Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)

Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa (Luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LA THỊ SINH NHÂN DỊNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PROTEIN AZURIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên, 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LA THỊ SINH NHÂN DỊNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PROTEIN AZURIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Trịnh Đình Khá Thái Nguyên, 2020 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn này, nhận nhiều giúp đỡ Thầy Cô, bạn bè người thân Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu, Phịng Đào tạo – QLKH&HTQT, Khoa Cơng nghệ Sinh học – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi qua trình học tập Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Trịnh Đình Khá, người Thầy tận tình bảo cung cấp cho kiến thức quý báu phương pháp nghiên cứu kiến thức chuyên ngành Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy Cô Hội đồng chấm luận văn đóng góp cho tơi nhiều ý kiến quý báu, đánh giá ghi nhận nỗ lực học tập Tôi xin cảm ơn hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Giáo dục Đào tạo “Nghiên cứu tạo chủng Escherichia coli sản xuất protein Azurin có hoạt tính ức chế tế bào ung thư vú”, mã số B2019-TNA-16 Thái nguyên, tháng 10 năm 2020 Học viên La Thị Sinh ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu giới protein azurin 1.2 Tình hình nghiên cứu protein azurin Việt Nam 1.3 Khái quát trực khuẩn mủ xanh (P aeruginosa) 1.3.1 Các tính chất sinh học 1.3.2 Các yếu tố độc lực 10 1.3.3 Sức đề kháng 12 1.3.4 Dịch tễ học 12 1.4 Tổng quan protein azurin 13 1.4.1 Sơ lược protein azurin 13 1.4.2 Cấu trúc gen azurin 14 1.4.3 Khả chống ung thư 16 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Vật liệu, trang thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 21 2.1.1 Chủng vi sinh vật plasmid 21 2.1.2 Thiết bị dụng cụ hóa chất 21 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Nuôi cấy vi sinh vật 23 2.3.2 Tách chiết ADN tổng số vi khuẩn 23 2.3.3 Điện di gel argarose 24 iii 2.3.4 PCR phân lập gen azurin 24 2.3.5 Phương pháp tạo dòng gen 25 2.3.6 Phương pháp giải trình tự gen 26 2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Tách chiết DNA tổng số chủng Pseudomonas 29 3.2 Phân lập gen azurin 30 3.3 Gắn gen vào vector nhân dòng chọn dòng 30 3.4 Phân tích trình tự gen azurin 32 3.4.1 Phân tích trình tự gen azurin chủng VTCC-B-657 32 3.4.2 Phân tích trình tự gen azurin chủng QN1 34 3.4.3 So sánh trình tự amino acid suy diễn 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 Kết luận 38 Đề nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleic triphosphate EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid ETA Exotoxin A HIV Human Immunodeficiency Virus kDa Kilo Dalton LB Luria and Bertani PCR Polymerase Chain Reaction PTD Miền tải nạp protein 10 TAE Tris – Acetic acid - EDTA 11 P aeruginosa Pseudomonas aeruginosa 12 NXB Nhà xuất v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng thí nghiệm 21 Bảng 2.2 Các dung dịch đệm sử dụng 22 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 25 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Cấu trúc protein azurin 15 Hình 1.2 Cơ chế azurin gây trình apoptosis ức chế phát triển tế bào ung thư người 17 Hình 2.1 Cấu trúc vector tách dịng pTZ57R/T 26 Hình 2.2 Hình ảnh mơ tả q trình giải trình tự hệ theo nguyên lý Sanger sử dụng ddNTP có đánh dấu huỳnh quang 28 Hình 3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số chủng nghiên cứu 29 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen azurin 30 Hình 3.3 Hình ảnh điện di plasmid tách chiết từ khuẩn lạc sau biến nạp 31 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt 32 Hình 3.5 Trình tự gen azurin chủng P aeruginosa VTCC-B-657 33 Hình 3.6 Hình ảnh kết so sánh trình tự gen azurin chủng P aeruginosa VTCC-B-657 phần mềm Blast 33 Hình 3.7 Trình tự gen azurin chủng QN1 34 Hình 3.8 Hình ảnh kết so sánh trình tự gen azurin chủng P aeruginosa QN1 phần mềm Blast 35 Hình 3.9 So sánh trình tự nucleotide gen azurin chủng VTCC-B-657, chủng QN1 với trình tự gen azurin P aeruginosa mã số M30389 GenBank 35 Hình 3.10 So sánh trình tự amino acid suy diễn protein azurin chủng VTCC-B-657, chủng QN1 với trình tự amino acid P aeruginosa mã số M30389 GenBank 37 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hiện nay, bệnh ung thư sức khoẻ cộng đồng vấn đề ngày quan tâm hầu hết quốc gia giới Bởi lẽ, ung thư nguyên nhân gây tử vong hàng đầu nước kinh tế phát triển nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ hai nước phát triển [27] Theo WHO, năm 2008 giới có 12,6 triệu người mắc ung thư, có 7,5 triệu người tử vong Năm 2015, có khoảng 90,5 triệu người bị ung thư Mỗi năm có 14,1 triệu ca mắc mới, tử vong 8,8 triệu ca (15,7%) Ở Mỹ nước phát triển tử vong ung thư chiếm khoảng 25% hàng năm có khoảng 0,5% dân số chẩn đoán ung thư [6], [20] Tính đến năm 2018, ước tính tồn giới có khoảng 18,1 triệu trường hợp ung thư (17 triệu không bao gồm ung thư da u ác tính) 9,6 triệu ca tử vong ung thư (9,5 triệu không bao gồm ung thư da không hắc tố) [18] Việt Nam số nước có tỉ lệ mắc ung thư cao giới, WHO xếp Việt Nam nằm 50 nước thuộc top đồ ung thư (50 nước cao thuộc top 1) Mỗi năm có khoảng 115.000 người chết ung thư, tương ứng 315 người/ngày Trong đó, ung thư vú với tỷ lệ mắc 15.000 ca/năm Tỷ lệ tử vong 35% 70% người bệnh đến khám giai đoạn muộn [6] Hiện nay, phương pháp điều trị ung thư chủ yếu sử dụng phương pháp hóa trị, xạ trị phẫu thuật Các liệu pháp điều trị ung thư nhà khoa học nghiên cứu Trong hoạt chất sinh học từ thực vật, vi sinh vật quan tâm nghiên cứu Trên giới nghiên cứu chứng minh hoạt tính chống ung thư azurin exotoxin A (ETA) từ Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa), Pep27anal2 từ Streptococcus pneumoniae, độc tố bạch hầu từ Corynebacterium diphtheriae, gần phát Entap từ Enterococcus sp [29] Các chất ngăn chặn trình tổng hợp protein gây trình tự chết tế bào ung thư Vào năm 2012, nhà khoa học Trung Quốc nghiên cứu đặc tính nhắm mục tiêu khối u E coli Nissle 1917 để ức chế khối u ác tính B16 chuột khối u vú 4T1 thông qua biểu protein azurin Kết họ chứng minh phát triển khối u ác tính B16 khối u vú 4T1 trực tiếp hạn chế đáng kể di phổi ngăn chặn chuột có khả miễn dịch [51] Việc nghiên cứu tách chọn dòng, biểu tinh protein azurin giúp người tiến đến gần việc nghiên cứu điều trị ung thư cách hiệu khơng gây hại đến tế bào bình thường khác Bởi lẽ, sản phẩm protein azurin từ chủng P aeruginosa chứng minh có khả đặc biệt nhắm vào tế bào ung thư mà không gây tác động có hại đến tế bào bình thường [43] Ở Việt Nam, nghiên cứu azurin gen mã hóa azurin chưa có cơng bố Chính vậy, tơi tiến hành thực đề tài “Nhân dịng phân tích trình tự gen mã hóa cho protein azurin từ số chủng P aeruginosa” Mục tiêu nghiên cứu Tách dòng gen mã hóa protein azurin từ chủng P aeruginosa để tiến hành tạo protein azurin tái tổ hợp ứng dụng ức chế tế bào ung thư vú Nội dung nghiên cứu  Tuyển chọn chủng P aeruginosa mang gen mã hóa azurin  Tách dịng gen mã hóa protein azurin từ chủng tuyển chọn  Phân tích trình tự gen mã hóa cho protein azurin 30 3.2 Phân lập gen azurin Để phân lập gen azurin từ chủng VTCC-B-657 QN1 phản ứng PCR cho sản phẩm đặc hiệu tiến hành phản ứng PCR với khn thiết kế dựa trình tự gen mã hóa protein azurin chủng P aeruginosa có mã số GeneBank M30389 Thành phần chu trình nhiệt phản ứng trình bày mục 2.2 Kết điện di sản phẩm PCR thể hình 3.2 Hình 3.2 cho thấy sản phẩm PCR xuất băng đặc hiệu, tương đối đậm rõ nét có kích thước khoảng 450 bp phù hợp với tính tốn lý thuyết Như vậy, cặp mồi đặc hiệu cao với chủng VTCC-B-657 QN1 Gen azurin chủng P aeruginosa phân lập khuếch đại phản ứng PCR Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen azurin 1: Đối chứng âm; 2: Sản phẩm PCR nhân gen azurin chủng VTCC-B-657; 3: Sản phẩm PCR nhân gen azurin chủng QN1; M: Maker 100bp 3.3 Gắn gen vào vector nhân dòng chọn dịng Để tách dịng xác định trình tự đoạn gen nhận sau phản ứng PCR, sản phẩm PCR tinh gắn vào vector pTZ57R/T xúc tác T4-ligase Hỗn hợp biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH10b phương pháp shock nhiệt để tạo plsamid tái tổ hợp 31 Sau trình biến nạp, tế bào vi khuẩn E coli chứa vector tái tổ hợp nuôi phục hồi dịch tế bào nuôi đĩa petri mơi trường LB đặc có bổ sung ampicillin 370C qua đêm để chọn lọc Trong môi trường chọn lọc theo lý thuyết tế bào mang vector sống môi trường chứa kháng sinh, tế bào không mang vector chết Một khuẩn lạc màu xanh vài dòng khuẩn lạc màu trắng xuất lựa chọn cách ngẫu nhiên ni vào mơi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin (nồng độ 100µl/ml), lắc qua đêm nhiệt độ 370C, 200 vịng/phút Sau tiến hành tách plasmid tái tổ hợp, tinh kiểm tra điện di gel agarose 0,8% Kết thể hình 3.3 đc Hình 3.3 Hình ảnh điện di plasmid tách chiết từ khuẩn lạc sau biến nạp 1-2: plasmid dòng khuẩn lạc trắng đĩa biến nạp chủng VTCC-B-657; 3-4: plasmid dòng khuẩn lạc trắng đĩa biến nạp chủng QN1; đc: đối chứng (plasmid tách từ dòng khuẩn lạc xanh) Kết hình 3.3 cho thấy dịch plasmid giếng mang phân đoạn chèn nên có kích thước lớn so với đối chứng Plasmid giếng khơng có đoạn chèn có kích thước tương đương với đối chứng Plasmid giếng cắt kiểm tra enzyme giới hạn HindIII XbaI Kết điện di sản phẩm cắt cho thấy xuất hai băng DNA Một băng có kích thước khoảng gần 3000 bp tương ứng với vector pTZ57R/T, băng có kích thước 500 bp tương ứng với kích thước gen azurin (hình 3.4) Như vậy, plasmid tái tổ hợp 32 mang phân đoạn gen azurin chèn vào Plasmid tái tổ hợp tinh gửi đọc trình tự nucleotide Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt 1: sản phẩm cắt HindIII XbaI dòng plasmid tái tổ hợp mang gen azurin chủng VTCC-B-657; 2: sản phẩm cắt HindIII XbaI dòng plasmid tái tổ hợp mang gen azurin chủng QN1; M: marker 1kb 3.4 Phân tích trình tự gen azurin 3.4.1 Phân tích trình tự gen azurin chủng VTCC-B-657 Kết đọc trình tự cho thấy, gen azurin chủng P aeruginosa VTCC-B657 có chiều dài 447 bp, kích thước với tính tốn lý thuyết thiết kế mồi (hình 3.5) phù hợp với nghiên cứu Nahi Yousif Yaseen cộng cơng bố trước nghiên cứu xuất loài Pseudomonas tác nhân gây bệnh viêm tai bệnh nhân Iraq [49] Tuy nhiên, Sarwar cộng lại cho kết khác, diện gen azurin phát 10 số 45 chủng phân lập từ đất với gen azurin có kích thước 545bp [41] Một nghiên cứu khác Đại học Calicut Ấn Độ cho kết tương tự thực phân lập gen azurin sản xuất chủng P aeruginosa địa xác nhận diện kỹ thuật phân tử, số 10 mẫu chọn cho nghiên cứu này, mẫu cho thấy diện gen azurin 545 bp [42] Gần vào đầu năm 2019, Hajar Mohammadi-Barzelighi cộng lại đưa kết gen azurin với thước 33 458 bp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn kháng khuẩn protein azurin tái tổ hợp từ Pseudomonas aeruginosa chống lại loài vi khuẩn khác [23] ATGCTACGTAAACTCGCTGCCGTATCCCTGCTGTCCCTGCTCAGTGCG CCGCTGCTGGCTGCCGAGTGCTCGGTGGACATCCAGGGTAACGACCAG ATGCAGTTCAACACCAATGCCATCACCGTCGACAAGAGCTGCAAGCAG TTCACCGTCAACCTGTCCCACCCCGGCAACCTGCCAAAGAACGTCATG GGCCACAACTGGGTACTGAGCACCGCCGCCGACATGCAGGGCGTGGTC ACCGACGGCATGGCTTCCGGCCTGCACAAGGATTACCTGAAGCCCGAC GACAGCCGCGTCATCGCCCACACCAAGCTGATCGGCTCGGGCGAGAAG GACTCGGTGACCTTCGACGTCTCCAAGCTGAAGGAAGGCGAGCAGTAC ATGTTCTTCTGCACCTTCCCGGGCCACTCCGCGCTGATGAAGGGCACC CTGACCCTGAAGTGA 54 108 162 216 270 324 378 432 447 Hình 3.5 Trình tự gen azurin chủng P aeruginosa VTCC-B-657 Sử dụng phần mềm Blast so với trình tự cơng bố GenBank, chúng tơi nhận thấy trình tự gen azurin mã hoá cho protein azurin chủng P aeruginosa VTCC-B-657 có độ tương đồng cao với số gen mã hóa protein azurin cơng bố Hình 3.6 Hình ảnh kết so sánh trình tự gen azurin chủng P aeruginosa VTCC-B-657 phần mềm Blast Phân tích trình tự phần mềm DNA star cho thấy trình tự nucleotide gen azurin chủng VTCC-B-657 có 97 nucleotide loại A (21,70%); 122 nucleotide loại G (27,29%); 76 nucleotide lại T (17,0%); 152 nucleotide loại C (34,0%) Số nucleotide loại A T chiếm 38,7% số nucleotide loại G C chiếm 61,3% Tỷ 34 lệ (A+T)/(G+C) 0,63 Trình tự nucleotide tương đồng 99,6% so với gen azurin chủng P aeruginosa (mã số GenBank: M30389), sai khác 02 nucleotide vị trí 180 (G→A) 265 (G→C) (hình 3.9) 3.4.2 Phân tích trình tự gen azurin chủng QN1 Kết đọc trình tự cho thấy, gen azurin chủng QN1 có chiều dài 447 bp, kích thước với tính tốn lý thuyết thiết kế mồi (hình 3.7) ATGCTACGTAAACTCGCTGCGGTATCCCTGCTGTCCCTGCTCAGTGCG CCGCTGCTGGCTGCCGAGTGCTCGGTGGACATCCAGGGTAACGACCAG ATGCAGTTCAACACCAATGCCATCACCGTCGACAAGAGCTGCAAGCAG TTCACCGTCAACCTGTCCCACCCCGGCAACCTGCCGAAGAACGTCATG GGCCACAACTGGGTACTGAGCACCGCCGCCGACATGCAGGGCGTGGTC ACCGACGGCATGGCTTCCGGCCTGGACAAGGATTACCTGAAGCCCGAC GACAGCCGCGTCATCGCCCACACCAAGCTGATCGGCTCGGGCGAGAAG GACTCGGTGACCTTCGACGTCTCCAAGCTGAAGGAAGGCGAGCAGTAC ATGTTCTTCTGCACCTTCCCGGGCCACTCCGCGCTGATGAAGGGCACC CTGACCCTGAAGTGA 54 108 162 216 270 324 378 432 447 Hình 3.7 Trình tự gen azurin chủng QN1 Sử dụng phần mềm Blast so với trình tự cơng bố GenBank, chúng tơi nhận thấy trình tự gen azurin mã hố cho protein azurin chủng QN1 có độ tương đồng cao với số gen mã hóa protein azurin cơng bố Phân tích trình tự phần mềm DNA star cho thấy trình tự nucleotide gen azurin chủng QN1 có 117 nucleotide loại A (26,16%); 137 nucleotide loại G (30,65%); 88 nucleotide lại T (19,69%); 105 nucleotide loại C (23,49%) Số nucleotide loại A T chiếm 45,86% số nucleotide loại G C chiếm 54,14% Tỷ lệ (A+T)/(G+C) 0,85 Trình tự nucleotide tương đồng 99,9% so với gen azurin chủng P aeruginosa (mã số GenBank: M30389), sai khác nucleotide vị trí 21 (G→C) (hình 3.9) 35 Hình 3.8 Hình ảnh kết so sánh trình tự gen azurin chủng P aeruginosa QN1 phần mềm Blast So sánh trình tự gen azurin chủng VTCC-B-657 với trình tự gen azurin chủng QN1 có độ tương đồng 99,3%, sai khác nucleotide vị trí 21 (G→C), 180 (C→A) 265 (G→C) (hình 3.9) Hình 3.9 So sánh trình tự nucleotide gen azurin chủng VTCC-B-657, chủng QN1 với trình tự gen azurin P aeruginosa mã số M30389 GenBank 36 3.4.3 So sánh trình tự amino acid suy diễn Protein azurin chủng VTCC-B-657 có 148 amino acid Mức độ tương đồng trình tự amino acid suy diễn protein azurin với trình tự amino acid suy diễn từ trình tự gen azurin GenBank từ 69,6-99,3% Trong tương đồng cao (99,3%) với trình tự amino acid suy diễn từ trình tự nucleotide có mã số M30389 chủng P aeruginosa Phân tích phần mềm Bioedit cho thấy thay đổi nucleotide vị trí 21 180 trình tự gen azurin chủng VTCC-B-657 khơng làm thay đổi amino acid, có thay đổi vị trí 265 làm thay đổi amino acid vị trí 89 (D→H) trình tự amino acid protein azurin so với trình tự amino acid suy diễn từ trình tự nucleotide có mã số M30389 (hình 3.10) Kết chúng tơi hồn tồn trùng khớp với nghiên cứu khác nhà khoa học Hàn Quốc nghiên cứu azurin tái tổ hợp từ P aeruginosa gây chết tế bào apoptotic tế bào ung thư biểu mơ vảy miệng, nhóm nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR nhân gen sử dụng vector pGEMT làm vector tái tổ hợp cho kết giải trình tự gen 447 bp trình tự amino acid suy diễn 148 amino acid [31] Tuy nghiên lại không trùng khớp với nghiên cứu trước Đại học Cơng nghệ Chalmers, họ nhân giải trình tự gen cấu trúc azurin P aeruginosa vùng phịng vệ Trình tự DNA dự đoán tiền protein với peptit tín hiệu 19 axit amin, protein azurin trưởng thành 128 axit amin [13] Hashimoto Wataru cộng năm 2015 lại có chút khác biệt, nghiên cứu dạng tiền chất azurin (148 amino acid) P aeruginosa tạo chuyển thành dạng trưởng thành (Paz, 128 amino acid) thông qua việc giải phóng peptide tín hiệu (20 amino acid) qua màng [24] Protein azurin chủng QN1 có 148 amino acid Mức độ tương đồng trình tự amino acid suy diễn protein azurin với trình tự amino acid suy diễn từ trình tự gen azurin GenBank từ 69,6-100% Trong tương đồng cao (100%) với trình tự amino acid suy diễn từ trình tự nucleotide có mã số M30389 chủng P aeruginosa Phân tích phần mềm Bioedit cho thấy thay đổi nucleotide vị trí 21 trình tự gen azurin chủng QN1 không làm 37 thay đổi amino acid protein azurin so với trình tự amino acid suy diễn từ trình tự nucleotide có mã số M30389 (hình 3.10) So sánh trình tự amino acid suy diễn chủng VTCC-B-657 chủng QN1 cho thấy có khác biệt chủng xảy vị trí 89 (D→H) trình tự amino acid protein azurin Như vậy, hai gen mã hóa azurin nhân dịng từ chủng P aeruginosa nghiên cứu có số lượng nuleotide với gen mã hóa azurin nhân dịng từ chủng P aeruginosa giới Khi phân tích khác biệt trình tự amino acid thấy vị trí 89 có thay đổi Aspartic (D) thành Histidine (H) so trình tự amino acid protein azurin nghiên cứu Carla cộng (1990) Sự thay đổi amino acid điện tích âm thành amino acid mang điện tích dương làm thay đổi cấu trúc protein hoạt tính sinh học protein azurin Hình 3.10 So sánh trình tự amino acid suy diễn protein azurin chủng VTCC-B-657, chủng QN1 với trình tự amino acid P aeruginosa mã số M30389 GenBank 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã tuyển chọn hai chủng vi khuẩn mang gen azurin quan tâm chủng P aeruginosa VTCC-B-657 chủng P aeruginosa QN1 Đã nhân dòng gen azurin mã hóa protein azurin từ chủng P aeruginosa VTCC-B-657 chủng P aeruginosa QN1 Trình tự nucleotide gen azurin chủng P aeruginosa VTCC-B-657 P aeruginosa QN1 có độ tương đồng 99,6% 99,9% so với gen azurin chủng P aeruginosa có mã số M30389 cơng bố GenBank Trình tự amino acid suy diễn protein azurin chủng P aeruginosa VTCC-B-657 P aeruginosa QN1 có độ tương đồng 99,3% 100% so với trình tự amino acid suy diễn từ gen azurin chủng P aeruginosa có mã số M30389 công bố GenBank Đề nghị (1) Nghiên cứu biểu gen azurin mã hóa protein azurin chủng P aeruginosa VTCC-B-657 chủng P aeruginosa QN1 hệ biểu E coli tạo aruzin tái tổ hợp (2) Tinh thử hoạt tính ức chế tế bào ung thư aruzin tái tổ hợp mơ hình tế bào mơ hình động vật 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bệnh viện quân y, (2015), "Pseudomonas aeruginosa, whitmore", Bệnh viện quân y 103 Trần Quang Cảnh, (2012), "Trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)" Hồ Huỳnh Thùy Dương, (1998), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục Gentis, (2018), Giải trình tự phương pháp Sanger, https://gentis.com.vn/giai-trinh-tu-bang-phuong-phap-sanger-d39 Nguyễn Hảo, "Vi Sinh", Academia Mai Xuân Khẩn, (2020), "Thực trạng cập nhật ung thư Việt Nam", Bệnh viện quân y 103 Nguyễn Vũ Trung, (2014), Vi sinh - Ký sinh trùng lâm sàng, NXB Y học Hà Nội Wikipedia, (2020), "Pseudomonas aeruginosa", https://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_aeruginosa Tiếng Anh Abd El-Hack Mohamed E , Abdelnour Sameh , Alagawany Mahmoud , Abdo Mohamed , Moustafa A Sakr, Asmaa F Khafaga, Samir A Mahgoub, Shaaban S Elnesr &Manar G Gebriel, (2019), "Microalgae in modern cancer therapy: Current knowledge", ScienceDirect, 111, 42-50 10 Arjunan Selvam, (2014), "Cloning 85A gene", International Journal of Pharma and Bio Sciences, 5, (2), 122-128 11 Arsenio M Fialho , Nuno Bernardes &Ananda M Chakrabarty (2016), "Exploring the anticancer potential of the bacterial protein azurin", AIMS Microbiology, 2, (3), 292-303 12 Arsenio M.Fialho, Fred J.Stevens, Tapas K.Das Gupta &Ananda M.Chakrabarty, (2007), "Beyond host-pathogen interactions: microbial defense strategy in the host environment", Current Opinion in Biotechnology, 18, (3), 279-286 40 13 Arvidsson Rolf H A, Nordling Margareta &Lundberg Lennart G, (1989), "The azurin gene from Pseudomonas aeruginosa", European Journal of Biochemistry, 179, (1), 195-200 14 Carvalho Estevens de Ana Teresa, (2011), Expression, purification and characterization of azurin derived peptides as target sequences for P-cadherin overexpressing breast cancer cells, Lisbon Technical University 15 Chaudhari Anita, Mahfouz Magdy , M Fialho Arsenio , Yamada Tohru , Granja Ana Teresa , Zhu Yonghua, Hashimoto Wataru , Schlarb-Ridley Beatrix , Cho Wonhwa , K Das Gupta Tapas &M Chakrabarty Ananda (2007), "Cupredoxin-cancer interrelationship: Azurin binding with EphB2, interference in EphB2 tyrosine phosphorylation, and inhibition of cancer growth", Biochemistry, 46, (7), 1799-1810 16 EdiGabellieri, Monica Bucciantini, MassimoStefani &PatriziaCionia, (2011), "Does azurin bind to the transactivation domain of p53? A Trp phosphorescence study", Biophysical Chemistry, 159, (2-3), 287-293 17 Fata Moradali, Shirin Ghods &Bernd Rehm, (2017), "Pseudomonas aeruginosa Lifestyle: A Paradigm for Adaptation, Survival, and Persistence", Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 7, (39), 18 Ferlay J, Colombet M, Soerjomataram I, Mathers C, Parkin D M, Piñeros M, Znaor A &Bray F, (2019), "Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods", International Journal of Cancer, 144, (8), 1941-1953 19 Gao Meng , Zhou Jingjing , Su Zhengding &Huang Yongqi (2017), "Bacterial cupredoxin azurin hijacks cellular signaling networks: Protein–protein interactions and cancer therapy", Protein Science, 26, (12), 2334–2341 20 Ghoncheh Mahshid, Pournamdar Zahra &Salehiniya Hamid, (2016), "Incidence and Mortality and Epidemiology of Breast Cancer in the World", Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 17, (S3), 43-46 41 21 Gizem Bor, Intan Diana Mat Azmi &Anan Yaghmur, (2019), "Nanomedicines for cancer therapy: current status, challenges and future prospects", Therapeutic Delivery, 10, (2), 113-132 22 Greta Lila, Gjyle Mulliqi, Lul Raka, Arsim Kurti, Rrezarta Bajrami &Elvir Azizi, (2018), "Molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosa in University Clinical Center of Kosovo", Infect Drug Resist, 11, 2039–2046 23 Hajar Mohammadi-Barzelighi , Bahram Nasr-Esfahani , Bita Bakhshi , Bahram Daraei , Sharareh Moghim &Hossein Faze, (2019), "Analysis of antibacterial and antibiofilm activity of purified recombinant Azurin from Pseudomonas aeruginosa", Iranian Journal of Microbiology, 11, (2), 166–176 24 Hashimoto Wataru, Ochiai Akhihito, Hong Chang Soo, Murata Kousaku &Chakrabarty Anada M, (2015), "Structural studies on Laz, a promiscuous anticancer Neisserial protein", Bioengineered, 6, (3), 141-148 25 Honda R, Tanaka H &Yasuda H, (1997), "Oncoprotein MDM2 is a ubiquitin ligase E3 for tumor suppressor p53", FEBS Lett, 420, (1), 25-7 26 Howarth S &Dedman M D, (1964), "Pigmentation variants of Pseudomonas aeruginosa", Journal of Bacteriology, 88, (2), 273-278 27 Jemal Ahmedin , Bray Freddie , Melissa M, Ferlay Jacques , Ward Elizabeth &Forman David (2011), "Global cancer statistics", CA: A Cancer Journal for Clinicians, 61, (2), 69-90 28 Kamalakannan Thirunavukkarasu, Rajagopal Kalayanaraman, Jothi Annamalai &Senthil STN, (2011), "Analysis of Azurin Protein from Different Pseudomonas sp Using Proteomic Tools", Journal of Communication and Computer, 8, (9), 727-730 29 Karpiński M Tomasz &Szkaradkiewicz K Anna, (2013), "Anticancer peptides from bacteria", Bangladesh Journal of Pharmacology, 8, (3), 343-348 30 Keyhanian Kianoosh, Ali Mansoori G &Rahimpour Mehdi, (2010), "Prospects for cancer nanotechnology treatment by Azurin", Dynamic biochemistry, Process biotechnology and Molecular biology, 4, (1), 48-66 42 31 Kim Uk-Kyu, Jeon Hyun-Jun, Lee Moo-Hyung &Kim Gyoo-Cheon, (2010), "Recombinant Azurin from Pseudomonas aeruginosa Induces Apoptotic Cell Death in Oral Squamous Carcinoma Cells", International Journal of Oral Biology, 35, (2), 35-42 32 Konrad Botzenhart &Gerd Doring, (1993), Ecology and Epidemiology of Pseudomonas aeruginosa, 33 Leckner Johan, (2001), Folding and Structure of Azurin - The Influence of a Metal., Chalmers University Of Technology 34 Leuschner, Carola, Hansel &William, (2004), "Membrane Disrupting Lytic Peptides for Cancer Treatments", Ingentaconnect, 10, 2299 - 2310 35 Mohamed Mervat S, Fattah Said A &Mostafa Howayada M, (2010), "Azurin as antitumor protein and its effect on the cancer cell lines", Current Research Journal of Biological Sciences, 2, 396-401 36 Nguyen C &Nguyen V D, (2016), "Discovery of Azurin-Like Anticancer Bacteriocins from Human Gut Microbiome through Homology Modeling and Molecular Docking against the Tumor Suppressor p53", Biomed Research Internatrional 37 Nguyen V D, Nguyen T T, Pham T T, Packianather M &Le C H, (2019), "Molecular screening and genetic diversity analysis of anticancer Azurinencoding and Azurin-like genes in human gut microbiome deduced through cultivation-dependent and cultivation-independent studies", Int Microbiol, 22, (4), 437-449 38 Ramachandran Sankar, Sarkar Siddik, Mazumadar Abhijit &Mandal Mahitosh, (2011), "Azurin synthesis from Pseudomonas aeruginosa MTCC 2453, properties, induction of reactive oxygen species, and p53 stimulated apoptosis in breast carcinoma cells", Journal of Cancer Science & Therapy, 3, (5), 104-111 39 Rita Bizzarri Anna, Santini Simona, Coppari Emilia, Bucciantini Monica, Agostino Di Silvia, Yamada Tohru, Beattie W Craig &Cannistraro Salvatore, (2011), "Interaction of an anticancer peptide fragment of azurin with p53 and 43 its isolated domains studied by atomic force spectroscopy", International Journal of Nanomedicine, 6, 3011–3019 40 Sambi Manpreet, Bagheri Leila &Szewczuk Myron R (2019), "Current Challenges in Cancer Immunotherapy: Multimodal Approaches to Improve Efficacy and Patient Response Rates", Journal of Oncology, 2019, 4508794 41 Sarwar &Fahim, (2018), "Molecular detection of anticancer protein Azurin in native Pseudomonas isolates", BRAC University, 42 Sereena M C &Sebastian Denoj (2015), "Molecular Detection of Azurin: A Powerful Anticancer Protein from Native Pseudomonas Isolates", Journal of Avances in Medical and Pharmaceutical Science, 5, (1), 1-7 43 Sereena M C &Sebastian Denoj, (2020), "Evaluation of Anticancer and Antihemolytic Activity of Azurin, a Novel Bacterial Protein from Pseudomonas aeruginosa SSj", International Journal of Peptide Research and Therapeutics, 26, (1), 459-466 44 Shahrouz Taranejoo, Mohsen Janmaleki, Mohammad Rafienia, Mahdi Kamali &Maysam Mansouri, (2011), "Chitosan microparticles loaded with exotoxin A subunit antigen for intranasal vaccination against Pseudomonas aeruginosa: An in vitro study", Carbohydrate Polymers, 83, (4), 1854-1861 45 Susan Marqus, Elena Pirogova &Terrence J Piva, (2017), "Evaluation of the use of therapeutic peptides for cancer treatment", Journal of Biomed Science, 46 Vasil Michael L, (1986), "Pseudomonas aeruginosa: Biology, mechanisms of virulence, epidemiology", The Journal of Pediatrics, 108, (5), 800-805 47 Xiao Yu-Feng, Jie Meng-Meng, Li Bo-Sheng, Hu Chang-Jiang , Xie Rui, Tang Bo &Yang Shi-Ming (2014), "Peptide-Based Treatment: A Promising Cancer Therapy", Journal of Immunology Research, 2015, 48 Yamada Tohru, Goto Masatoshi, Punj Vasu, Zaborina Olga, Chen Mei Ling, Kimbara Kazuhide, Majumdar Dibyen, Cunningham Elizabeth, Gupta Das Tapas K &Chakrabarty Ananda M, (2002), "Bacterial redox protein azurin, tumor suppressor protein p53, and regression of cancer", PNAS, 99, (22), 14098-14103 44 49 Yaseen Nahi Yousif &Edan Dawood Salim, (2014), "Studying the Incidence of Pseudomonas Species as A Causative Agent of Otitis in Iraqi Patients", AlMustansiriyah Journal for Pharmaceutical Sciences, 14, (1), 136-142 50 Yehia A Osman , Douaa R El-Deep &Sadia A Younis (2013), "Azurin: A Powerful Anticancer from "A" Local", Journal of American Science, 9, (12), 755-764 51 Zhang Yunlei, Zhang Youming, Xia Liqiu, Zhang Xiangli, Ding Xuezhi, Yan Fu &Wu Feng, (2012), "Escherichia coli Nissle 1917 targets and restrains mouse B16 melanoma and 4T1 breast tumors through expression of Azurin protein", Applied and Environmental Microbiology, 78, (21), 7603-7610 ... chọn dòng 30 3.4 Phân tích trình tự gen azurin 32 3.4.1 Phân tích trình tự gen azurin chủng VTCC-B-657 32 3.4.2 Phân tích trình tự gen azurin chủng QN1 34 3.4.3 So sánh trình. .. dịng phân tích trình tự gen mã hóa cho protein azurin từ số chủng P aeruginosa? ?? Mục tiêu nghiên cứu Tách dịng gen mã hóa protein azurin từ chủng P aeruginosa để tiến hành tạo protein azurin tái... nghiên cứu  Tuyển chọn chủng P aeruginosa mang gen mã hóa azurin  Tách dịng gen mã hóa protein azurin từ chủng tuyển chọn  Phân tích trình tự gen mã hóa cho protein azurin 3 CHƯƠNG TỔNG QUAN