Nghiên cứu tổng hợp (s) ( ) atenolol có sử dụng xúc tác enzym

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐINH HỮU THÀNH NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP (S)-(-)-ATENOLOL CÓ SỬ DỤNG XÚC TÁC ENZYM Luận văn Thạc sĩ: Dược học Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ĐINH HỮU THÀNH NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP (S)-(-)-ATENOLOL CÓ SỬ DỤNG XÚC TÁC ENZYM Ngành: Công Nghệ Dược Phẩm Bào Chế Mã số: 8720202 Luận văn Thạc sĩ: Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM NGỌC TUẤN ANH Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực Tác giả Đinh Hữu Thành NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP (S)-(-)-ATENOLOL CÓ SỬ DỤNG XÚC TÁC ENZYM ENZYME-CATALYZED SYNTHESIS OF (S)-ATENOLOL TĨM TẮT Nghiên cứu mơ tả trình tổng hợp đồng phân quang học (S)-atenolol tinh khiết, β-blocker chọn lọc Trước tổng hợp hợp chất mong muốn, tiền chất quan trọng quy trình 1-(4-(2-amino-2-oxoethyl)phenoxy)-3chloropropan-2-yl-acetate, tổng hợp Sau đó, lipase sử dụng để phân giải tiền chất môi trường đệm phosphate pH 7.0 Trong số lipase sử dụng, Pseudomonas fluorescens có tính chọn lọc cao (với độ tinh khiết quang học 98% hiệu suất 71.36%) trình phân giải để thu dẫn chất đồng phân quang học (R)-1-(4-(2-amino-2-oxoethyl)phenoxy)-3-chloropropan-2-yl acetate Cuối cùng, dẫn chất đồng phân quang học thủy phân sản phẩm tạo phản ứng với isopropylamine để thu (S)-atenolol Quy trình tổng hợp mô tả công nghệ xanh việc tổng hợp (S)-atenolol với hiệu suất độ tinh khiết quang học cao ABSTRACT The present study describes an efficient chemoenzymatic synthesis of enantiopure (S)-atenolol, a selective β-adrenergic receptor blocker Prior to the synthesis of the target, a synthetic protocol for 1-(4-(2-amino-2-oxoethyl)phenoxy)-3-chloropropan2-yl-acetate, an essential precursor, was developed Then, various commercial lipases were screened for the kinetic resolution of above precursor using phosphate buffer solution pH 7.0 Among various lipases screened, Pseudomonas fluorescens showed the highest enantioselectivity (98% enantiomeric excess with 71.36 % yield), to afford enantiopure intermediate (R)-1-(4-(2-amino-2-oxoethyl)phenoxy)-3chloropropan-2-yl acetate Finally, the above enantiopure intermediate was hydrolyzed and the resulting product was treated with isopropylamine to afford (S)atenolol This biocatalytic procedure describes a green technology for the synthesis of (S)-atenolol with highly yield and enantiomeric excess MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 HOẠT CHẤT (S)-ATENOLOL 1.2 TỔNG HỢP NGUYÊN LIỆU DƯỢC PHẨM BẰNG XÚC TÁC SINH HỌC 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP (S)-ATENOLOL BẰNG XÚC TÁC SINH HỌC 13 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 26 2.1.1 Nguyên vật liệu: 26 2.1.2 Thiết bị: 26 2.1.3 Hóa chất: 26 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.2.1 Tổng hợp dẫn chất epoxid .27 2.2.2 Tổng hợp 2-(4-(3-cloro-2-hydroxypropoxy)phenyl) acetamid .28 2.2.3 Tổng hợp 1-(4-(2-amino-2-oxoethyl)phenoxy)-3-cloropropan-2-yl-acetat 28 2.2.4 Tổng hợp (R)-1-(4-(2-amino-2-oxoethyl)phenoxy)-3-chloropropan-2-yl acetat lipase 29 2.2.5 Tổng hợp đồng phân quang học (S)-atenolol 29 2.2.6 Phương pháp xác định cấu trúc .30 2.2.7 Phương pháp xác định độ tinh khiết quang học 31 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN .32 3.1 TỔNG HỢP DẪN CHẤT EPOXID (GIAI ĐOẠN 1) 32 3.2 TỔNG HỢP 2-(4-(3-CLORO-2-HYDROXYPROPOXY) PHENYL) ACETAMID (GIAI ĐOẠN 2) 36 3.3 TỔNG HỢP 1-(4-(2-AMINO-2-OXOETHYL) PHENOXY)-3CLOROPROPAN-2-YL-ACETAT (GIAI ĐOẠN 3) 41 3.4 TỔNG HỢP (R)-1-(4-(2-AMINO-2-OXOETHYL) PHENOXY)-3CLOROPROPAN-2-YL-ACETAT (GIAI ĐOẠN 4) 44 3.5 TỔNG HỢP ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC (S)-ATENOLOL (GIAI ĐOẠN 5) 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 60 PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ PHỔ MS SẢN PHẨM 60 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ PHỔ 1H SẢN PHẨM 62 PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ PHỔ MS SẢN PHẨM 63 PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ PHỔ 1H SẢN PHẨM 65 PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ PHỔ MS SẢN PHẨM 66 PHỤ LỤC 6: KẾT QUẢ PHỔ 1H SẢN PHẨM 68 PHỤ LỤC 7: KẾT QUẢ PHỔ MS SẢN PHẨM 69 PHỤ LỤC 8: KẾT QUẢ PHỔ 1H SẢN PHẨM 71 PHỤ LỤC 9: KẾT QUẢ PHỔ MS SẢN PHẨM PHỤ 72 PHỤ LỤC 10: KẾT QUẢ PHỔ 1H SẢN PHẨM PHỤ 75 PHỤ LỤC 11: KẾT QUẢ PHỔ MS SẢN PHẨM 76 PHỤ LỤC 12: KẾT QUẢ PHỔ 1H SẢN PHẨM 78 PHỤ LỤC 13: KẾT QUẢ PHỔ 13C SẢN PHẨM 79 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Khảo sát phản ứng sau 2h 32 Hình 2: Khảo sát phản ứng sau 9h 33 Hình 3: Khảo sát phản ứng sau 10h .33 Hình 4: Khảo sát phản ứng sau 12h .33 Hình 5: Khảo sát phản ứng sau thực sắc ký cột .34 Hình 6: Thực phản ứng với lượng mẫu 10 mmol (kết thúc phản ứng) 35 Hình 7: Theo dõi phản ứng (với lượng mẫu 20 mmol) 35 Hình 8: Sản phẩm sau tinh chế (với lượng mẫu 20 mmol) 36 Hình 9: Khảo sát phản ứng sau 30 phút 37 Hình 10: Khảo sát phản ứng sau 1h .38 Hình 11: Khảo sát phản ứng sau 2h .38 Hình 12: Khảo sát phản ứng sau 4h .38 Hình 13: Khảo sát phản ứng sau thực sắc ký cột .39 Hình 14: Thực phản ứng với lượng mẫu 5.8 mmol (kết thúc phản ứng) .39 Hình 15: Theo dõi phản ứng (với lượng mẫu 11.6 mmol) .40 Hình 16: Sản phẩm sau tinh chế (với lượng mẫu 11.6 mmol) 41 Hình 17: Khảo sát sản phẩm sau tinh chế 42 Hình 18: Khảo sát sản phẩm sau thực sắc ký cột .42 Hình 19: Theo dõi phản ứng (với lượng mẫu mmol) theo thời gian 43 Hình 20: Sản phẩm sau tinh chế 44 Hình 21: Khảo sát phản ứng thủy phân (giai đoạn 4) có enzym/ khơng có enzym 46 Hình 22: Khảo sát phản ứng thủy phân (giai đoạn 4) với lipase B pH khác 47 Hình 23: Khảo sát phản ứng thủy phân (giai đoạn 4) với lipase C pH khác 48 Hình 24: Khảo sát phản ứng thủy phân (giai đoạn 4) với lipase A pH khác 48 Hình 25: Khảo sát phản ứng thủy phân (GĐ 4) với lipase A pH 49 Hình 26: Thực phản ứng thủy phân (giai đoạn 4) với lipase A pH (với 1.66g SP3) 50 Hình 27: Hổn hợp sản phẩm sau tinh chế 50 Hình 28: Sản phẩm sau thực sắc ký cột 51 Hình 29: Khảo sát phản ứng – sau 30 phút thủy phân 53 Hình 30: Khảo sát phản ứng – sau 2h thủy phân 53 Hình 31: Khảo sát phản ứng – kết hợp với IPA sau 1h phản ứng 54 Hình 32: Khảo sát phản ứng – kết hợp với IPA sau 2h phản ứng 54 Hình 33: Khảo sát phản ứng – kết hợp với isopropylamin sau 3h30 phản ứng .54 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Kết chuyển hóa sinh học sau ngày pH R arrhizus G candidum 17 Bảng 2: Khảo sát phản ứng thủy phân (giai đoạn 4) có enzym/ khơng có enzym 45 Bảng 3: Khảo sát phản ứng thủy phân (giai đoạn 4) với lipase khác nhau, pH khác 46 Bảng 4: Khảo sát phản ứng thủy phân (giai đoạn 4) với lipase A pH 49 Bảng 5: Thực phản ứng thủy phân (giai đoạn 4) với lipase A pH (với 1.66g SP3) 49 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1: Ester hóa cloramphenicol enzym Sơ đồ 2: Ester hóa lipase tuyến tụy heo (PPL) Sơ đồ 3: Tổng hợp β-blocker với xúc tác enzym .7 Sơ đồ 4: Hợp chất tinh khiết quang học sử dụng tổng hợp Dược phẩm Sơ đồ 5: Tổng hợp đồng phân quang học với độ tinh khiết cao xúc tác P oleovorans Sơ đồ 6: Tổng hợp đồng phân quang học với độ tinh khiết cao A niger Sơ đồ 7: Sơ đồ tổng hợp (R) (S)-ranolazin 10 Sơ đồ 8: Ứng dụng xúc tác sinh học tổng hợp tiền chất taxol 11 Sơ đồ 9: Tổng hợp tiền chất pregabalin lipase 11 Sơ đồ 10: Tổng hợp (R)-nifenalol xúc tác sinh học 11 Sơ đồ 11: Tổng hợp đồng phân quang học lipase 12 Sơ đồ 12: Tổng hợp chất trung gian diltiazem .12 Sơ đồ 13: Acyl hóa lipase có tính chọn lọc 12 Sơ đồ 14: Tổng hợp (S)-atenolol đường hóa học 15 Sơ đồ 15: Tổng hợp (S)-atenolol với xúc tác PPL 16 Sơ đồ 16: Tổng hợp (S)-atenolol với xúc tác R arrhizus G candidum 16 Sơ đồ 17: Tổng hợp (S)-atenolol phân hủy sinh học 17 Sơ đồ 18: Thủy phân có tính chọn lọc xúc tác enzym .19 Sơ đồ 19: Acyl hóa có tính chọn lọc xúc tác enzym 19 Sơ đồ 20: Quá trình acyl hóa có tính chọn lọc tùy thuộc vào nhóm 20 Sơ đồ 21: Tổng hợp (S)-atenolol từ atenolol racemic có diện lipase .20 Đinh Hữu Thành PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ PHỔ 1H SẢN PHẨM 65 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Đinh Hữu Thành PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ PHỔ MS SẢN PHẨM 6/30/2017 17:32:58 / ==== Shimadzu LCMSsolution Data Report ==== < Chromatogram > < Spectrum > 66 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Đinh Hữu Thành D:\Research\2017\30062017\Anh Thanh.lcd 67 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Đinh Hữu Thành PHỤ LỤC 6: KẾT QUẢ PHỔ 1H SẢN PHẨM 68 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Đinh Hữu Thành PHỤ LỤC 7: KẾT QUẢ PHỔ MS SẢN PHẨM Instrument:MSQ_Plus_DAD Sequence:ESI MODE Page of PHARMACEUTICAL CHEMISTRY LABORATORY Add: 01, Mac Dinh Chi Str., Dist.1, Ho Chi Minh City Phone: (84) 907070939 Website: www.natpro.com.vn Email: contact@natpro.com.vn Peak Analysis Injection Details Injection Name: NHI_SP4 Vial Number: BD7 Injection Type: Unknown Run Time (min): Injection Volume: 1.00 2.00 Calibration Level: Instrument Method: ESI_Scan_70_1500Da Processing Method: Scan_MW_70_1500Da Dilution Factor: 1.0000 Injection Date/Time: 04/Sep/18 10:43 Sample Weight: 1.0000 69 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Chromeleon (c) Dionex MS Scan Report/Peak Analysis Đinh Hữu Thành Version 7.2.4.8179 70 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Đinh Hữu Thành PHỤ LỤC 8: KẾT QUẢ PHỔ 1H SẢN PHẨM 71 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Đinh Hữu Thành PHỤ LỤC 9: KẾT QUẢ PHỔ MS SẢN PHẨM PHỤ Qualitative Analysis Report Data File SPP4.d Sample Name SPP4 Sample Type Sample Position P1-A1 Instrument Name Instrument User Name Acq Method All Ion MSMS-Positive-100MeOH.m Acquired Time 24 /08/2018 3:57:33 PM IRM Calibration Success Status DA Method default.m Comment Sample Group Stream Name Info LC Acquisition SW 6200 series TOF/6500 series Q-TOF B.06.01 (B6172 Version SP1) User Chromatograms Fragmentor Voltage 140 Collision Energy Ionization Mode ESI 72 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Đinh Hữu Thành + BPC Scan SP P d Smooth x10 1 2.5 1.5 0.5 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 1.4 1.6 1.8 2.2 2.4 2.6 2.8 3.2 3.4 3.6 3.8 Counts vs Acquisition Time (min) 4.2 4.4 4.6 4.8 User Spectra Fragmentor Voltage 140 Collision Energy Ionization Mode ESI Page of Printed at 12:05 PM on 28-Aug-2018 73 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Đinh Hữu Thành Qualitative Analysis Report Peak List m/z z Abund 244.074 1670157.13 246.0712 517492.06 266.0566 3934558.5 267.0593 505665.22 268.0534 1305163.25 290.1004 554702.31 297.9935 364123.03 487.1408 435393.84 541.0601 519638.25 543.058 346700.22 End Of Report Page of Printed at 12:05 PM on 28-Aug-2018 74 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Đinh Hữu Thành PHỤ LỤC 10: KẾT QUẢ PHỔ 1H SẢN PHẨM PHỤ 75 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Đinh Hữu Thành PHỤ LỤC 11: KẾT QUẢ PHỔ MS SẢN PHẨM Instrument:MSQ_Plus_DAD Sequence:APCI MODE Page of PHARMACEUTICAL CHEMISTRY LABORATORY Add: 01, Mac Dinh Chi Str., Dist.1, Ho Chi Minh City Phone: (84) 907070939 Website: www.natpro.com.vn Email: contact@natpro.com.vn Peak Analysis Injection Details Injection Name: THANH_SP5 Vial Number: GB1 Injection Type: Unknown Run Time (min): Injection Volume: 1.00 2.00 Calibration Level: Instrument Method: APCI_Scan_70_1500Da Processing Method: Scan_MW_70_1500Da Dilution Factor: 1.0000 Injection Date/Time: 28/Aug/18 13:02 Sample Weight: 1.0000 76 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Chromeleon (c) Dionex MS Scan Report/Peak Analysis Đinh Hữu Thành Version 7.2.4.8179 77 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Đinh Hữu Thành PHỤ LỤC 12: KẾT QUẢ PHỔ 1H SẢN PHẨM 78 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Đinh Hữu Thành PHỤ LỤC 13: KẾT QUẢ PHỔ 13C SẢN PHẨM 79 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực Tác giả Đinh Hữu Thành NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP (S)- (- )- ATENOLOL CÓ SỬ DỤNG XÚC TÁC ENZYM ENZYME-CATALYZED SYNTHESIS OF (S)- ATENOLOL. .. ? ?Nghiên cứu tổng hợp (S)- (- )- atenolol có sử dụng xúc tác enzym? ?? với mục tiêu cụ thể sau: - Xây dựng phương pháp tổng hợp tiền chất - Xây dựng phương pháp chuyển đổi tiền chất thành (S)- (- )- atenolol. .. sp, hợp chất (? ?1 4) tạo thành (S)alcohol 13 (R)-acetat 14 Và hợp chất (? ?1 3) điều kiện phản ứng acyl hóa tạo thành (R)-alcohol 13 (S)- acetat 14 Những hợp chất clorohydrin (1 3) hoặc acetat (1 4) phản