Nội dung nghiên cứu bao gồm phân lập các chủng nấm mốc từ men rượu cổ truyền, khảo sát khả năng sinh enzyme amylase, khảo sát khả năng đường hóa, đánh giá ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase, định danh chủng nấm mốc phân lập được theo các phương pháp được mô tả bởi Xu-Cong & cs., 2012; Scheherazed & cs., 2016; Samson & Hoekstra, 2002.
Vietnam J Agri Sci 2021, Vol 19, No 3: 322-330 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2021, 19(3): 322-330 www.vnua.edu.vn ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC PHÂN LẬP TỪ BÁNH MEN RƯỢU THANH HOÁ Nguyễn Huy Thuần1, Lê Thị Hạnh2, Trần Đăng Khánh3, Nguyễn Văn Giang2* Trung tâm Sinh học Y - Dược, Trường Y - Dược, Đại học Duy Tân Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Viện Di truyền Nông nghiệp * Tác giả liên hệ: nvgiang@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 18.05.2020 Ngày chấp nhận đăng: 10.08.2020 TĨM TẮT Thí nghiệm tiến hành với mục đích tìm chủng vi nấm từ mẫu bánh men rượu thu Nga Sơn Hậu Lộc (Thanh Hố) có khả đường hố cao sinh trưởng tốt điều kiện bình thường để tăng suất rượu, rút ngắn thời gian ủ trình sản xuất rượu Nội dung nghiên cứu bao gồm phân lập chủng nấm mốc từ men rượu cổ truyền, khảo sát khả sinh enzyme amylase, khảo sát khả đường hóa, đánh giá ảnh hưởng điều kiện ni cấy đến khả sinh enzyme amylase, định danh chủng nấm mốc phân lập theo phương pháp mô tả Xu-Cong & cs., 2012; Scheherazed & cs., 2016; Samson & Hoekstra, 2002 Kết thí nghiệm phân lập 17 chủng nấm mốc có khả thuỷ phân tinh bột, hoạt độ amylase từ 2,0 đến 4,5 U/ml Trong số chủng nấm mốc NS1.1 HL2 tạo dịch rỉ đường nhanh nhiều khối nếp ủ Hàm lượng đường dịch thu từ khối ủ cơm rượu với chủng NS1.1 đạt 7,02µM, với chủng HL2 đạt 6,18µM Nhiệt độ thích hợp cho chủng nấm tuyển chọn biểu hoạt tính dao động từ 25-35C, tốt 30C Kết so sánh trình tự nucleotide 18S rRNA cho thấy chủng 1,1 có độ tương đồng 99% với chủng Rhizopus oryzea 150138 đặt tên Rhizopus oryzae NS1.1 Từ khố: Bánh men rượu, enzyme amylase, q trình đường hoá, nấm mốc, Rhizopus sp Characterization of Fungal Strains Isolated from Alcoholic Fermentation Starters of Nga Son, Thanh Hoa Province ABSTRACT This experiment was conducted to find the fungal strains with high saccharification activity isolated from the alcohol fermentation starters collected in Nga Son, Hau Loc district, Thanh Hoa province and growing well under normal conditions to increase the alcohol yield and decrease fermentation time in alcohol production The contents of the study include the isolation of mold strains from traditional alcoholic fermentation starters, evaluation of amylase production, and saccharification of the isolated fungal strains using methods described by Xu-Cong & cs., (2012); Scheherazed & cs., (2016); Samson & Hoekstra (2002) Besides, the effects of cultural conditions on the saccharification of selected fungal strains were surveyed Seventeen strains of fungi isolated from alcoholic fermentation starter samples produced amylase with activities from 2.0 to 4.5 U/ml Among them, two mold strains NS1.1 and HL2 exhibited the highest saccharification when they grew on the block of sticky rice The sugar content in the solution obtained from the fermented rice block of the NS 1.1 strain reached 7.02µM, 6.1 8µM with the HL2 strain The appropriate temperature for the selected strains exhibited amylase activity rang ing from 25C-35C, optimum at 30C The comparative result of the 18S rRNA nucleotide sequence showed that the strain NS 1.1 has 99% similarity to the one of Rhizopus oryzea strain 150138 and was named Rhizopus oryzae strain NS1.1 Keywords: Alcoholic fermentation starter, amylase, saccharification, fungi, Rhizopus sp 322 Nguyễn Huy Thuần, Lê Thị Hạnh, Trần Đăng Khánh, Nguyễn Văn Giang ĐẶT VẤN ĐỀ Ở Việt Nam, rỵu l ung truyn thng, ỵc s dýng thỵng xuyờn cuc sng Sõn xuỗt rỵu truyn thng mang läi nguồn thu nhêp đáng kể cho nông dân Chỳng ta cú th tỡm thỗy rỗt nhiu loọi rỵu truyn thng khỏc nhỵ rỵu np, rỵu , rỵu Nng Võn, rỵu Bu ỏ, rỵu Nga sn, rỵu cổn, rỵu cỏi Sõn xuỗt rỵu truyn thng thỵng ỵc tin hành điều kiện tă nhiên, không vô trùng, täi hộ gia đình sā dýng lội bánh men rỵu cú ngun gc khỏc sõn xuỗt rỵu, cm ỵc ỷ vi men rỵu nhit thỵng, kt thỳc lờn men (khoõng ngy) trờn b mt cm, cm rỵu ỵc trn vi nỵc v tiếp týc lên men chìm không 6-8 ngày Sau đị, ton b sõn phốm cỷa quỏ trỡnh lờn men ỵc chỵng cỗt thu rỵu Nng cn cỏc loọi rỵu gọo cỷa Vit Nam thỵng thay i v cú th ọt ti 15 ml/100 ml chỵng cỗt (Dung & cs., 2005) Cỏc thụng tin v phỵng thc sõn xuỗt bỏnh men, thnh phổn vi sinh vờt cỷa bỏnh men rỗt họn ch Bỏnh men ỵc sõn xuỗt t bt gọo chỵa ỵc nỗu, nỵc, cỏc loọi thõo dỵc v cỏc chỷng vi sinh vờt Bỏnh men ỵc sõn xuỗt thnh nhng viờn trũn hay dt, ỵc ỷ ć nhiệt độ không 30°C không tn Trong thąi kĊ này, cộng đồng vi sinh vêt phát triển v cỏc viờn men mỗt nỵc Cỏc viờn men cú th ỵc bõo quõn nhit thỵng, cng ng vi sinh vêt vén trì khâ nëng sống sót ớt nhỗt thỏng Ba nhúm vi sinh vờt chớnh bỏnh men rỵu truyn thng l nỗm mc, nỗm men v vi khuốn (Dung & cs., 2006; 2007) Nỗm mc l sinh vờt chớnh tng hp amylase thu phõn tinh bt thnh ỵng, nỗm men chuyn hoỏ ỵng thnh rỵu Do ũ, nỗm mc chớnh l tỏc nhõn cỉn thiết để khći đỉu q trình lên men thơng qua phân giâi tinh bột chuyển hoá tinh bột thnh ỵng (quỏ trỡnh ỵng hoỏ) Chỷng nỗm mc bánh men có hột lăc chuyển hố tinh bột mänh, hm lỵng ỵng cung cỗp cho nỗm men nhiu, lỵng rỵu thu ỵc s cao Thớ nghim ỵc trin khai vi mýc ớch tuyn chn chỷng nỗm mc cú khõ nởng ỵng hoỏ cao, gúp phổn cõi thin chỗt lỵng bỏnh men rỵu ng thi, mt s thụng s v pH, nhit mụi trỵng nuụi cỗy chỷng nỗm mc ỵc tuyn chn cỹng ỵc khõo sỏt PHNG PHP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Các méu bánh men khô ỵc thu nhờn tọi: xó Nga Bọch; xó Nga in; xã Nga Thûy, huyện Nga SĄn xã Cæu Lộc, huyện Hêu Lộc, tỵnh Thanh Hóa 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập Các méu bánh men ỵc nghin mn, lỗy 10g mộu pha loóng 90ml nỵc mui sinh lý 0,85% v tin hnh pha loóng méu đến nồng độ 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 Hút 1ml dðch méu ć nồng độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 cỗy trang lờn ùa petri cha mụi trỵng thọch PDA (Potato Dextrose Agar) Cỏc ùa petri ny ỵc ỷ 30C ngy Chn nhng khuốn lọc nỗm mc mc riờng, tin hnh cỗy chuyn sang đïa thäch PDA khác nhiều lỉn đến méu hồn ton thuổn (Xu-Cong & cs., 2012) Nỗm mc ỵc nuụi cỗy trờn mụi trỵng thọch PDA nhit 30C; sau 72 gi, kớch thỵc, mu sớc, hỡnh dọng khuốn lọc ỵc quan sỏt v mụ tõ (Phan Th Thanh Dim & cs., 2018) Cỏc chỷng nỗm mc ỵc cỗy chuyn nhiu lổn v sau thuổn ỵc nuụi trờn mụi trỵng thọch PDA (thnh phổn g/l: Potato extract 4g, Glucose 20g, Agar 15g pH 5,6 ± 0,2) bâo quân tû ć nhiệt độ -20C 2.2.2 Khảo sát hoạt tính enzyme amylase chủng vi nấm phân lp c Tỗt cõ cỏc dũng nỗm mc thuổn ỵc nuụi trờn mụi trỵng tinh bt-agar Mụi trỵng cha 0,5% tinh bột, 0,1% pepton 1,5% agar Cít méu nỗm mc t vo gia ùa mụi trỵng tinh bt agar û ć 30C 48 gią Hột tính phõn giõi tinh bt ỵc xỏc nh bỡng cỏch nhú vo ùa mụi trỵng nuụi cỏc chỷng nỗm thớ nghim dung dðch Iod 0,25% Să phân giâi tinh bột xây khơng có să nhuộm màu xanh điển hình giĂa tinh bột dung dðch Iod (Dung 323 Đặc điểm sinh học số chủng nấm mốc phân lập từ bánh men rượu Thanh Hoá & cs., 2006) Hoọt enzyme amylase cỷa cỏc chỷng nỗm mc thớ nghim ỵc xỏc nh theo phỵng phỏp ỵc mụ tõ bći Xu-Cong & cs (2012) Một đĄn vð hoät độ amylase ỵc xỏc nh l lỵng enzyme cổn thit giõi phúng àmol ỵng kh maltose phỳt ć điều kiện thí nghiệm (Scheherazed & cs., 2016) 2.2.3 Tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính đường húa cao Trn 50g gọo np cựng 60ml nỵc cỗt ỵc cha bỡnh tam giỏc 250ml ờy nớp, ỷ gi nhit 22C Sau ũ, hỗp khā trùng ć 100°C gią Nếp sau hỗp ỵc ngui n 35-40C, v trn u vi 2ml dch huyn phự bo t nỗm mc, mờt 106 bo t/ml Hn hp ỵc ỷ ngy iu kin 30C, quan sỏt khuốn ty v lỵng dch rợ ỵng tọo thnh theo tng ngy Sau ngày, thu tồn sân phèm để phân tích Chn b huyn phự bo t: nỗm mc ó thuổn ỵc nuụi trờn mụi trỵng PDA ỵc ỷ ngy 30C, bo t nỗm mc ỵc thu bỡng cỏch lm ngờp b mt thọch vi nỵc cỗt vụ trựng cha 0,1% Tween 80 (Xu-Cong & cs., 2012) Dðch huyền phù ỵc pha loóng vi nỵc cỗt cho nng cui cựng ọt 106 bo t/ml v dựng cỗy vào gäo nếp chuèn bð để lên men Các chỵ tiêu theo dõi pH: đo bìng máy đo pH Brix ỵc o bỡng khỳc xọ k o ngt Atago Master-20M (0,0 ~ 20,0% Brix) Hm lỵng ỵng kh cỷa cỏc chỷng nỗm mc nuụi trờn mụi trỵng xp (Bernfeld, 1955) ỵc xỏc nh nhỵ sau: mi ng nghim cha 0,5 ml lỵng dch ỵc tọo ra, 0,5ml đệm PBS 0,1M pH 6,5; 1ml thuốc thā DNSA Cỏc ng nghim ỵc ỷ 10 phỳt, tọi 100C bể ổn nhiệt, sau làm nguội đến nhiệt độ phũng, b sung vo mi ng nghim 8ml nỵc cỗt ng i chng: nỵc cỗt o giỏ tr OD540 cỷa cỏc ng thớ nghim v so sỏnh vi o ỵc vi phỵng trỡnh tỵng quan gia giỏ tr OD540 vi hm lỵng ỵng maltose (YOD = 0,1236x + 0,0056, h s tỵng quan R2 = 0,9954) Tng th tớch lỵng ỵng kh ỵc xỏc nh bỡng cỏch: Thu hoọch ht khối nếp û, ly tâm 7.000 vòng/phút 20 phút, thu hoọch lỗy phổn v o th tớch 324 2.2.4 Ảnh hưởng thời gian nhiệt độ nuôi cy n kh nng ng húa Np hỗp ó cỗy nỗm mc (chuốn b ging nhỵ tọi mýc 2.2.3) ỵc ỷ 30C o hm lỵng ỵng theo ngy: 2, 3, ngày sau û Bố trí thớ nghim tỵng t, nhỵng cỏc mộu thớ nghim ỵc û täi nhiệt độ 20C, 25C, 30C, 35C, 40C Hàm lỵng ỵng kh ỵc xỏc nh da vo ỵng chuốn Maltose (nhỵ mýc 2.2.3) 2.2.5 nh danh chng nm mc c tuyn chn Cỏc chỷng nỗm mc tuyn chn cú khõ nởng ỵng hoỏ cao ỵc nhờn dọng da trờn cỏc c tớnh hỡnh thỏi v sinh trỵng Cỏc chỷng nỗm mc ỵc phõn loọi da vo s mụ tõ khóa phân lội (Alexopoulus & cs.,1996; Samson & Hoekstra, 2002), kết hĉp vĆi so sánh trình tă nucleotide 18S rRNA cỷa chỷng nỗm mc ỵc tuyn chn vi trỡnh tă nucleotides ngân hàng gen NCBI Cây phát sinh chỷng loọi ỵc dng bỡng phổn mm BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính amylase cao T cỏc mộu bỏnh men rỵu thu ỵc t cỏc đða điểm khác thuộc huyện Nga SĄn, tỵnh Thanh Hũa, trờn mụi trỵng PDA, chỳng tụi ó phõn lờp ỵc 17 dũng nỗm mc khỏc da trờn cỏc c im mu sớc tõn nỗm, hỡnh thỏi si nỗm, cung mang bo t (Hỡnh 1) Cỏc chỷng nỗm mc ỵc phõn lờp t cựng mt bỏnh men cú th cũ c im hỡnh thỏi khỏc nhau, ngỵc lọi mt s chỷng nỗm mc ỵc phõn lờp t cỏc bỏnh men khỏc lọi cú th cũ c im tỵng đối giống HuĊnh Ngọc Thanh Tåm & cs (2006) kết luên să đa däng cûa chûng nỗm mc cỏc bỏnh men rỵu ỵc thu thờp t cỏc a phỵng khỏc Lee & Fujio (1999) nghiên cĀu hệ vi sinh vêt bánh men rỵu cỷa Vit Nam ó phõn lờp ỵc 20 chỷng nỗm mc v 33 chỷng nỗm men Nỗm mc ỵc Lee & Fujio (1999) xác đðnh chû yếu thuộc loài Rhizopus oryzae, Mucor indicus, Mucor circinilloides Amylomyces Nguyễn Huy Thuần, Lê Thị Hạnh, Trần Đăng Khánh, Nguyễn Văn Giang rouxii Nỗm men ỵc xỏc nh thuc Saccharomyces cerevisiae, Hyphopichia burtonii, Saccharomycopsis fibuligera, Pichia anomala Candida sp Tÿ 29 mộu bỏnh men thu thờp ỵc t vựng chõu th sông Mê Kông, Dung & cs (2007) phån lêp ỵc 53 chỷng nỗm mc, ũ cỏc chỷng Amylomyces rouxii, Rhizopus oligosporus Rhizopus oryzae biểu hột tính mọnh nhỗt Xu-Cong & cs (2012) cỹng ó tỏch ỵc 43 chỷng nỗm mc t cỏc bỏnh men sõn xuỗt rỵu gọo Kt quõ ny khợng nh mc a ọng cỷa cỏc chỷng nỗm mc bỏnh men cỷa cỏc a phỵng khỏc Chng NS1.1 H si phân nhánh, phát triển bao phủ bên chất, tạo thành lớp mốc trắng Chủng NS1.2 Hệ sợi phát triển mạnh, có màu trắng, phân nhánh Chủng NS1.3 Hệ sợi phát triển mạnh, có màu trắng, phân nhánh Chủng NS 1.4 Hệ sợi phát triển nhanh, tạo thành lớp màng màu trắng bao phủ bên chất Chủng NS1.5 Hệ sợi phát triển sau 24h, có màu trắng, bơng xốp Chủng NS1.6 Hệ sợi có màu trắng, hệ sợi xốp, phân nhánh Chủng NS1.7 Hệ sợi có màu trắng, thưa, mọc sát bề mặt mơi trường Chủng HL1 Sau 24h ni cấy hệ sợi có màu trắng, xốp, phân nhánh Chủng HL2 Sau 24h ni cấy hệ sợi có màu trắng ngà, phân nhánh, xốp Chủng HL3 Sau 24h nuôi cấy, hệ sợi phát triển mạnh, có màu trắng Chủng HL4 Hệ sợi mọc thưa có màu trắng Chủng HL5 Hệ sợi có màu xám Chủng NS4.1 Hệ sợi bơng xốp, có màu trắng, phân nhánh Chủng NS4.2 Hệ sợi có màu trắng, bơng xốp Chủng NS4.3 Hệ sợi mảnh có màu trắng mọc sát bề mặt môi trường Chủng NS4.4 Hệ sợi có màu xám, mọc sát bề mặt mơi trường Chủng NS4.5 Hệ sợi mịn, có màu trắng, chuyển dần sang màu vàng hoa cau, sau chuyển sang màu xanh rêu đậm Hình Kết phân lập chủng nấm mốc từ bánh men rượu 325 Đặc điểm sinh học số chủng nấm mốc phân lập từ bánh men rượu Thanh Hố A B Hình Khả phân giải tinh bột (A) hoạt độ amylase (B) chủng nấm mốc phân lập Tỗt cõ 17 dũng nỗm mc ó phồn lờp t cỏc bỏnh men ỵc khõo sỏt khõ nởng phồn giõi tinh bt trờn mụi trỵng tinh bt (Hunh Ngc Thanh Tõm & cs, 2006) Cỏc chỷng nỗm mc thớ nghim sinh trỵng v phỏt trin rỗt tt, nhỵng khõ nëng phân giâi tinh bột cûa nhiều chûng không cao (Hình 2A), vùng phân giâi tinh bột chỵ têp trung quanh im cỗy mc hoc chợ phõn giõi mt lp rỗt múng trờn b mt Kt quõ thớ nghim xỏc nh hoọt enzyme amylase (Hỡnh 2B) cho thỗy, hoọt độ amylase cûa chûng dao động khoâng tÿ 2,0 đến 4,5 U/ml; số đị hột độ amylase cûa chûng NS1.4; NS1.1, HL2 NS4.5 cao nhỗt v ọt lổn lỵt 3,79; 4,53; 4.,16 v 3,90 U/ml, nhiờn vộn rỗt thỗp so vi hoọt 326 amylase cỷa cỏc chỷng vi nỗm nghiờn cu cỷa Xu-Cong & cs (2012), cỷa cỏc chỷng vi nỗm lỵng enzyme cổn thit thớch hp khỏc chỳng biểu hột tính 3.2 Tuyển chọn chủng nấm mc cú hot tớnh ng húa cao Bn chỷng nỗm mc cú khõ nởng phồn giõi tinh bt cao nhỗt tip týc ỵc khõo sỏt khõ nởng ỵng húa Cỏc chỷng nỗm mc ny ỵc cỗy vo cỏc bỡnh tam giỏc cha gọo np ó ỵc h hoỏ v ỷ 30C ngy Khõ nởng ỵng húa cỷa chỷng nỗm mc ỵc th hin tọi bõng Sau ngy ỷ, h khuốn ty nỗm mc ó xuỗt hin trờn np Khuốn ty phỏt trin tởng dỉn theo mĀc độ tÿ đến nhiều sau ngày û, Nguyễn Huy Thuần, Lê Thị Hạnh, Trần Đăng Khỏnh, Nguyn Vn Giang lỵng dch rợ ỵng xuỗt hin chợ sau ngy ỷ tỗt cõ cỏc bỡnh tëng dæn theo thąi gian û mốc Sau ngy ỷ, khuốn ty nỗm mc phỏt trin nhanh v ởn sồu vo c chỗt, dch rợ sỏnh v Ngy th 3, lỵng dch rợ ỵng sinh nhiu rừ rt Họt gọo np sau ỷ tr nờn rỗt mm Giỏ tr pH cỷa tỗt cõ cỏc bỡnh u giâm ć khoâng tÿ 4,4-4,6 Kết quâ tỵng ỵng vi kt quõ ỵc Hunh Ngc Thanh Tõm & cs công bố nëm 2006 Giá trð pH chĀng tó q trình lên men khối gäo nếp û vi nỗm mc din thnh cụng, họn ch ỵc să täp nhiễm cûa vi khuèn gây chua, nhiễm vi khuèn gây chua pH cûa khối û giâm đáng kể, chỵ đät không (HuĊnh Ngc Thanh Tõm & cs,, 2006) Hm lỵng maltose sinh v Brix cú mi tỵng quan thuờn vi Hm lỵng maltose v Brix cỷa chỷng NS1.1 v chỷng HL2 cao nhỗt so vi cỏc chỷng NS1.4 v chỷng NS4.5 Thể tích dðch rỵ sinh tÿ khối nếp hỗp ỵc cỗy nỗm mc chỷng 4.5 cú s khỏc bit v thỗp nhỗt vi chỷng nỗm mc cũn läi Tÿ kết quâ cûa thí nghiệm trên, chûng nỗm NS1.1 v HL2 cũ nghùa quỏ trỡnh ỵng hũa nờn ỵc tuyn chn cho cỏc thớ nghim 3.3 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh enzyme amylase chủng nấm mốc tuyển chọn 3.3.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cy Cỏc chỷng nỗm mc ỵc cỗy v ỷ 30C ngày khối gäo nếp sau hỗp v lm ngui n 30C Hm lỵng ỵng maltose cỷa hai chỷng nỗm mc NS1.1 v HL2 ỵc xỏc đðnh sau 2, 3, ngày (Hình 3) Bảng Khả đường hóa chủng nấm mốc phân lập Thời gian xuất khuẩn ty (ngày) Thời gian xuất dịch rỉ (ngày) Nếp trước ủ nấm môc Nếp sau ủ nấm mốc 3 Hàm lượng Maltose (µM) NS1.1 6,22 ± 0,01 4,47 ± 0.03 + ++ +++ + ++ +++ 7,083 42,80 57,03 NS1.4 6,23 ± 0,01 4,65 ± 0,02 + ++ +++ + ++ +++ 5,804 39,20 54,93 HL2 6,22 ± 0,01 4,41 ± 0,04 + ++ +++ + ++ +++ 6,217 42,07 56,33 NS4.5 6,22 ± 0,01 4,66 ± 0,03 + ++ +++ + ++ +++ 5,389 37,47 47,13 Chủng nấm mốc pH Độ Brix o ( Br) Thể tích dịch rỉ (ml) Ghi chú: Khuẩn ty, dịch rỉ xuất theo mức độ tăng dần từ (+) đến nhiều (+++) Hình Ảnh hưởng thời gian ủ đến khả đường hoá chủng NS1.1 HL2 327 Đặc điểm sinh học số chủng nấm mốc phân lập từ bánh men ru Thanh Hoỏ T ngy th hai dch rợ ỵng ó bớt ổu xuỗt hin, np khụng củn keo nhỵ ban ổu, h si phỏt trin ởn sồu vo bờn np Hm lỵng ỵng dch lờn men bi chỷng nỗm NS1.1 l 4,59àM cao hn hm lỵng ỵng dch cỷa ỷ np vi chỷng HL2 (4,04àM) Ngy th 3, h si nỗm phỏt trin mọnh, dch rợ ỵng nhiu hn, v sỏnh Hm lỵng ỵng ỵc tọo bi cỏc chỷng NS1.1 v HL2 u tởng, ọt lổn lỵt l 7,02àM, 6,18àM Ngày thĀ 4, hệ sĉi phát triển mänh, dðch rỵ nhiều hĄn bít đỉu chuyền sang màu vàng nhẹ, hm lỵng ỵng dch cỷa np ỷ vi hai chỷng NS1.1 v HL2 giõm, tỵng ng ọt l 6,24àM v 5,66àM Sang ngy th lỵng dch nhiu v cú mu vng khụng cũn nhỵ ngy th v ngy th 3, hm lỵng ỵng giõm Nhỵ vờy cú th kt luờn thi gian ỷ np vi nỗm mc thớch hp nhỗt l ngy, cú khỏc vi kt quõ ỵc cụng b bi Dung & cs (2006) cho trình lên men xốp trn nỗm mc vi cm rỵu Cỏc chỷng nỗm mc ỵc cỗy vo cm rỵu v ỷ tọi cỏc nhiệt độ 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C thąi gian ngày theo kết quâ khâo sát ć thí nghiệm mýc 3.4.1 Kim tra hm lỵng ỵng dch cỷa ỷ cm rỵu vi cỏc chỷng nỗm mc NS1.1 v HL2 cỏc nhit ny Kt quõ ỵc thể ć hình 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả đường hóa 3.4 Đặc điểm hình thái, cuống sinh bào tử, bào tử chủng nm mc NS1.1 v HL2 nỵc ta, rỵu ỵc chỵng cỗt thỷ cụng v phõi qua giai oọn ỷ cm rỵu vi bỏnh men Quỏ trỡnh lờn men trờn c chỗt xp ny thỵng din iu kin thỵng, kộo di 2-3 ngy iu kin hiu khớ Sau ũ, ton b vờt liu ny ỵc trn vi nỵc v trõi qua giai oọn lờn men chỡm, khoõng 3-4 ngy (Dung, 2013) Thớ nghim ny ỵc tin hnh vi mýc ớch xỏc nh ỵc khoõng nhit thớch hp Tọi ngỵng nhit 20C, nỗm mc vộn phỏt trin, nhỵng rỗt yu v khụng tọo dch rợ ỵng, nhit 40C cõ hai chỷng u khụng phỏt trin, chng tú ngỵng 20C v 40C khụng phâi nhiệt độ thích hĉp vĆi hai chûng NS1.1 HL2 Hai chûng phát triển täo dch rợ ỵng khoõng t 25C n 35C, tt nhỗt 30C vi hm lỵng ỵng dch cỷa khối nếp û vĆi chûng NS1.1 đät 6,91µM, vĆi chûng HL2 đät 6,28µM Peng & cs (2013) cơng bố khâ nởng ỵng hoỏ v phỏt trin cỷa chỷng Rhizopus oryzae ATCC2809 khoõng nhit t 24-36C v tt nhỗt t 30-34C 3.4.1 Chng NS1.1 Trờn mụi trỵng PDA, khuốn lọc phỏt trin rỗt nhanh 30C, h si cú màu tríng, phân nhánh, bơng xốp, cuống sinh bào tā di, si nỗm khụng cũ vỏch ngởn Bc bo t có hình cỉu, ban đỉu có màu tríng, sau già cị màu đen, phát triển bao phû bên ngồi c chỗt, tọo thnh mt lp mc trớng, cha nhiu nhån (đa nhån) Hình Ảnh hưởng nhiệt độ ni cấy tới khả đường hố chủng nấm 1.1 HL2 328 Nguyễn Huy Thuần, Lê Thị Hạnh, Trần Đăng Khánh, Nguyễn Văn Giang Chủng NS1.1 Chủng HL2 Ghi chú: A Khuẩn lạc; B Sợi nấm; C Cuống bào tử; D Bào tử Hình Đặc điểm hình thái, khuẩn lạc bảo tử chủng NS1.1 HL2 Hình Kết tìm kiếm cơng cụ BLAST 3.4.2 Chng HL2 Trờn mụi trỵng PDA, khuốn lọc phỏt trin rỗt nhanh tọi 30C Khuốn lọc trũn, si nỗm mc túa trũn, di, bụng xp, ban ổu h sĉi có màu tríng, sau già chuyển dỉn thành màu tríng ngà Có rễ giâ, cuống bào tā dài, sĉi khơng có vách ngën, mọc đĄn lẻ hay thành tÿng chùm tÿ thân bò Bào tā giâ, cuống bào tā di, hỡnh ovan Cỏc c im cỷa hai chỷng nỗm NS1.1 v HL2 tỵng ng vi nhiu dc im cỷa chi nỗm Rhizopus ỵc mụ tõ bi Lee & Fujio (1999) HuĊnh Ngọc Thanh Tâm & cs (2006) 3.5 Kết mốc NS1.1 định danh chủng nấm Kết quâ cỏc thớ nghim cho thỗy chỷng nỗm mc NS1.1 cú nhiu ỵu im vỵt tri so vi chỷng HL2 ũ ỵc gi ti Cụng ty Phự Sa giõi trình tă 18S rRNA đðnh danh Kết quâ đðnh danh nhỵ hỡnh Trỡnh t nucleotide cỷa gen 18S rRNA cỷa chỷng NS1.1 ỵc so sỏnh vi trỡnh t nucleotide 18S rRNA cỷa cỏc chỷng nỗm mc ó cụng bố ngân hàng gen NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) Kết quâ (Hình 6) cho thỗy chỷng vi nỗm NS1.1 cú mc tỵng ng 99% vi chỷng Rhizopus oryzae strain 150138 Kt hĉp kết quâ so sánh trình tă nucleotide 18S rRNA đặc điểm hình thái, kết ln, chûng NS1.1 thuộc loài Rhizopus oryzae đặt tên läi cho chỷng ny l Rhizopus oryzae strain NS1.1 Nỗm Rhizopus oryzae l mt cỏc loi nỗm thỵng gp nhỗt bỏnh men rỵu truyn thng cỷa Vit Nam Vu Nguyen Thanh 329 Đặc điểm sinh học số chủng nấm mốc phân lập từ bánh men rượu Thanh Hoỏ & cs., (2008) ó xỏc nh ỵc nỗm Rhizopus oryzae 47 méu bánh men tÿ 52 méu bánh men ỵc kim tra Lee & Fuijio (1999) tin hnh khâo sát quæn thể vi sinh vêt bánh men rỵu cỷa Vit Nam v ó kt luờn chi nỗm Rhizopus spp thuc nhúm vi nỗm gp nhiu nhỗt bỏnh men rỵu cỷa Vit Nam Dung & cs (2006) đánh giá chĀc nëng cûa chûng vi sinh vờt bỏnh men rỵu cỷa Vit Nam v cụng b cỏc chỷng vi nỗm, bao gm Rhizopus spp., bỏnh men rỵu cú vai trũ quan trng quỏ trỡnh chuyn hoỏ tinh bt thnh ỵng, ngun nguyờn liu cho chỷng nỗm men Sacchromyses spp bỏnh men chuyn hoỏ thnh rỵu Chỷng nỗm Rhizopus oryzae cỹng ỵc phỏt hin bỏnh men khụ dựng sõn xuỗt rỵu täi Ấn Độ (Sha & cs., 2018) KẾT LUẬN T 17 chỷng nỗm mc ỵc phõn lờp t cỏc mộu bỏnh men rỵu truyn thng thu thờp tọi Nga Sn, Thanh Hoa, chỳng tụi chn ỵc chỷng NS1.1 v HL2 có khâ nëng sinh enzyme amylase khâ nëng ỵng húa cao Hoọt enzyme amylase cỷa hai chỷng nỗm ny lổn lỵt ọt 4,53 v 4,16 U/ml Hiu quõ ỵng hoỏ cỷa hai chỷng vi nỗm NS1.1 v HL2 cao nhỗt tọi ngy th ỵc ỷ vi cm rỵu Hm lỵng ỵng dch thu ỵc t ỷ cm rỵu vi chỷng NS1.1 ọt 7,018µM, vĆi chûng HL2 đät 6,176µM Nhiệt độ thích hĉp cho cỏc chỷng nỗm ỵc tuyn chn biu hin hoọt tớnh dao ng t 25-35C, tt nhỗt tọi 30C Kt quõ so sỏnh trỡnh t 18S rRNA cho thỗy chỷng NS1.1 có quan hệ gỉn vĆi Rhizopus oryzae strain 150138 Kết hĉp vĆi đặc điểm hình thái, kết luên chûng NS1.1 Rhizopus oryzae đặt tên läi cho chûng Rhizopus oryzae strain NS1.1 TÀI LIỆU THAM KHẢO Alexopoulus C.J., Mims C.W & Blackwell M (1996) Introductory Mycology 4th Ed New York; John Wiley and Sons, Inc p 1869 Bernfeld P (1955) Amylases α and β Methods Enzymol 1: 49-158 330 Dung N.T.P, Romboutsb F.M & Nout M.J.R (2006) Functionality of selected strains of moulds and yeasts from Vietnamese rice wine starters Food Microbiology 23: 331-340 Dung N.T.P., F.M Romboutsb, M.J.R Nout (2007) Characteristics of some traditional Vietnamese starch-based rice wine fermentation starters (men) LWT 40: 130-135 Dung N.T.P (2013) Vietnamese rice-based alcoholic beverages International Food Research Journal 20(3): 1035-1041 Huỳnh Ngọc Thanh Tâm, Huỳnh Xuân Phong, Nguyễn Phương Linh & Ngô Thị Phương Dung (2006) Tuyển chọn nấm mốc có hoạt tính đường hóa cao từ men rượu Xuân Thạnh Tạp chí Nghiên cứu Khoa học 6: 162-171 Lee A.C & Fujio Y (1999) Microflora of banh men, a fermentation starter from Vietnam World Journal of Microbiology and Biotechnology 15: 57-62 Peng Wang, Feng Ying Zhang & Maohua Qu (2013) Study on the Novei Strain Rhizopus Oryzae ATCC 2809’s Growth and Fermentation International Journal of Scientific Engineering and Reseach (LJSER) 1(3) Phan Thị Thanh Diễm, Phạm Thị Ngọc Lan, Ngô Thị Bảo Châu & Trần Quốc Dung (2018) Phân lập sàng lọc số chủng nấm mốc phục vụ cho nghiên cứu tạo dịng biểu gen pectinase Tạp chí Khoa học, Đại học Huế DOI: 10.26459/hueunijns.v127i1C.4885 127(1C): 95-106 Samson R.A., Hoeksrea E.S., Frisval J.C & Filtenborg O (1995) Introduction to food-borne fungi Ed 4: 322 Scheherazed D.D., Leila B., Amel A.K., Kenza L., Tahar N., Zoubida G.A & Zahia M (2016) An optimization study of α-amylase production by Aspergillus niger ATCC 16404 grown on orange waste powder Advances in Bioscience and Biotechnology 7: 123-132 http://dx.doi.org/10 4236/abb.2016.73011 Sha S.P., Suryavanshi M.V., Jani K., Sharma A., Shouche Y & Tamang J.P (2018) Diversity of Yeasts and Molds by Culture-Dependent and Culture-Independent Methods for Mycobiome Surveillance of Traditionally Prepared Dried Starters for the Production of Indian Alcoholic Beverages Front Microbiol 9: 2237 doi: 10.3389/fmicb.2018.02237 Vu Nguyen Thanh, Le Thuy Mai & Duong Anh Tuan (2008) Microbial diversity of traditional Vietnamese alcohol fermentation starters (banh men) as determined by PCR-mediated DGGE International Journal of Food Microbiology 128: 268-273 Xu-Cong Lv, Zhi-Qing Huang, Wen Zhang, Ping-Fan Rao & Li Ni (2012) Identification and characterization of fi fungi isolated from fermentation starters for Hong Qu glutinous rice wine brewing J Gen Appl Microbiol 58: 33-42 ... chuyển sang màu xanh rêu đậm Hình Kết phân lập chủng nấm mốc từ bánh men rượu 325 Đặc điểm sinh học số chủng nấm mốc phân lập từ bánh men rượu Thanh Hố A B Hình Khả phân giải tinh bột (A) hoạt độ amylase... Vit Nam Vu Nguyen Thanh 329 Đặc điểm sinh học số chủng nấm mốc phân lập từ bánh men rượu Thanh Hoá & cs., (2008) ó xỏc nh ỵc nỗm Rhizopus oryzae 47 mộu bỏnh men t 52 mộu bỏnh men ỵc kiểm tra Lee... Hình Ảnh hưởng thời gian ủ đến khả đường hoá chủng NS1.1 HL2 327 Đặc điểm sinh học số chủng nấm mốc phân lập từ bánh men rượu Thanh Hoỏ T ngy th hai dch rợ ỵng ó bớt ổu xuỗt hin, np khụng củn