trùng khác nhau: loài phụ morisoni (type huyết thanh H8ab) có độc tính với côn trùng bộ hai cánh và loài phụ sandiego (type huyết thanh H8ab) có độc tính với côn trùng bộ cánh cứng.. K[r]
(1)CHƯƠNG III:
(2)I LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA THUỐC TRỪ SÂU BT
1901 Bacillus thuringiensis tiến sỹ Ishiwatari phát
hiện.
1911 Berliner phát silo hạt Thuringe.
1915 Berliner quan sát thấy tạo thành tinh thể giai đoạn tạo bào tử.
1920 Được sử dụng lần làm thuốc trừ sâu.
1950 Chế phẩm chứa bào tử thương mại hóa lần đầu tiên
1957 Thuốc Thuricide sản xuất từ chủng Bt var.kurstaki.
Những năm 1970
Phát chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao Cơng nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh Có 13
chủng Bt xác định Tất diệt côn trùng cánh vẩy (Lepidoptera).
1977 Phát Bt var.israelensis diệt ấu trùng ruồi, muỗi.
(3)II ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA Bacillus thuringiensis
Trực khuẩn, kích thước 1-1,2 x 3-5 µm
Phủ tiêm mao, di chuyển được
Gram +
Sinh bào tử, kích thước 1,6 – µm
Hiếu khí hiếu khí khơng bắt buộc
Tế bào đứng riêng xếp chuỗi
Nhiệt độ sinh trưởng 15º-45ºC
Phổ biến tự nhiên, cư trú
đất, bề mặt xác sâu
Tạo tinh thể protein giai đoạn
(4)Bào tử
: hình trứng dài, kích
thước 1,6 x µm
(5)III PHÂN LOẠI Bacillus thuringiensis
Giới
: Procaryotae
Ngành
: Firmicutes
Họ
: Bacillacaeae
Chi
: Bacillus
Loài
: thuringiensis
Loài phụ
…
Bacillus thuringiensis thuộc:
(6)III Phân loại Bacillus thuringiensis (tiếp)
1 Theo typ huyết kháng tiêm mao
Nguyên lí
Kháng nguyên tiêm mao H kết hợp với
kháng thể xảy phản ứng ngưng
kết → tạo cặn lắng trắng đáy ống
nghiệm.
(7)III Phân loại Bacillus thuringiensis (tiếp)
1 Theo typ huyết kháng tiêm mao (tiếp)
Chuẩn bị
kháng nguyên
tiêm mao H
Tiêm vào thỏ →
thu huyết
miễn dịch
(xác định hiệu giá)
(8)
Chuẩn bị dịch kháng tiêm mao H
Nuôi cấy VK B thuringiensis môi trường bán lỏng NA: cao thịt 5g, agar
2g, nước cất 1000ml, điều chỉnh tới pH = 7,2 Thời gian nuôi 16 – 18 giờ.
Chuyển sang môi trường NB: nuôi chế độ lắc OD650 = 0,8 – 1,0. Bổ sung 0,5 ml formaldehyt
Thu nhận dịch kháng nguyên tiêm mao H
Thu nhận huyết miễn dịch
Tiêm dịch kháng nguyên tiêm mao H:
Mũi da.
Các mũi tiêm ven, tuần lần, liều lượng lần tăng dần
(1ml, 2ml, 3ml), thời gian tiêm tuần
Kiểm tra hình thành kháng thể:
Sau ngày lần tiêm cuối: lấy 2ml máu từ ven tai thỏ để xác định hiệu
giá.
Nếu HG lớn 25 000 đạt yêu cầu.
Nếu HG nhỏ 25 000 tiếp tục tiêm thêm – lần để nhận hiệu giá cao hơn.
Dùng 02 thỏ cho kháng nguyên để tránh rủi ro.
(9)
Xác định hiệu giá
Cho 1,8ml NaCl 1,15M 200l dịch huyết miễn dịch tiêm mao
vào ống nghiệm 5ml.
Pha loãng với nồng độ giảm dần theo hệ số 2: 1:10; 1:20; 1:40;
…… ; 1:2560.
Chuyển 100l dịch nồng độ pha loãng vào ống nghiệm có
chứa 900l dịch vi khuẩn B thuringiensis, độ pha loãng lúc
này 1:100; 1:200; 1:400; … ; 1:25600 Mẫu đối chứng thay
100l dịch huyết 100l dịch NaCl 1,15M.
Ủ ống nghiệm 37
oC quan sát ngưng kết.
(10)Nhược điểm phân loại theo type huyết thanh
Mối liên hệ type huyết với phổ diệt
côn trùng không quán:
Có lồi type huyết có độc tính với trùng
nhau: lồi phụ Kustaki loài phụ alesti biểu độc với
trùng cánh vẩy.
Có lồi có type huyết giống độc tính với
trùng khác nhau: lồi phụ morisoni (type huyết H8ab) có độc
tính với trùng hai cánh lồi phụ sandiego (type huyết
thanh H8ab) có độc tính với trùng cánh cứng.
(11)Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H
H
antigen
Serovar
Viết tắt
Lần miêu tả
1 thuringiensis THU Berliner 1915; Heimpel Angus 1958 2 finitimus FIN Heimpel Angus 1958
3a, 3c alesti ALE Toumanoff Vago 195, Heimpel Angus 1958
3a, 3b, 3c kurstaki KUR De Barjac Lemille 1970
3a, 3d sumiyoshiensis SUM Ohba Aizawa 1989 3a, 3d, 3e fukuokaensis FUK Ohba Aizawa 1989
4a, 4b sotto SOT Ishiwata 1905, Heimpel Angus 1958 4a, 4c kenyae KEN Bonnefoi De Barjac 1963
5a, 5b galleriae GAL Shvetsova 1959, De Barjac Bonnefoi 1962
(12)H
antigen
Serovar
Viết tắt
Lần miêu tả
5a, 5c canadensis CAN De Barjac Bonnefoi 1972 6 entomocidus ENT Heimpel Angus 1958 7 aizawai AIZ Bonnefoi De Barjac 1963 8a, 8b morrisoni MOR Bonnefoi De Barjac 1963 8a, 8c ostriniae OST Ren et al., 1975
8b, 8d nigeriensis NIG Weiser Prasertphon 1984
9 tolworthi TOL Norris 1964, De Barjac Bonnefoi 1968 10a, 10b darmstadiensis DAR Krieg de Barjac Bonnefoi 1968
10a, 10c londrina LON Arantes et al.(không công bố) 11a, 11b toumanoffi TOU Krieg 1969
11a, 11c kyushuensis KYU Ohba Aizawai 1979
(13)H
antigen
Serovar
Viết tắt
Lần miêu tả
12 thompsoni THO De Barjac Thompson 1970 13 pakistani PAK De Barjac et al., 1977
14 israelensis ISR De Barjac 1978
15 dakota DAK De Lucca et al., 1979 16 indiana IND De Lucca et al., 1979 17 tohokuensis TOH Ohba et al., 1981 18a, 18b kumamatoensis KUM Ohba et al., 1981 18a, 18c yosso YOS Lee H.H et al., 1995 19 tochigiensis TOC Ohba et al., 1981 20a, 20b yunnanensis YUN Wan-Yu et al., 1979
20a, 20c pondicheriensis PON Rajagopalan et al (không công bố)
(14)H
antigen
Serovar
Viết tắt
Lần miêu tả
21 colmeri COL De Lucca et al., 1984 22 shandongiensis SHA Wang Ying et al., 1986 23 japonensis JAP Ohba Aizawa 1986
24a, 24b neoleonensis NEO Rodriguez-Padilla et al., 1988 24a, 24c novosibirsk NOV Burtseva et al., 1995
25 coreanensis COR Lee H.H et al., 1994
26 silo SIL De Barjac Lacadet (không công bố) 27 mexicanensis MEX Rodriguez-Padilla Galan-Wong
(không công bố)
28a, 28b monterrey MON Rodriguez et al., 1988 29 amagiensis AMA Ohba (không công bố) 30 medellin MED Orduz et al., 1992
(15)H
antigen
Serovar
Viết tắt
Lần miêu tả
31 toguchini TOG Hodirev (không công bố)
32 cameroun CAM Jacquemard 1990, Juarez-Perez et al., 1994
33 leesis LEE Lee H.H et al., 1994 34 konkukian KON Lee H.H et al., 1994 35 seoulensis SEO Lee H.H et al., 1995 36 malaysiensis MAL Ho (không công bố) 37 andaluciensis AND Aldebis et al., 1996 38 oswaldocruzi OSW Rabinovitch et al., 1995 39 brasiliensis BRA Rabinovitch et al., 1995 40 huazhongensis HUA Dai Jingyuan et al., 1996 41 soocheon SOO Lee H.H et al., 1995
(16)H
antigen
Serovar
Viết tắt
Lần miêu tả
42 jinghongiensis JIN Li Rong Sen et al 43 guiyangiensis GUI Li Rong Sen et al 44 higo HIG Ohba et al., 1995
45 roskildiensis ROS Hinrinschen et al.(không công bố) 46 chanpaisis CHA Chanpaisaeng (không công bố) 47 wratislaviensis WRA Lonc et al., 1997
48 balearica BAL Caballero et al.(không công bố)
49 muju MUJ Seung Hwan Park et al.(không công bố) 50 navarrensis NAV Caballero et al.(không công bố)
51 xiaguangiensis XIA Jian Ping Yan (không công bố) 52 kim KIM Kim et al.(không công bố)
(17)H
antigen
Serovar
Viết tắt
Lần miêu tả
53 asturiensis AST Aldebis et al., 1996
54 poloniensis POL Damgaard et al.(không công bố)
55 palmanyolensis PAL Santiago-Alvarez et al (không công bố) 56 rongseni RON Li Rong Sen
57 pirenaica PIR Caballero et al (không công bố) 58 argentinensis ARG Campos-Dias et al.(không công bố) 59 iberica IBE Caballero et al (không công bố) 60 pingluonsis PIN Li Rong Sen
61 sylvestriensis SYL Damgaard (không công bố) 62 zhaodongensis ZHA Li Rong Sen
63 bolivia BOL Ferré-Manzanero et al.(không công bố)
(18)H
antigen
Serovar
Viết tắt
Lần miêu tả
64 azorensis AZO Santiago-Alvarez et al.(không công bố) 65 pulsiensis PUL Khalique F Và Khalique A (không công
bố)
66 graciosensis GRA Santiago-Alvarez et al.(không công bố) 67 vazensis VAZ Santiago-Alvarez et al.(không công bố) 68 thailandensis THA Chanpaisaeng et al.(không công bố) 69 pahangi PAH Seleena Lee H.L (không công bố)
(19)2 Theo gen mã hóa protein tinh thể độc
Protein Cry
Mã hóa
Gen Cry
(20)
Protein cry hay gọi -endotoxin (tinh thể độc)
ICP tồn dạng tiền độc tố, cần hoạt hố để có tác
dụng.
ICP tồn nhiều hình dạng: kim tự tháp đôi, thoi phẳng,
khối hộp, hỗn hợp loại trên.
ICP có kích thước khoảng 230KDa với phần nhân độc 65KDa.
ICP tan điều kiện pH cao (pH >9,5).
Tính độc: gây độc nồng độ picomol (10
-12M)
Gen cry
Các gen mã hoá cho ICP thường nằm plasmid.
Mỗi ICP sản phẩm gen.
Một số lồi phụ có khả tổng hợp nhiều ICP.
250 gen mã hoá tổng hợp protein cry đọc trình tự
(21)Độ tương đồng trình tự axít amin
của gen cry
Hàng
thứ
tượng
Biểu
% tương đồng axít amin
của gen cry
Nhất
Số arập
45%
Hai
Chữ in hoa
75%
Ba
Chữ
(22)Gen
Hình dạng tinh
thể
Kích thước
protein
(kDa)
Đối tượng sâu diệt
CryI (Aa, Ab, Ac,
B, C, D, E, F, G, H,
I, J, K, L)
Lưỡng tháp
130-140
ấu trùng cánh vẩy
CryII (A, B, C)
Hình lập
phương
69-71
Bộ cánh vẩy hai
cánh
CryIII (A, B, C, D)
Phẳng/không
đều
73-74
Bộ cánh cứng
CryIV (A, B, C, D)
Lưỡng tháp
73-134
Bộ hai cánh
CryV-cryIX
Đa dạng
35-129
Đa dạng
Cyt
25-28
Tế bào động vật xương
sống ko xương sống
(23)Phân loại Bt theo độc tố diệt sâu
Độc tố diệt sâu
Khối lượng
phân tử (kDa)
Độc tính
Hofte and Whiteley
(1989)
Crickmore et al
(1999)
CryIA(a)
Cry1Aa
133,2
Cánh vẩy
CryIA(b)
Cry1Ab
131
Cánh vẩy/hai
cánh
CryIA(c)
Cry1Ac
133,3
Cánh vẩy
CryIB
Cry1Ba
138
Cánh vẩy
CryIC(a)
Cry1Ca
134,8
Cánh vẩy/hai
cánh
CryIC(b)
Cry1Cb
134
Cánh vẩy
CryID
Cry1Da
132,5
Cánh vẩy
CryIE
Cry1Ea
132
Cánh vẩy
CryIF
Cry1Fa
133,6
Cánh vẩy
(24)Phân loại độc tố diệt sâu (tiếp)
Độc tố diệt sâu
Khối lượng
phân tử (kDa)
Độc tính
Hofte and Whiteley
(1989)
Crickmore et al
(1999)
CryIH
Cry9Ca
129,9
Cánh vẩy
CryIIA
Cry2Aa
70
Cánh vẩy/hai
cánh
CryIIB
Cry2Ab
70,8
Cánh vẩy
CryIIC
Cry2Ac
71
Cánh vẩy
CryIIIA
Cry3Aa
73,1
Cánh cứng
CryIIIB
Cry3Ba
74,2
Cánh cứng
CryIIIC
Cry7Aa
73
Cánh cứng
CryIIIC(b)
Cry7Ab
73
Cánh cứng
CryIIID
Cry3Ca
73
Cánh cứng
(25)Phân loại độc tố diệt sâu (tiếp)
Độc tố diệt sâu
Khối lượng
phân tử (kDa)
Độc tính
Hofte and Whiteley
(1989)
Crickmore et al
(1999)
CryIVC
Cry10Aa
77,8
Hai cánh
CryIVD
Cry11Aa
72,4
Hai cánh
CryVIA
Cry6Aa
54
Nematode
CytA
Cyt1Aa
27,4
Hai cánh/phân
hủy tế bào
CytB
Cyt2Aa
29
Hai cánh/phân
(26)3 Các cách phân loại khác
Phân loại theo loại hình enzym lipase
Phân loại theo typ huyết kháng protein tinh thể
Phân loại theo typ huyết kháng nguyên O
Phân loại theo loại bệnh gây cho côn trùng
Theo hình thái thể vùi
(27)
Phân loại theo loại hình enzym lipase
Căn vào số lượng vạch enzim lipase.
Tương đối thống với loại hình huyết kháng nguyên H, sử
dụng để phân biệt loài phụ type huyết thanh.
Phân loại theo type huyết kháng protein tinh thể
Các tinh thể có cấu trúc khác nhau, thành phần kháng nguyên
các tinh thể khác nhau.
Thông qua phản ứng huyết nhận biết type huyết tinh thể.
Quan hệ mật thiết với phổ diệt sâu
Phân loại theo type huyết kháng nguyên O
KN O kháng nguyên bền nhiệt Bt, thu xử lý nhiệt
để loại bỏ tiêm mao.
Được sử dụng để xác định vị trí phân loại Bt khơng có tiêm mao.
Phân loại theo loại bệnh gây cho côn trùng
(28)IV SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA Bt
Chu trình sống Bacillus thuringiensis
1 Pha phát triển sinh
dưỡng
(29)(30)(31)(32)V CÁC LOẠI ĐỘC TỐ CỦA Bacillus thuringiensis
Tinh thể độc Bt
var.israelensis (Bti) kính
hiển vi điện tử
1 α-exotoxin
: phospholipase C, 45-50
kDa, khơng bền nhiệt Chỉ có số
chủng Bt.
• Enzim liên quan tới phân huỷ
mang tính cảm ứng photpholipit
trong mô côn trùng.
• Đầu tiên enzim liên kết với tế bào
(33)2 β-exotoxin: nucleotide tạo thành giai đoạn phát triển sinh trưởng trước khi hình thành bào tử Khối lượng phân tử thấp, tan nước Có tác dụng ức chế tổng hợp ARN.
• Tác dụng cộng hưởng với -endotoxin: -endotoxin làm dập vỡ, phá huỷ vùng biểu mô ruột côn trùng -exotoxin xâm nhập vào huyết tương máu gây biến đổi sinh lý ấu trùng.
• Độc với thể sống kể người, phổ diệt sâu rộng Do cần loại bỏ chủng sinh độc tố này.
3 δ-endotoxin: ICPs (insecticidal crystal proteins) hay protein Cry hay thể vùi tạo thành giai đoạn tạo bào tử Tác dụng độc đặc hiệu với lồi
trùng Lượng tinh thể độc phổ tác dụng thay đổi theo chủng.
• Protein kết tinh gồm 640 – 1200 a/a Chủ yếu a glutamic, a asparaginic chiếm 20% tổng số a/a Điểm đẳng điện thấp (pI = 4,4).
• Tỷ lệ axit amin systein thấp (<2%) gây tính khơng tan tinh thể.
• Ngồi chứa: hydratcacbon 5,6%; nguyên tố C, N, H, O, S 19 nguyên tố Ca, Mg, Si, Fe…
• Hình dạng: đa dạng
(34)Cấu trúc tinh thể protein
Cấu trúc không gian tinh thể Cry3
1 Vùng 1
: chuỗi xoắn α kỵ nước bao
quanh chuỗi xoắn α lưỡng tính
khác Chứa 290 axít amin chứa đầu
N Chịu trách nhiệm tạo lỗ rò ruột
sâu.
2 Vùng 2
: từ a.a 291 đến a.a 500 Chứa
tấm β chuỗi xoắn α ngắn Chịu
trách nhiệm gắn với thụ thể.
3 Vùng 3
: Từ a.a 501 đến a.a 644 Chứa
12 β chứa đầu C Chịu trách nhiệm
nhận biết điểm gắn kết
(35)(36)Thụ thể
Màng tế bào
III II
I
Tinh thể độc
III
II I
I III
II
I III
(37)