓM TẮT

Trên sở Hesperidin, loại flavonoid có nhiều loại cây, đặc biệt với hàm lượng lớn vỏ quít, loại có sẵn trồng nhiều Việt Nam, thủy phân Hesperetin Hesperetin loại flavonoid nghiên cứu nhiều giới tác dụng lên nhiều loại bệnh khác Để nâng cao hiệu sử dụng hợp chất thiên nhiên Việt Nam ngành y tế, tiến hành thực đề tài để tổng hợp vài dẫn xuất Hesperetin, xét nghiệm tính kháng nấm, kháng khuẩn chúng

Kết thực đề tài:

1 Tách chiết Hesperidin tổng hợp Hesperetin với hiệu suất cao, tương đối tinh khiết

2 Xác định điều kiện tối ưu để tổng hợp Hesperetin

3 Xác định điều kiện tối ưu để tổng hợp Triacetyl Hesperetin

4 Bằng phương pháp phân tích hóa lý đại đo nhiệt độ nóng chảy, UV, IR, HPLC, LC-MS, 1H-NMR, 13C-NMR xác định

được cấu trúc sản phẩm tổng hợp

5 Kết xác định họat tính kháng nấm, kháng khuẩn cho thấy: Hesperetin Triacetyl Hesperetin có hoạt tính mạnh so với Hesperidin

ABSTRACT

On the basis of Hesperidin, a type of flavonoid existing in a majority of plants, particularly in citrus skin, with high content which is present and grows in many locations in Vietnam, hydrolysis was realised to produce Hesperetin Hesperetin is also a type of flavonoid and is a substance on which many studies have been conducted worldwide because of its effect on many different diseases In order to improve the effectiveness of Vietnam natural compounds in the health sector, this research has been conducted to synthesize Hesperetin derivatives, to test their antibacterial and antifungal characteristics

Research results:

1 Hesperidin and Hesperetin were extracted and synthesized with high yield and in relatively high purity

2 Optimized conditions for the synthesis of Hesperetin were found Optimized conditions for the synthesis of Triacetyl Hesperetin were

found

4 Using physical chemistry analyses such as melting point, UV, IR, HPLC, LC-MS, 1H-NMR, 13C-NMR the synthesized products

structure was determined

5 The results of antibacterial and antifungal characteristics testing demonstrated that Hesperetin, Triacetyl Hesperetin has stronger antibacterial and antifungal activities than Hesperidin

LỜI CẢM ƠN

Con xin cảm ơn ba má, anh chị, người thân yêu nhất. Em xin chân thành cảm ơn :

- Thầy Nguyễn Cửu Khoa tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian thực luận án,

- Thầy Chu Phạm Ngọc Sơn, thầy Bùi Thọ Thanh, thầy Nguyễn Công Hào, cô Nguyễn Ngọc Sương thầy cô thuộc Viện Công nghệ Hóa học đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ em q trình học tập

- Phịng Quản Lý Khoa Học- Sau Đại Học Đại Học Cần Thơ, - Các thầy cô Hội đồng Bảo vệ Luận Án,

- Chị Hoàng Thị Kim Dung anh chị phịng Cơng nghệ Hữu cao phân tử – Viện Cơng nghệ Hóa học nhiệt tình bảo, giúp đỡ trong suốt thời gian làm luận án

Và tất bạn giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập và thực luận án.

BẢNG TÓM TẮT Q TRÌNH HỌC TẬP, CƠNG TÁC VÀ HOẠT ĐỘNG KHOA HỌC KỸ THUẬT

Họ Tên : NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM

Lớp : Cao học Hóa học Khóa : 2003

Ngày sinh : 07 / 08 / 1979 Nơi sinh : Quảng Nam

Cơ quan công tác :

Tốt nghiệp đại học : Cử nhân Sư phạm ngành Hóa học năm 2001 Trường Đại học Sư phạm Huế

Thời gian nơi công tác từ ngày trường đến :

2001-2002 : Giáo viên Trường PTTH Chu Văn An, Đại Đồng, Đại Lộc, Quảng Nam

TÓM TẮT QUÁ TRÌNH HỌC TẬP VÀ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Bồi dưỡng kiến thức nước (từ sau tốt nghiệp đại học) : Các cơng trình nghiên cứu có liên quan đến đề tài :

3 Luận văn cao học :

Tên đề tài : “ Tách chiết Hesperidin, tổng hợp Hesperetin, Triacetyl Hesperetin khảo sát hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn chúng ”

Cán hướng dẫn : Ts NGUYỄN CỬU KHOA – Viện Cơng nghệ Hóa học

Cần Thơ, ngày 18 tháng 10 năm 2005

Người khai

NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM

Ý kiến nhận xét đơn vị quản lý

Tổng số mơn học : mơn

Đã hồn thành chương trình học tập

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN

NHIEÄM VỤ LUẬN ÁN TÓM TẮT

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ DANH MỤC PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

Phần : TỔNG QUAN I FLAVONOID

I.1 Phân bố [1],[3]

I.2 Cấu trúc hóa học [1],[2],[3]

I.3 Phân loại flavonoid.[1],[3]

I.3.1 Flavon.

I.3.2 Flavanon.

I.3.4 Dihydroflavonon.

I.3.5 Chalcon.

I.3.6 Dihydrochalcon.

I.3.7 Auron.

I.3.8 Anthoxyanidin (2-phenylbenzo pyrilium).

I.3.9 Leucoanthoxyanidin.

I.3.10 Isoflavon. 10

I.3.11 Rotenoid. 10

I.3.12 Neoflavonoid. 11

I.3.13 Biflavonoid. 11

I.4 Vai trò Flavonoid.[1],[3] 12

I.4.1 Vai trò Flavonoid cây. 12

I.4.2 Vai trò flavonoid y hoïc. 12

II HESPERIDIN 17

II.1 Các loại có chứa Hesperidin 17

II.2 Cấu tạo Hesperidin.[8],[13],[15],[16] 18

II.3 Tính chất vật lý.[6],[8] 18

III HESPERETIN 22

III.1 Cấu tạo.[8],[18] 22

III.2 Tính chất vật lý.[6],[8] 22

III.3 Phản ứng điều chế.[19] 23

III.4 Ứng dụng Hesperetin. 23

IV TRIACETYL HESPERETIN.[8],[26] 25

IV.1 Cấu tạo 25

IV.2 Tính chất vật lý 25

IV.3 Điều chế 26

IV.4 Ứng dụng 26

V XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN 27

V.1 Các phương pháp định tính phát tính kháng khuẩn 27

V.1.1 Phương pháp trộn thuốc vào môi trường thạch.[9] 27

V.1.2 Phương pháp đục lỗ môi trường thạch. [9] 27

V.1.3 Phương pháp thấm giấy. [9] 27

V.1.4 Phương pháp ống trụ “Heatley”. [9] 28

V.1.5 Phương pháp đào rãnh Fleming (1932). [9] 28

V.1.6 Phương pháp viên nén Đặng Văn Ngữ (1956). [9] 28

V.1.7 Phương pháp thử chất kháng khuẩn bay hơi. [9] 29

V.1.8 Phương pháp sắc ký kháng khuaån. [9] 29

V.1.9 Phương pháp đại Vanden Benergher Vlietlinck (1994).[12 ] 30

V.2 Các loại vi khuẩn, vi nấm sử dụng để xác định hoạt tính.[10],[11] 30

V.2.1 Vi khuẩn. 30

V.2.2 Naám. 31

Phần : THỰC NGHIỆM NỘI DUNG NGHIÊN CỨU : 34

A PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

I LỰA CHỌN XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU 36

II TÁCH CHIẾT HESPERIDIN 37

II.1 Phương pháp điều kiện chiết Hesperidin 37

II.2 Tinh chế Hesperidin 39

III NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỔNG HỢP HESPERETIN 40

III.1 Điều kiện quy trình tổng hợp 40

III.2 Tinh cheá Hesperetin 42

IV NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỔNG HỢP TRIACETYL HESPERETIN 43

IV.1 Điều kiện quy trình tổng hợp 43

IV.2 Tinh cheá Triacetyl Hesperetin 45

VI XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN 46

B THỰC NGHIỆM 47

I LỰA CHỌN XỬ LÝ NGUN LIỆU 47

II TÁCH CHIẾT HESPERIDIN 47

II.1 Phương pháp điều kiện chiết tách Hesperidin 47

II.2 Tinh cheá Hesperidin 47

III NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỔNG HỢP HESPERETIN 47

III.1 Khảo sát trình tổng hợp Hesperidin thành Hesperetin 47

III.2 Tinh cheá Hesperetin 48

IV NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỔNG HỢP TRIACETYL HESPERETIN 50

IV.1 Khảo sát trình tổng hợp Hesperetin thành Triacetyl Hesperetin 50

IV.2 Tinh chế Triacetyl Hesperetin 50

V NHẬN DANH SẢN PHẨM 51

V.1 Nhận danh Hesperidin 51

V.1.1.Sắc ký lớp mỏng, đo nhiệt độ nóng chảy. 51

V.1.2 Xác định phổ UV–Vis. 51

V.1.3 Xác định phổ IR 51

V.1.4 Xác định phổ LC-MS. 52

V.2 Nhận danh Hesperetin 52

V.2.1 Sắc ký lớp mỏng, đo nhiệt độ nóng chảy. 52

V.2.2 Xác định phổ UV-Vis. 52

V.2.3 Xác định phổ IR. 52

V.2.4 Xác định phổ HPLC. 52

V.3 Nhận danh Triacetyl Hesperetin 52

V.3.1 Sắc ký lớp mỏng, đo nhiệt độ nóng chảy. 52

V.3.2 Xác định phổ UV–Vis. 52

V.3.3 Xác định phổ IR. 52

V.3.4 Xác định phổ HPLC. 52

V.3.5 Xác định NMR. 53

VI XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN 54

VI.1 Các loại vi khuẩn, nấm thử nghiệm 54

VI.2 Môi trường thử nghiệm 55

VI.3 Chất thử nghiệm 55

VI.4 Tiến hành khảo sát 55

Phần : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN I TÁCH CHIẾT HESPERIDIN 57

I.1 Tách chiết Hesperidin 57

I.2 Tinh cheá Hesperidin 57

II.1 Khảo sát trình tổng hợp 58

II.1.1 Khảo sát thời gian phản ứng. 58

II.1.2 Khảo sát lượng Methanol tham gia phản ứng. 59

II.1.3.Khảo sát lượng H2SO4 96% tham gia phản ứng 60

II.2 Tinh cheá Hesperetin 62

III NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỔNG HỢP TRIACETYL HESPERETIN 63

III.1 Khảo sát trình tổng hợp Hesperetin thành Triacetyl Hesperetin 63

III.1.1 Khảo sát thời gian phản ứng. 63

III.1.2 Khảo sát lượng (CH3CO)2O tham gia phản ứng. 65

III.1.3 Khảo sát lượng CH3COONa tham gia phản ứng. 66

III.2 Tinh cheá Triacetyl Hesperetin 68

IV NHẬN DANH SẢN PHẨM 69

IV.1 Nhaän danh Hesperidin 69

IV.1.1 Sắc ký lớp mỏng, T0 nc 69

IV.1.2 Phoå UV-Vis (Ethanol). 69

IV.1.3.Phoå IR. 69

IV.1.4 Phoå LC – MS :(xem phụ lục 7,10,11,12) 70

IV.2 Nhận danh Hesperetin 71

IV.2.1 Sắc ký lớp mỏng, T0 nc. 71

IV.2.2 Phoå UV-Vis (Methanol). 71

IV.2.3.Phoå IR 72

IV.2.4 Phổ HPLC.(phụ lục 8). 72

IV.3 Nhận danh Triacetyl Hesperetin 73

IV.3.1 Sắc ký lớp mỏng, T0 nc. 73

IV.3.2 Phoå UV-Vis (Methanol). 73

IV.3.3.Phoå IR. 74

IV.3.4.Phổ HPLC (Xem phụ lục 9) 74

IV.3.5 Phoå NMR. 74

V XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN (xem phụ lục 19) 78

Phần : KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Phổ UV-Vis Hesperidin 86

Phụ lục : Phổ UV-Vis Hesperetin 87

Phụ lục : Phổ UV-Vis Triacetyl Hesperetin 88

Phụ lục : Phổ IR cuả Hesperidin 89

Phụ lục : Phổ IR cuả Hesperetin 90

Phụ lục : Phổ IR cuả Triacetyl Hesperetin 91

Phụ lục : Phổ HPLC cuả Hesperidin 92

Phụ lục : Phổ HPLC cuả Hesperetin 93

Phụ lục : Phổ HPLC cuả Triacetyl Hesperetin 94

Phụ lục 10 : Khối phổ MS cuả Hesperidin 95

Phụ lục 11 : Khối phổ MS cuả Hesperidin 96

Phụ lục 12 : Khối phổ MS cuả Hesperidin 97

Phụ lục 13 : Phổ 1H-NMR cuả Triacetyl Hesperetin 98

Phụ lục 14 : Phổ cuả 1H-NMR Triacetyl Hesperetin 99

Phụ lục 15 : Dữ liệu phổ 1H-NMR cuả Triacetyl Hesperetin 100

Phụ lục 16 : Phổ 13C-NMR cuả Triacetyl Hesperetin 101

Phụ lục 17 : Phổ 13C-NMR cuaû Triacetyl Hesperetin 102

Phụ lục 18 : Dữ liệu phổ 13C-NMR cuả Triacetyl Hesperetin 103

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng : Kết khảo sát biến đổi Hesperidin thành Hesperetin theo thời gian

phản ứng 58

Bảng 2: Kết khảo sát biến đổi Hesperidin thành Hesperetin theo lượng Methanol tham gia phản ứng 59

Bảng : Kết khảo sát biến đổi Hesperidin thành Hesperetin theo lượng H2SO4 96% 61

Bảng : Kết khảo sát biến đổi Hesperetin thành Triacetyl Hesperetin theo thời gian phản ứng 63

Bảng : Kết khảo sát biến đổi Hesperetin thành Triacetyl Hesperetin theo lượng (CH3CO)2Otham gia phản ứng 65

Bảng : Kết khảo sát biến đổi Hesperetin thành Triacetyl Hesperetin theo lượng CH3COONa tham gia phản ứng 66

Bảng 7: 1H-NMR Triacetyl Hesperetin 74

Bảng 8: 13C-NMR Triacetyl Hesperetin 75

Bảng : Kết xác định tính kháng nấm kháng khuaån 78

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1: Sơ đồ nghiên cứu 35

Sơ đồ : Xử lý nguyên liệu 36

Sơ đồ : Quy trình chiết Hesperidin 38

Sơ đồ : Quy trình tinh chế Hesperidin 39

Sơ đồ : Quy trình thủy phân Hesperidin thành Hesperetin 41

Sơ đồ : Quy trình tinh chế Hesperetin 42

Sơ đồ 7: Quy trình tổng hợp Hesperetin thành Triacetyl Hesperetin 44

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị : Biểu diễn biến đổi khối lượng sản phẩm Hesperetin theo thời gian.

58

Đồ thị : Biểu diễn khối lượng sản phẩm Hesperetin theo lượng MeOH tham gia phản ứng 60

Đồ thị : Biểu diễn khối lượng sản phẩm Hesperetin theo lượng H2SO4 96% tham gia phản ứng 61

Đồ thị : Biểu diễn khối lượng sản phẩm Triacetyl Hesperetin theo thời gian 64

Đồ thị : Biểu diễn khối lượng sản phẩm Triacetyl Hesperetin theo lượng (CH3CO)2O tham gia phản ứng 65

Đồ thị : Biểu diễn khối lượng sản phẩm Triacetyl Hesperetin theo lượng xúc tác CH3COONa tham gia phản ứng 67

DANH MUÏC CÁC HÌNH Hình 1: Cấu trúc hóa học Hesperidin 18

Hình : Cơng thức cấu tạo Hesperetin 22

Hình : Cơng thức cấu tạo Triacetyl Hesperetin 25

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ Tên học viên : NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM Sinh ngày : 07 / 08 / 1979

Chuyên ngành : HÓA HỌC HỮU CƠ

I TÊN ĐỀ TAØI : “ Tách chiết Hesperidin, tổng hợp Hesperetin, Triacetyl Hesperetin xác định hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn chúng”

II NHIỆM VỤ VAØ NỘI DUNG : - Tách chiết Hesperidin, - Tổng hợp Hesperetin,

- Tổng hợp Triacetyl Hesperetin,

- Xác định hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn Hesperidin, Hesperetin Triacetyl Hesperetin

III NGAØY GIAO NHIỆM VỤ : 15 / 10 / 2004 IV NGAØY HOAØN THAØNH NHIỆM VỤ : / 11 / 2005

V HỌ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHÍNH : Ts NGUYỄN CỬU KHOA VI HỌ TÊN CÁN BỘ CHẤM NHẬN XÉT :

VII HỌ TÊN CÁN BỘ CHẤM NHẬN XÉT :

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CÁN BỘ NHẬN XÉT CÁN BỘ NHẬN XÉT

Nội dung đề cương luận văn Thạc Sĩ thông qua hội đồng chuyên ngành

Ngày tháng năm 2005 PHÒNG QLKH – SĐH

Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

-BỘ GIÁO DỤC VAØ ĐAØO TẠO

CHỦ NHIỆM NGÀNH CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

PHỊNG CƠNG NGHỆ HỮU CƠ CAO PHÂN TỬ

VIỆN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

Ts NGUYỄN CỬU KHOA

CAÙN BỘ CHẤM NHẬN XÉT :

CÁN BỘ CHẤM NHẬN XÉT :

Luận văn bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

www.nutritional-supplement-info.com/hesperidin.html-8k www.pdrhealth.com/drug_info/nmdrugprofiles/nutsupdrugs/hes_0318.shtml-11k-