Nghiên cứu ứng dụng DNA mã vạch trong định danh một số loài brachionus SPP tại đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MƠI TRƯỜNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG DNA MÃ VẠCH TRONG ĐỊNH DANH MỘT SỐ LOÀI BRACHIONUS SPP TẠI ĐÀ NẴNG TĂNG HIỆP TÙNG Đà Nẵng, năm 2020 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MƠI TRƯỜNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG DNA MÃ VẠCH TRONG ĐỊNH DANH MỘT SỐ LOÀI BRACHIONUS SPP TẠI ĐÀ NẴNG Ngành: Cơng nghệ sinh học Khóa: 2016 – 2020 Sinh viên: Tăng Hiệp Tùng Người hướng dẫn: TS Nguyễn Minh Lý Đà Nẵng, năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài "Nghiên cứu kỹ thuật tách chiết DNA định danh loài thuộc chi Brachionus số thủy vực địa bàn thành phố Đà Nẵng" cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Tăng Hiệp Tùng i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng, hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Minh Lý TS Trịnh Đăng Mậu tận tình dẫn, góp ý, tạo điều kiện tốt suốt trình thực hồn thành khóa luận Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên, nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực khóa luận Tác giả Tăng Hiệp Tùng ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài .1 Mục tiêu đề tài .1 Ý nghĩa đề tài .2 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Brachionus 1.2 Phương pháp định danh loài động vật phù du 1.2.1 Trắc sinh học .3 1.2.2 Mã vạch DNA (DNA barcoding) 1.4 Tình hình nghiên cứu phân loại động vật phù du nước giới 1.4.1 Trên giới 1.4.2 Trong nước CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .7 2.1 Đối tượng nghiên cứu .7 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.4 Phương pháp nghiên cứu: 2.4.1 Phương pháp thu mẫu: 2.4.2 Phương pháp trắc sinh học .8 2.4.3 Tiền xử lý tách chiết DNA 2.4.4 Tách chiết DNA 2.4.5 Phương pháp PCR .9 iii 2.4.6 Điện di gel agarose .9 2.4.7 Giải trình tự xây dựng phân loại 10 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .11 3.1 Đánh giá phương pháp tiền xử lý mẫu tách chiết DNA 11 3.1.1 Đánh giá hiệu quy trình tách chiết DNA 11 3.1.2 Đánh giá hiệu phương pháp tách chiết DNA có tiền xử lý nghiền khơ 12 3.1.3 Đánh giá phương pháp tiền xử lý mẫu nhiệt độ thấp 13 3.2 Đa dạng thành phần loài thuộc chi Brachionus số thủy vực nước địa bàn thành phố Đà Nẵng 15 3.3 Đặc điểm hình thái học lồi thuộc chi Brachionus 18 3.4 Định danh loài sinh học phân tử xây dựng phân loại GMYC 21 Kết luận 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABGD Automatic Barcode Gap Discovery COI cytochrom c oxydase tiểu đơn vị I cs cộng DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ESS Effective Sample Sizes GMYC Generalized Mixed Yule Coalescent LDA Linear discriminant analysis MCC Maximum Clade Credibility MCMC Markov Chain Monte Carlo NCBI National Center for Biotechnology Information PCA Principal Component Analysis PCR Polymerase Chain Reaction – Phản ứng khuếch đại chuỗi TAE Tris – Acetic acid – EDTA v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Tên bảng Trang 2.1 Địa điểm thu mẫu thực địa 3.1 Hiệu phương pháp tách chiết DNA khơng có tiền xử lý 11 3.2 Quy trình tách chiết DNA tiền xử lý với nghiền khơ 13 3.3 Thành phần lồi thuộc chi Brachionus thủy vực lấy mẫu 17 3.4 Mức độ khác biệt hình thái lồi (%) 20 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình ảnh Trang 3.1 Hiệu phương pháp tách chiết không qua tiền xử lý 12 3.2 So sánh hiệu phương pháp tách chiết khô ướt 14 3.3 Sản phẩm PCR mẫu tiền xử lý với nhiệt độ thấp 15 3.4 Hiệu phương pháp tiền xử lý với nhiệt độ thấp mẫu 16 cố định ethanol thời gian khác 3.5 Các loài thuộc chi Brachionus từ thủy vực thu mẫu 18 3.6 Phân tích thành phần (PCA) cho thấy khác biệt kích 19 thước thể lồi thủy vực thu mẫu 3.7 Phân tích khác biệt tuyến tính (LDA) cho thấy khoảng cách 20 lồi từ thủy vực dựa kích thước thể 3.8 Cluster Dendrogram thể khoảng cách hình thái học 21 lồi thuộc chi Brachionus từ thủy vực lấy mẫu 3.9 Biểu đồ dòng dõi qua thời gian (LTT) dựa hiệu chỉnh thời 22 gian thu từ tất 31 trình tự đoạn gen COI 3.10 Cây GMYC số lồi thuộc chi Brachionus dựa trình tự đoạn gen COI với lognormal relax clock vii 23 Hình 3.3 Sản phẩm PCR mẫu tiền xử lý với nhiệt độ thấp Lane 1: 100 bp ladder; Lane 2: cá thể B calyciflorus (2020) với phương pháp chelex có tiền xử lý nhiệt độ thấp; Lane 3: cá thể B calyciflorus (2020) với phương pháp chelex có tiền xử lý nhiệt độ thấp; Lane 4: cá thể B calyciflorus (2020) với phương pháp HotSHOT có tiền xử lý nhiệt độ thấp; Lane 5: cá thể B calyciflorus (2018) với phương pháp chelex có tiền xử lý nhiệt độ thấp; Lane 6: cá thể B calyciflorus (2018) với phương pháp HotSHOT có tiền xử lý nhiệt độ thấp Như kết Hình 3.3., phương pháp đông lạnh cho kết tốt mẫu cố định thời gian ngắn số lượng q (1 cá thể) nồng độ DNA khơng đủ để khuếch đại PCR Mẫu tách chiết chelex cho band đậm thể tích sau chiết so với phương pháp chelex, nhiên hạt chelex cịn lại sau q trình tách chiết làm giảm thể tích DNA chiết khó khăn cho giai đoạn PCR thể tích lớn để giải trình tự Ngoài ra, hạt chelex bị hút theo mẫu gây ức chế phản ứng PCR tác dụng hút ion kim loại hóa trị Trong đệm chiết kiềm phương pháp HotSHOT tác động để mẫu nhiều chất chất oxy hóa mạnh NaOH nhiệt độ cao thể tích mẫu nhiều giúp PCR thể thích lớn giải trình tự dễ dàng Đối với mẫu cố định ethanol thời gian dài, phương pháp đơng lạnh khơng có hiệu dù với số lượng cá thể nhiều nguyên nhân bị cố định thời gian dài ethanol, mẫu bị co lại khiến vỏ giáp khó bị phá vỡ tác động học, bên cạnh ethanol thấm sâu vào tế bào làm giảm hiệu đệm chiết DNA Do cần phương pháp tiền xử lý để tách chiết DNA thành công 14 Mặc dù, phương pháp tiền xử lý với nhiệt độ thấp đề xuất Moka cs (2015) để tách chiết DNA từ mẫu rotifer nhỏ Brachionus nhiên thành cơng mẫu cố định ethanol thời gian ngắn Phương pháp áp dụng mẫu cố định 40 ngày, nhiên nên sử dụng mẫu cố định ethanol tháng để đạt hiệu tốt Hình 3.4 Hiệu phương pháp tiền xử lý với nhiệt độ thấp mẫu cố định ethanol thời gian khác Lane 1: cá thể B calyciflorus cố định ethanol 70 ngày; Lane 2: cá thể B calyciflorus cố định ethanol 40 ngày; Lane 3: cá thể B calyciflorus cố định ethanol ngày; Lane 4: 100 bp ladder Như vậy, tiền xử lý bước cần thiết để tách chiết DNA từ mẫu Brachionus thủy vực Đà Nẵng Trong đó, phương pháp tiền xử lý mẫu với nghiền mẫu khơ có hiệu với mẫu lẫn mẫu cố định ethanol thời gian dài, nhiên độ ổn định phương pháp chưa cao Phương pháp tách chiết DNA với tiền xử lý với nhiệt độ thấp (-22oC) mang lại hiệu cao ổn định để tách chiết nucleic acid từ Brachionus dù khơng có hiệu với mẫu cố định ethanol thời gian dài 3.2 Đa dạng thành phần loài thuộc chi Brachionus số thủy vực nước địa bàn thành phố Đà Nẵng 15 Dựa tài liệu Koste & Shiel (1987), tơi phân loại lồi từ địa điểm thu mẫu Trong có lồi tìm thấy mẫu thu từ năm 2018, lồi cịn lại tìm thấy mẫu thu gần Bảng 3.3 Thành phần loài thuộc chi Brachionus thủy vực lấy mẫu Hồ Sen Hồ Công viên 29/03 Hồ Bàu Tràm B angularis X X X B calyciflorus X X X B caudatus X O O B diversicornis X O O B falcatus X O O B forficula X O O B quadridentatus X X O Tên lồi Chú thích: X: có xuất lồi thủy vực nghiên cứu; O: khơng có xuất lồi thủy vực nghiên cứu 16 A C B D F E G H Hình 3.5 Các lồi thuộc chi Brachionus từ thủy vực thu mẫu (A), (B) B angularis; (C) B calyciflorus; (D) B caudatus; (E) B diversicornis; (F) B falcatus; (G) B forficula; (H) B quadridentatus 17 3.3 Đặc điểm hình thái học lồi thuộc chi Brachionus Tổng cộng 81 cá thể loài từ thủy vực sử dụng để phân tích hình thái học Hình 3.6 Phân tích thành phần (PCA) cho thấy khác biệt kích thước thể loài thủy vực thu mẫu Kết phân tích cho thấy, khác biệt kích thước thể dùng để phân định lồi chi Brachionus Trong đó, PC1 giải thích 63,81% PC2 giải thích 19,76% khác biệt kích thước thể loài Theo trục PC1, số đo chi phối đến khác biệt hình thái loài chiều dài (46,89%), chiều rộng (48,28%) kích thước gờ lỗ đầu (47,93%) Theo trục PC2, Chiều dài gai đơi yếu tố ảnh hưởng đến khác biệt hình thái lồi (80,71%) Dựa vào chiều dài thể (Dl), chiều rộng thể (Dw) kích thước gờ lỗ đầu (Haw) ta phân biệt nhóm hình thái khác với nhóm có số đo kích thước lớn (B falcatus, B diversicornis, B calyciflorus, B quadridentatus B caudatus) nhóm cịn lại có kích thước nhỏ (B angularis, B forficula) Sự khác biệt kích thước gai sau (Lpl) ta phân biệt nhóm có 18 chiều dài gai đuôi dài (B falcatus, B diversicornis, B forficula) với nhóm có khơng có gai có gai ngắn (B calyciflorus B quadridentatus, B angularis B caudatus) Hình 3.7 Phân tích khác biệt tuyến tính (LDA) cho thấy khoảng cách lồi từ thủy vực dựa kích thước thể Phân tích LDA cho hình thái dựa kích thước thể nhóm lồi hồn tồn tách biệt với Dựa đó, phân loại dựa khoảng cách hình thái học loài xây dựng Bảng 3.4 Mức độ khác biệt hình thái lồi (%) ang1 ang3 cal cau div fal ang3 2,8870 cal 14,8354 15,1434 cau 5,8555 4,9150 11,2552 div 24,21256 23,9219 19,8656 20,3385 fal 15,2956 14,4263 16,0119 11,1441 15,6980 for 8,4592 8,5054 13,9220 6,5161 18,3065 7,6531 quad2 11,4094 10,3299 8,5925 6,8711 19,2203 11,2016 19 for 9,5080 Hình 3.8 Cluster Dendrogram thể khoảng cách hình thái học loài thuộc chi Brachionus từ thủy vực lấy mẫu Về hình thái, B caudatus B angularis có khoảng cách nhất, B diversicornis khác lồi cịn lại Mặc dù, tơi chia B angularis thành dạng hình thái có phần khác biệt chúng (Hình 3.5 A, B), phân tích hình thái lại cho kết khơng khác biệt dạng Điều kích thước mà tơi chọn để phân tích chưa phù hợp mẫu nhỏ B angularis khác biệt kiểu chưa đủ để phân thành dạng riêng, nhiên đáng để nghiên cứu sâu 20 3.4 Định danh loài sinh học phân tử xây dựng phân loại GMYC Năm mẫu thuộc chi Brachionus sau tách chiết DNA gửi giải trình tự so sánh với trình tự COI lồi thuộc chi Brachionus công bố NCBI công cụ BLAST online Tuy nhiên, vấn đề thời gian trình gửi mẫu, 3/5 mẫu khơng kịp giải trình tự phân tích di truyền Kết đối chiếu trình tự với liệu NCBI cho thấy, mẫu B calyciflorus có mức độ tương đồng cao trình tự COI B calyciflorus công bố với tỉ lệ cao 99,44% Tuy nhiên, B falcatus mức độ tương đồng với liệu NCBI thấp (