Tối ưu hóa quá trình chiết xuất phycocyanin từ tảo arthrospira (spirulina) platensis bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (rsm)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƢỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỐI ƢU HĨA Q TRÌNH CHIẾT XUẤT PHYCOCYANIN TỪ TẢO ARTHROSPIRA (SPIRULINA) PLATENSIS BẰNG PHƢƠNG PHÁP BỀ MẶT ĐÁP ỨNG (RSM) TRẦN THỊ KIM ANH Đà Nẵng - 2020 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƢỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỐI ƢU HÓA QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT PHYCOCYANIN TỪ TẢO ARTHROSPIRA (SPIRULINA) PLATENSIS BẰNG PHƢƠNG PHÁP BỀ MẶT ĐÁP ỨNG (RSM) Ngành: Công nghệ sinh học Khóa: 2016-2020 Sinh viên: Trần Thị Kim Anh Ngƣời hƣớng dẫn: TS Phạm Thị Mỹ Đà Nẵng – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu tác giả chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác trƣớc Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tác giả khóa luận Trần Thị Kim Anh i LỜI CẢM ƠN Ðể hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô môn Công nghệ sinh học, khoa Sinh – Môi trƣờng, trƣờng Ðại học Sƣ phạm – Ðại học Ðà Nẵng Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến cô TS Phạm Thị Mỹ thầy TS Trịnh Đăng Mậu, ngƣời tận tâm hƣớng dẫn định hƣớng tận tình dạy tơi kiến thức mặt chuyên môn nhƣ tạo điều kiện hỗ trợ tơi suốt q trình thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn anh Phan Nhật Trƣờng giúp đỡ, hƣớng dẫn kỹ bổ ích suốt thời gian thực đề tài Cảm ơn anh theo sát, động viên thực đề tài nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo khoa Sinh – Môi trƣờng, ngƣời trực tiếp giảng dạy, truyền đạt nhƣ giúp trau dồi kiến thức kĩ thực thí nghiệm Đồng thời, tạo điều kiện trang thiết bị, dụng cụ hóa chất để tơi thực tốt đề tài nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày….tháng….năm 2020 Sinh viên Trần Thị Kim Anh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii TÓM TẮT ix MỞ ĐẦU 1.TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 2.1 Mục tiêu tổng quát 2.2 Mục tiêu cụ thể 3.Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ VI TẢO ARTHROSPIRA (SPIRULINA) PLATENSIS 1.2 TỔNG QUAN VỀ PHYCOCYANIN 1.2.1 Giới thiệu chung phycocyanin 1.2.2 Công dụng phycocyanin 1.3 CÁC ĐIỀU KIỆN ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT PHYCOCYANIN TỪ TẢO ARTHROSPIRA (SPIRULINA) PLATENSIS 1.3.1 Các phƣơng pháp phá vỡ tế bào iii 1.3.2 Dung môi chiết xuất 1.4 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PHƢƠNG PHÁP BỀ MẶT ĐÁP ỨNG (RSM) 11 1.4.1 Giới thiệu 11 1.4.2 Một số ứng dụng 13 1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VÀ THẾ GIỚI 14 1.5.1 Tình hình nghiên cứu nƣớc 14 1.5.2 Tình hình nghiên cứu giới 14 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 VẬT LIỆU 19 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.2.1 Quy trình chiết Phycocyanin từ sinh khối tảo khô 19 2.2.2 Tối ƣu hóa suất chiết xuất phycocyanin phƣơng pháp đáp ứng bề mặt 20 2.2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu 21 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 HIỆU QUẢ TÁCH CHIẾT PHYCOCYANIN TỪ ARTHROSPIRA PLATENSIS CÓ HỖ TRỢ SIÊU ÂM VỚI HAI LOẠI DUNG MÔI CHIẾT KHÁC NHAU 22 3.1.1 Ảnh hƣởng dung môi đến độ tinh (EP) phycocyanin 22 3.1.2 Ảnh hƣởng dung môi đến suất chiết xuất phycocyanin tảo Spirulina platensis 23 3.2 TỐI ƢU HÓA ĐIIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT ĐẾN NĂNG SUẤT PHYCOCYANIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP BỀ MẶT ĐÁP ỨNG 26 3.2.1 Amoni clorua 0,05M 26 3.2.2 Natri phosphat 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 iv 1.KẾT LUẬN 34 2.KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A.Platensis Arthrospira platensis BBD Box-Behnken design CCD Central composite design EP Độ tinh FFD Full factorial design LHD Latin hypecube design OD Optical density PC Phycocyanin RSM Phƣơng pháp bề mặt đáp ứng UAE Siêu âm Y Năng suất chiết vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 1.2 Tên bảng Các loại dung môi khác chiết xuất phycocyanin từ Arthrospira (spirulina) platensis Tóm tắt nghiên cứu gần đƣợc báo cáo việc chiết xuất nguyên liệu thực vật đƣợc tối ƣu hóa RSM Trang 10 13-14 2.1 Thể giá trị thực biến độc lập mã thí nghiệm 21 3.1 Ảnh hƣởng dung mơi đến độ tinh phycocyanin 22 3.2 3.3 Ảnh hƣởng dung môi đến suất chiết phycocyanin Các nghiệm thức thí nghiệm tối ƣu hóa kết Amoni clorua 0,05M 23 26 Thể giá trị ƣớc tính mức độ ý nghĩa số 3.4 hồi quy mơ hình dự đoán suất chiết xuất phycocyanin amoni clorua 0,05M dựa biến pH 27 dung môi, thời gian nhiệt độ siêu âm 3.5 3.6 Các giá trị tối ƣu suất chiết phycocyanin thu đƣợc từ phƣơng trình dự đốn suất Các nghiệm thức thí nghiệm tối ƣu hóa kết Natri phosphat 30 30-31 Thể giá trị ƣớc tính mức độ ý nghĩa số 3.7 hồi quy mơ hình dự đốn suất chiết xuất phycocyanin Natri phosphat dựa biến pH 31 dung môi, thời gian nhiệt độ siêu âm 3.8 Thể giá trị khảo sát biến độc lập mã thí nghiệm vii 33 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc Phycocyanin 1.2 Đặc tính huỳnh quang phycocyanin (PC) 1.3 2.1 3.1 3.2 Quy trình thiết kế mơ hình tối ƣu hóa phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Quy trình chiết xuất phycocyanin từ sinh khối khô Arthrospira platensis Độ tinh phycocyanin dung môi khác Năng suất chiết xuất phycocyanin dung mơi khác Mơ hình phản ứng 3.3 12 19 22 24 bề mặt 2D 3D suất phycocyanin bị ảnh hƣởng biến độc lập: Thời gian, nhiệt độ pH phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 28 Amoni clorua 0,05M Mơ hình phản ứng 3.4 bề mặt 2D 3D suất phycocyanin bị ảnh hƣởng biến độc lập: Thời gian, nhiệt độ pH phƣơng pháp đáp ứng bề mặt (RSM) viii 32 từ 30,5mg/g đến 31mg/g khoảng nhiệt độ từ 30 đến 37,5℃ (hình 3.3) Điều tƣơng tự với báo cáo Kadam cs, 2015 nhiệt độ đƣợc coi thông số quan trọng để chiết xuất hợp chất hoạt tính sinh học Những nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ đến chiết xuất hợp chất hoạt tính sinh học đƣợc thể chiết xuất euphenol từ Euphorbia tirucalli (Vuong cs, 2012), hợp chất phenolic từ chiết xuất bánh hạt (Teh and Birch, 2014) ,trans-lycopene từ bƣởi đỏ (Xu and Pan, 2013) Các nghiên cứu báo cáo việc gia tăng nhiệt độ dẫn đến suất thu hồi hợp chất có hoạt tính sinh học cao khả phá hủy tế bào nhƣ khả hịa tan hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc thúc đẩy (Teh and Birch, 2014) Tuy nhiên, nhiệt độ vƣợt ngƣỡng tối ƣu làm biến tính protein, làm giảm hàm lƣợng phycocyanin chiết Bảng 3.4 cho thấy thời gian chiết xuất ảnh hƣởng không đáng kể đến suất chiết phycocyanin, với giá trị p-values > 0,05 Trong điều kiện nhiệt độ 37℃ pH = 6,7, suất phycocyanin tăng từ 29 đến 31 mg/g thời gian chiết từ 20 phút đến 44 phút Sau 44 phút, thay đổi đƣờng cong suất không đáng kể, tức tăng thời gian siêu âm sau 44 phút không làm tăng thêm suất chiết phycocyanin Şahin and Samlı, 2013 báo cáo việc chiết xuất hợp chất hoạt tính sinh học khỏi nguyên liệu thực vật bao gồm hai trình liên tiếp: "rửa trơi", hợp chất đƣợc hịa tan nhanh chóng vào dung mơi, tiếp đến "khuếch tán chậm", xảy trình khuếch tán hợp chất hoạt tính sinh học vào dung mơi với tốc độ chậm Ngồi ra, bảng 3.4 cho thấy pH dung môi chiết ảnh hƣởng đáng kể đến suất chiết xuất phycocyanin (p=0,0116 ảnh hƣởng tuyến tính p=0,0002 với ảnh hƣởng bậc 2) Trong điều kiện nhiệt độ cố định (37℃) thời gian không đổi (44 phút), suất phycocyanin tăng từ 29 đến 31 mg/g pH dung môi chiết từ 5,5 đến 6,7 Một điều kiện tối ƣu đƣợc đề xuất từ mơ hình, cụ thể x1= -0,221, x2= -0,481 x3=0,857, tƣơng ứng với pH = 6,78, nhiệt độ = 37,6℃ thời gian = 43,57 phút Với giá trị này, suất chiết tối đa đƣợc dự đoán đạt theo mơ hình (2) đạt 31,85mg/g (Bảng 3.5) 29 Bảng 3.5 Các giá trị tối ƣu suất chiết phycocyanin thu đƣợc từ phƣơng trình dự đốn suất (1) Biến Điều kiện tối ƣu (Xopt) Năng suất tối ƣu(Yopt) Mã hóa Giá trị thực pH -0,221 6,78 Nhiệt độ -0,481 37,6 (℃) Thời gian 0,857 43,57 (phút) Dự đoán Thực nghiệm Y = 31,85 Y = 31,72±1,065 (mg/g) (mg/g) *Các giá trị thí nghiệm lấy từ thí nghiệm điều kiện quy trình tối ưu Để xác minh dự đốn này, thí nghiệm bổ sung với tổ hợp điều kiện tối ƣu đƣợc thực với lần lặp lại Năng suất chiết trung bình qua thực nghiệm thu đƣợc 31,72 ± 1,065 mg/g xấp xỉ với giá trị dự đoán Điều chứng minh mơ hình có giá trị thực tiễn 3.2.2 Natri phosphat Giá trị yếu tố ảnh hƣởng nghiệm thức kết suất dự đoán nhƣ suất thực nghiệm sử dụng dung mơi Natri phosphat đƣợc trình bày Bảng 3.6 Bảng 3.6 Các nghiệm thức thí nghiệm tối ƣu hóa kết Điều kiện thực tế Mã code Thời gian (phút) Nhiệt độ (độ C) pH Thời gian (phút) Nhiệt độ (độ C) pH Năng suất dự đốn mơ hình (mg/g) Năng suất thực tế (mg/g) 0 35 40 27,79 27,31 -1 -1 25 35 27,86 27,48 0 35 40 27,79 27,16 -1 -1 25 45 24,50 24,12 1 45 45 22,29 21,91 0 35 40 27,79 27,87 -1 -1 45 35 31,88 31,5 0 35 40 27,79 27,75 0 1,5 35 40 8,5 28,36 28,7 35 45 26,83 27,59 0 -1,5 35 40 5,5 30,75 31,09 30 0 35 40 27,79 28,14 -1,5 0 20 40 27,33 27,67 -1 35 35 25,66 26,42 0 35 40 27,79 27,15 1,5 0 50 40 26,43 26,77 Từ kết trên, mơ hình bề mặt đáp ứng đƣợc xây dựng có phƣơng trình nhƣ sau: Y = 27,788 - 0,7967x1 + 0,585x2 - 0,3x3 + 0,7525x1 x2 - 3,8225 x1 x3 0,7608x2x3 + 0,78673x12 - 1,541 x2 - 0,40216 x3 (3) Bảng 3.7 Thể giá trị ƣớc tính mức độ ý nghĩa số hồi quy mơ hình dự đốn suất chiết xuất phycocyanin Natri phosphat dựa biến pH dung môi, thời gian nhiệt độ siêu âm Biến hồi quy Hằng số hồi quy p - value β 27,78794 7,909*10-11 *** pH (x1 ) -0,7967 0,06409 Temp (x2) 0,585 0,30994 Time (x3) -0,3 0,4264 pH:Temp ( x1: x2) 0,7525 0,19255 pH:Time (x1 :x3 ) -3,8225 0,00104 ** Temp:Time (x2 :x3 ) -0,7608 0,18834 pH2 (x1) 0,78673 0,01791 * Temp2 (x2) -1,541 0,00779 ** Time2 (x3) -0,4022 0,14981 Các thông số mơ hình Adjusted R-squared p-value Lack of fit 0,8894 0,002063 ** 0,012634 *Giá trị có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy (.): 90%; (*): 95%; (**): 99%; (***): 99,99% Kết từ bảng cho thấy, ảnh hƣởng đơn lẻ theo dạng tuyến tính yếu tố khảo sát thời gian siêu âm, nhiệt độ siêu âm pH dung môi đến suất chiết phycocyanin không đáng kể (p>0,05) Tuy nhiên, ảnh hƣởng tƣơng tác pH thời gian lại có ý nghĩa thay đổi suất, với giá trị p-value=0,00104 < 0,05 Đây 31 cặp yếu tố quan trọng mơ hình với hệ số ảnh hƣởng -3,8225 Ngoài ra, pH nhiệt độ cho thấy ảnh hƣởng đáng kể theo dạng bậc mức ý nghĩa 95% Giá trị R2adj 0,8894 thể mức độ giải thích biến động suất chiết dựa biến đƣợc khảo sát cao, đạt 88,94% với độ tin cậy 99,99% Mơ hình tối ƣu hóa cho thấy giá trị tối ƣu đƣợc đề xuất dựa mô hình x 1= -0,08, x2= 0,2192, x3= -0,1984, tƣơng ứng với điều kiện pH = 6,92, nhiệt độ = 41,1℃ , thời gian = 33,02phút Với giá trị này, suất chiết tối đa dự đoán đạt đƣợc 27,91mg/g Hình 3.4 Mơ hình phản ứng bề mặt 2D 3D suất phycocyanin bị ảnh hƣởng biến độc lập: Thời gian, nhiệt độ pH phƣơng pháp đáp ứng bề mặt Với giá trị p-value mơ hình 0,002063 (p