Đang tải... (xem toàn văn)
Nhiệt độ nuôi các loài Beauveria thường thấp hơn so với Metarhizium Sản xuất như trên nhưng conidia tạo thành dưới dạng phần đầu tròn dính.. Sử dụng trong nhà kính.[r]
(1)1
VI.3
(2)2
Phân lập virus diệt côn trùng Thu mẫu côn trùng bệnh
Nghiền, lọc bã
Nước cất
Ly tâm 500v/ph trong phút
Thu dịch Ly tâm 2500v/ph trong 15 phút Thu cặn
Ly tâm 10000v/ph trong 60 phút Thu cặn trắng
chứa thể vùi
(3)3
Sản xuất virus
Sản xuất in vitro
Sản xuất in vivo
Tìm ký chủ sâu ngoài đồng để
sản xuất
Nuôi ký chủ sâu PTN Nuôi
dòng tế bào sâu
(4)4
Phương pháp thủ công SX chế phẩm NPV cho nơng dân Thu sâu hại tuổi trung bình khoẻ
ngồi ruộng
Ni dụng cụ gia đình xơ, chậu, thúng…
Nơi thống mát, thức ăn tươi
Khi sâu đạt tuổi – 4 tiến hành nhiễm virus
Nghiền, lọc phun trên đồng ruộng
Ủ bệnh khoảng – ngày trong bình thuỷ tinh tối màu
Nguồn virus tinh
Sau khoảng – ngày
(5)5
Phương pháp nuôi sâu chủ PTN
Để trứng đẻ hàng ngày vào điều kiện ơn, ẩm độ thích hợp đến trứng nở sâu non.
Bắt sâu xanh ruộng chọn sâu non tuổi - 5 Nuôi cá thể trên môi trường thức ăn nhân tạo
Ghép cặp bướm vũ hoá – ngày (10 đực + 10 cái)
Nuôi lồng điều kiện gần với tự nhiên
Dịch virus 107 PIB/ml trộn vào
thức ăn nhân tạo
(có aga khơng có aga) Ni sâu non thức ăn nhân tạo
tới độ tuổi
Thu hồi chế phẩm
Sau giao phối – ngày Thu trứng hàng ngày trong thời gian – ngày Nuôi sâu chết
T = 28 – 30oC, W > 80%, t = – ngày
Nuôi sâu non thức ăn nhân tạo tới vào nhộng vũ hố
(vịng đời khoảng 30 – 35 ngày)
Ghép cặp bướm vũ hoá 1 – ngày (10 đực + 10 cái)
(6)6
Thu hồi chế phẩm Đối với chế phẩm dùng ngay
Thu nhặt sâu chết cho vào dụng cụ tối màu, giữ nhiệt độ thấp. Nghiền nhỏ sâu chết: tỷ lệ nước/ sâu = 3/1.
Lọc qua vải mỏng thu hồi dịch Bổ sung phụ gia để sấy phun
Đối với chế phẩm bảo quản lâu dài
Nghiền nhỏ sâu chết: tỷ lệ nước/ sâu = 3/1. Lọc qua vải mỏng thu hồi dịch
Ly tâm 10.000 – 20.000 vòng/phút, – 15 – 20 phút thu hồi tinh thể trắng
Kiểm tra dếm số lượng PIB để đưa tạo chế phẩm Tạo chế phẩm:
CP dạng dịch thể: Bổ sung chất bám dính, chất chống thối,
kháng sinh, chất chống tia tử ngoại… đóng chai tối màu để bảo quản.
CP dạng bột: Bổ sung chất bột chất phụ gia, sấy phun
(7)7
Tiêu chuẩn hoá chế phẩm
Kiểm tra chất lượng chế phẩm:
Kiểm tra nồng độ thể vùi hoạt tính sinh học
Đóng gói sản phẩm:
Đóng chai; đóng gói; dán nhãn ghi rõ ngày SX, hoạt lực, hạn sử dụng, hướng dẫn sử dụng
Các tiêu cần đạt sản phẩm
Chế phẩm dạng dịch thể:
107 – 108 PIB/ml, thời gian bảo quản – 12 tháng, HQDS 70 –
100% sau – 10 ngày phun.
Chế phẩm dạng bột:
108 – 109 PIB/gram, HLÂ – 10%, thời gian bảo quản – 12
(8)8
Sản xuất chế phẩm bột kỹ thuật LdMNPV nuôi in vivo
Thành phần Phần trăm (w/w) Vai trò
LdMNPV 14-18 Tác nhân diệt
sâu
Mảnh xác sâu 82-86 Tác nhân trơ
Tiến hành:
1 Trứng sâu bướm nuôi PTN giữ 6ºC 150 ngày để hồn tất vịng đời phát triển.
2 Rửa trứng (trong dung dịch formalin 10% v/v), tráng kỹ cho 10-15 trứng vào cốc thức ăn thể tích 6oz
(9)9
3 Ấu trùng sâu nở giữ 14 ngày 26ºC phịng lọc khí
4 Khi ấu trùng đạt đến đầu giai đoạn IV, bổ sung vào cốc 1ml dịch chứa 5x10 thể vùi virus/ml giữ 29ºC
5 Thu lấy ấu trùng sâu (có tỷ lệ chết > 70%) sau 14 ngày ủ giữ -20ºC cho đến sử dụng
6 Ấu trùng đông lạnh rã đơng 24 4ºC, sau nghiền (1,0 g ấu trùng : ml nước cất) nồng độ cao 10 giây để giải phóng thể vùi virus
7 Xác sâu nghiền sàng qua máy nghiền rung để loại bỏ mảnh xác sâu lớn
8 Ly tâm dịch liên tục 60l/h vận tốc 15500 rev/phút 9 Lấy phần chất rắn trải lên khay đông lạnh -35ºC
10.Sấy đông khô phần chất rắn 24-36 nghiền thành bột mịn (độ ẩm 3-4%) chứa khoảng 15% (w/w) OV
11.Kiểm tra chất lượng vi sinh sản phẩm thu trước đóng gói kín
(10)10
VI.4
(11)11
Một số loài nấm diệt sâu (theo thứ tự quan trọng)
Loài nấm Đặc điểm
Hyphomycetes
Beauveria (bạch cương) Metarhizium (lục cương) Paecilomyces
Verticillium Hirsutella Nomurea Aschersonia Tolypocladium, Culicinomyces
Bào tử conidia dễ dàng tạo môi trường rắn, blastospore môi trường lỏng Nhiệt độ ni lồi Beauveria thường thấp so với Metarhizium Sản xuất conidia tạo thành dạng phần đầu trịn dính Sử dụng nhà kính. Khó sản xuất loại nấm Không tạo conidia môi trường lỏng
Entomophthorales Entomophthora
(12)12
Phân lập tuyển chọn chủng có hoạt tính cao diệt côn trùng
Nguyên tắc chung
Có phổ diệt sâu khơng q hẹp, phải khơng gây bệnh
cho lồi có lợi.
Có khả tạo bào tử cao.
Có nhu cầu dinh dưỡng đơn giản.
Các chủng tái tổ hợp có độ ổn định khả tạo bào tử cao.
Thu thập côn trùng xác côn trùng
Thu thập côn trùng chết bị bệnh nấm đồng ruộng,
hồ, sông, rừng…
(13)13
Môi trường phân lập
Môi trường lựa chọn phù hợp với lồi; Mơi trường đặc bổ sung khoảng 2% agar
Môi trường nước mắm pepton
Pepton 10g
Nước mắm hay xì dầu20ml Nước sạch 1000ml
Mơi trường nước mạch nha
1kg bột mầm đại mạch (mầm lúa) + lít nước đường hố 60oC + 03 lịng
trắng trứng; đun sơi; lọc lấy dịch thu môi trường Bx = 10,8; d = 1,043.
Môi trường Sabouroud Dextrose Agar Yeast (SDAY)
Pepton 10g Dextrose 40g
Cao men 2g Agar 20g
Nước sạch 1000ml pH = 6,5
Môi trường Czapek - Dox
Sacarose 30g NaNO3 2g
K2HPO4 1g MgSO4.7H2O 0,5g
KCl 0,5g FeSO4 0,01g
Nước sạch 1000ml
(14)14
Phân lập bào tử
Phương pháp mưa bào tử
• Xác CT nhấn chìm etanol 60-70%, t = 15 phút, chuyển sang DD natrihypoclorit, rửa nước cất.
• Đặt CT lên mảnh giấy lọc thấm nước. •Dán giấy lọc lên đáy nắp hộp đĩa petri. •Lập úp nửa hộp lên MT chứa SDAY. •Bào tử rơi xuống phát triển.
•Thu thập bào tử theo thời gian.
Phương pháp bào tử bay
• Thu xác CT đặt lên mảnh giấy lọc thấm nước.
• Đặt CT lên.
• Đặt giấy lọc vào hộp đĩa petri.
(15)15
Bảo quản chủng giống nấm diệt côn trùng
Bảo quản thạch – tuần, sau giữ
lạnh T = – 6oC – tháng cấy truiyền lại Thòi
gian bảo quản hạn chế.
Bảo quản nhiệt độ lạnh sâu – 20oC, - 80oC, - 120oC
Bảo quản lâu dài.
Phương pháp hút bào tử máy hút chân không,
sau giữ tủ lạnh Bảo quản vài năm.
Phương pháp đông khô VSV Bảo quản –
(16)16
Sản xuất vi nấm
Trên môi trường rắn
Trên môi trường lỏng
conidia blastospore
• Dạng bào tử tự nhiên nấm
Hyphomycetes.
• Được phát tán nhờ gió mưa. • Bền dễ phát tán nhất.
• Tế bào kiểu nấm men.
• Xâm nhiễm nẩy mầm nhanh
bào tử trần.
• Nhạy cảm với điều kiện mơi
(17)17
ống thạch
nghiêng Bình Δ
Thiết bị
lên men Giống
Hệ sợi nấm tạo blastospore
Túi plastic đựng mơi trường
thổi khí
Ly tâm thu sinh khối
Sấy
Tạo chế phẩm bột thấm ướt
Bảo quản
Phun
Hệ sợi tạo conidia
Thu hồi sấy
Bảo quản với chất hút ẩm
Phối trộn cánh đồng
Phun
(18)18
Nhân giống
Nhân giống cấp 1
Môi trường Sabouroud bổ sung thêm khống chất MgSO4.7H2O KH2PO4.
Ni cấy T = 25 – 27oC 24 giờ.
Nhân giống cấp 2
Phương pháp lên men chìm
• Mơi trường cao nấm men
Cao nấm men Pepton
KH2PO4 MgSO4.7H2O
pH = 6,0 nước sạch
• Mơi trường SDAY
Pepton 10g Dextrose 40g
Cao nấm men 2g Agar 20g
pH = 6,5 nước sạch
Phương pháp lên men xốp
Bột cám gạo Bột ngô
Bột đậu tương (đậu xanh) Trấu (bã mía; vỏ lạc)
Nước sạch
(19)19
Lên men môi trường lỏng
Lên men hai giai đoạn
Đầu tiên nấm phát triển môi trường lỏng, sau đó:
Nấm phát triển mơi trường lỏng
Lên men môi trường bán rắn
Cấy bào tử chất rắn để thu bào tử trần
Trải lên khay để tạo bào tử trần
Trộn với chất rắn để tạo bào tử trần
(20)20
Sản xuất môi trường lỏng
Thiết bị có khuấy (stirred tank)
Đảo trộn mãnh liệt mơi trường.
Đồng hố tốt canh trường, hệ số chuyển khí cao. Tránh đóng tụ hệ sợi tạo thành bánh sợi.
Làm thương tổn hệ sợi va đập học.
Thiết bị tháp (tower)
Tỷ lệ chiều cao đường kính lớn 6m.
Đảo trộn mơi trườngnhờ hệ thống bơm khí từ đáy thiết bị. Nấm tạo thành hệ sợi tụ lại thiết bị.
Thích hợp với loại nấm có tiếp hợp
Thiết bị lên men dạng vòng (loop fermenter)
(21)21
Tiến hành:
1 Lên men ngày môi trường lỏng có thổi khí 2 Hạ nhiệt độ xuống 5-10ºC
3 Ly tâm (> 10000g, < 35ºC) để thu dịch sệt chứa khoảng 22% chất rắn Khuấy trộn thùng lên men
4 Lấy mẫu để xác định lượng bào tử thông số khác
5 Bổ sung bột oxít theo tỷ lệ 1:1 (Clarcel Flo, Wessalon S) vào bột nhão nhào trộn thiết bị đảo trộn
6 Với kg bột bổ sung 250ml paraffin lỏng + 250ml dung dịch saccharoza 80% + mì theo tỷ lệ 2% Đảo trộn lại đến thu bột mịn < 350C
7 Sấy lớp mỏng buồng sấy có thổi gió ≤ 25ºC đến độ ẩm ≤ 7% 8 Lấy mẫu để xác định độ ẩm lượng bào tử
9 Bổ sung chất dinh dưỡng cho nấm (bột ngũ cốc) đủ để có hàm lượng bào tử cần để thương mại hóa
10 Có thể bổ sung Bevaloid 116 (2%) làm chất phân tán Surfynol 104S (2%) làm chất thấm ướt phải sau yên tâm ảnh hưởng chất đến VSV
(22)22
Tạo chế phẩm bột thấm ướt từ blastospore
Thành phần Phần trăm (%) Vai trò
Bào tử thu sau ly
tâm 22 Tác nhân sinh học
Clarcel Flo 2,2 Chất chống vón
Paraffin lỏng 19,9 Chống oxi hóa Labrafil
(polyoxyethylene glyceryl
monooleate)
2,1 Chống oxi hóa
Saccharoza 22 Bảo vệ tế bào
Na glutamate 2 Bảo vệ tế bào
Bột ngũ cốc 25,8 Chất mang, chất dinh dưỡng
Bevaloid 116 2 Chất phân tán
(23)23
Sản xuất môi trường bán rắn
• Mơi trường lên men
– Cơ chất thường hạt ngũ cốc nghiền nhỏ (gạo tốt nhất).
– Bổ sung nước để có độ ẩm cần thiết: tăng diện tích tiếp xúc, tăng
lượng khí lưu giữ.
– Bổ sung CaSO4 CaCO3: tăng pH chống dính hạt.
– Tiệt trùng nhiệt.
• Ni cấy
– Túi plastic có lỗ kích thước <0,4mm: thơng khí (25cm3/cm2/phút
1at); thơng nước (500g/m2/24h 23oC RH 50%).
– Thơng gió làm mát phòng.
– Độ ẩm RH túi khoảng 100% đảm bảo tốt để tạo bào tử.
• Thu hồi bào tử
– Khơng mở túi để thu hồi dễ lây nhiễm VSV.
– Thổi gió thiết bị tầng sơi thu bào tử sau qua
cyclon phân tách/ không cần phân tách phần tế bào nấm chất rắn.
– Bào tử thu hồi sấy, nghiền nhẹ sàng đưa vào bảo quản, vận
(24)24
Tiến hành:
1 Nhân giống ngày 150 rpm 24ºC Kiểm tra nhiễm tạp kính hiển vi và trang hộp thạch
2 Ngâm kiều mạch 24 giờ
3 Chắt nước nghiền kiều mạch với 5% CaCO3 5% CaSO4 máy đảo trộn quay (drum mixer)
4 Thanh trùng túi nuôi nấm 400g kiều mạch 120ºC 40 phút Làm nguội Kiểm tra nhiễm tạp vi sinh vật cách đặt vài hạt ngũ cốc lên mặt thạch 5 Sau làm nguội xuống 35ºC cấy vô trùng vào túi 70 ml dịch giống, sau hàn
nhiệt túi lại Đảo trộn giống phân bố đồng
6 Ủ túi 14 ngày 25-30ºC (đặt chế độ ổn nhiệt) Thổi khí phịng tuần để giảm độ ẩm làm khô hạt giúp kích thích tạo bào tử Đảo túi định kỳ để tránh đóng bánh khối mơi trường
7 Để thu hồi bào tử cho phần môi trường sau lên men vào máy phân tách tầng sôi sau khi loại bỏ túi bị nhiễm
8 Trải bào tử thành lớp mỏng khay sấy đến độ ẩm < 6%, định kỳ kiểm tra độ ẩm Tránh tạo thành điểm ẩm cục thổi khí khơng đủ phịng
9 Sàng qua lỗ 100µm Năng suất thu khoảng kg bào tử (1-5 x 10 bào tử/g hạt khô)
10 Trộn với bột oxit silic10% bảo quản túi đen không thấm nước 4-10ºC Nên bào quản chân không
(25)25
Sản xuất chế phẩm bột kỹ thuật
Thành phần Tính cho mẻ kg Vai trị
Dịch cao nấm men-saccharoza
(mỗi thứ 30g/l)
500 ml Môi trường nhân giống
Kiều mạch 4 kg Môi trường dinh dưỡng nuôi bán
rắn Túi nuôi nấm
35 x 22 x 0,1 cm
10 Túi để nuôi bán rắn
Bột CaCO3 200 g Làm tăng pH
Ngăn hạt đóng dính
Bột CaSO4 200 g
Bột silica gel, Gasil GM2 10% w/w
bổ sung vào bào tử
Hút ẩm Thùng PE sẫm mầu
(chiều dầy 0,001 inches)
(26)26
Sản xuất môi trường rắn
Các dạng thiết bị lên men
• Thiết bị dạng khay
– Nhiều khay chứa môi trường.
– Nhiệt độ độ ẩm điều chỉnh cách bổ sung nước môi trường
– Nhược điểm: chu trình kéo dài (3 – tuần) nên nguy nhiễm cao Sử dụng môi trường hiệu quả.
• Thiết bị lên men đảo trộn
– Môi trường lên men đảo trộn nhiều biện pháp. – Nhiệt độ mơi trường kiểm soát được
– Ưu nhược điểm: đồng môi trường tốt độ sáng lại thấp hơn.
• Thiết bị lên men plastic