Nghiên cứu cảm ứng phát sinh callus từ tiểu bào tử dưa lưới (cucumis melo l ) in vitro

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MƠI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CẢM ỨNG PHÁT SINH CALLUS TỪ TIỂU BÀO TỬ DƯA LƯỚI (CUCUMIS MELO L.) IN VITRO HUYỀN TÔN NỮ BẢO TIÊN Đà Nẵng, năm 2020 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MƠI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CẢM ỨNG PHÁT SINH CALLUS TỪ TIỂU BÀO TỬ DƯA LƯỚI (CUCUMIS MELO L.) IN VITRO Ngành: Cơng nghệ sinh học Khóa: 2016-2020 Sinh viên: Huyền Tôn Nữ Bảo Tiên Người hướng dẫn: TS Nguyễn Minh Lý Đà Nẵng, năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Mọi số liệu, hình ảnh, kết hồn tồn lấy từ thí nghiệm sau thực Các tài liệu có tìm sách, báo, tạp chí… nước giới đáng tin cậy xác Tác giả Huyền Tơn Nữ Bảo Tiên i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin chân thành cảm ơn BGH trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng, khoa Sinh – Môi trường, thầy cô chuyên ngành Công nghệ Sinh học truyền dạy cho nhiều việc làm quen phát triển kĩ thực hành thí nghiệm q trình tơi thực đề tài Khố luận, cũng năm học đại học Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến TS Nguyễn Minh Lý người thầy tâm huyết tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi định hướng cho suốt q trình thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cảm ơn bạn 16CNSH, 17CNSH ln hỗ trợ nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình tất bạn bè ln động viên, khích lệ tơi về vật chất lẫn tinh thần để đạt kết tốt Xin chân thành cảm ơn! ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học .2 4.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về dưa lưới 1.1.1 Đặc điểm sinh học 1.1.2 Giá trị dinh dưỡng 1.2 Kỹ thuật nuôi cấy tiểu bào tử tạo đơn bội 1.2.1 Giới thiệu chung 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu nuôi cấy tách rời tiểu bào tử 1.3 Tình hình nghiên cứu ni cấy tiểu bào tử tạo đơn bội kép 13 1.3.1 Các nghiên cứu nước .13 1.3.2 Các nghiên cứu nước .14 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .17 2.1 Vật liệu 17 2.2 Phạm vi nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Phương pháp đánh giá giai đoạn phát triển tiểu bào tử đặc điểm hình thái nụ hoa, bao phấn 17 2.3.2 Quy trình tiến hành ni cấy tách rời tiểu bào tử .18 2.3.3 Phương pháp tạo callus đơn bội từ tiểu bào tử 21 2.3.4 Đánh giá khả sống phát triển tiểu bào tử thời gian nuôi cấy .22 2.3.5 Đánh giá trình hình thành callus môi trường nuôi cấy .23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 24 iii 3.1 Mối quan hệ giai đoạn phát triển tiểu bào tử đặc điểm nụ hoa, bao phấn 24 3.2 Đánh giá số lượng khả sống tiểu bào tử trước nuôi cấy 31 3.3 Ảnh hưởng mật độ nuôi cấy kích thước nụ hoa đến khả phát sinh callus tiểu bào tử 33 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ kích thước nụ hoa đến khả cảm ứng tiểu bào tử .34 3.5 Đánh giá khả sống tiểu bào tử q trình ni cấy 36 3.6 Đánh giá phát triển tiểu bào tử trình hình thành callus môi trường nuôi cấy .36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 Kết luận 40 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT MS: Murashige Skoog (1962) cs: cộng g/l: gam/lit DH: Double Haploids DAPI: 4’,6-diamidino-2-phenylindole MDE: Microspore-derived Embryo i DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 Tên bảng Đặc điểm hình thái nụ hoa bao phấn Tỷ lệ sống tiểu bào tử kích thước khác thời điểm T0 Ảnh hưởng tương tác mật độ tiểu bào tử kích thước nụ hoa đến khả phát sinh callus Ảnh hưởng tương tác nhiệt độ kích thước nụ hoa đến khả phát sinh callus từ tiểu bào tử Tỷ lệ sống tiểu bào tử thời điểm khác ii Trang 27 34 35 36 37 DANH MỤC HÌNH ẢNH Tên hình vẽ Hình 1.1 Các loại dưa lưới khác theo phân loại Guis cs (2007) Trang 2.1 Nụ hoa dưa lưới 17 2.2 Sơ đồ quy trình ni cấy tiểu bào tử 19 3.1 Các giai đoạn phát triển tiểu bào tử dưa Kim Hồng Ngọc 26 3.2 3.3 Sự thay đổi hình thái nụ hoa bao phấn khoảng kích thước khác Mối quan hệ thơng số đo với giai đoạn phát triển tiểu bào tử 26 29 Mối tương quan chiều dài nụ hoa (A), chiều rộng nụ hoa 3.4 (B), chiều dài tràng hoa (C) với giai đoạn phát triển 30 tiểu bào tử 3.5 Số lượng tiểu bào tử nụ hoa kích thước nụ khác 32 3.6 Sự phát triển tiểu bào tử q trình ni cấy 37 3.7 Sự phát triển callus tiểu bào tử dưa lưới in vitro 38 3.8 Sự phát sinh phôi môi trường nuôi cấy tiểu bào tử dưa lưới iii 38 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MƠI TRƯỜNG TĨM TẮT ĐỀ TÀI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài NGHIÊN CỨU CẢM ỨNG PHÁT SINH CALLUS TỪ TIỂU BÀO TỬ DƯA LƯỚI (CUCUMIS MELO L.) IN VITRO Họ tên sinh viên Hùn Tơn Nữ Bảo Tiên Mã SV 315043161155 Khóa 2016 – 2020 Công nghệ tạo đơn bội kép in vitro lĩnh vực có tiềm có tính ứng dụng cao chương trình chọn tạo giống trồng với thời gian ngắn Kỹ thuật nuôi cấy tách rời tiểu bào tử kỹ thuật hữu ích cho sản xuất đơn bội kép thời gian ngắn Sự thành công kỹ thuật nuôi cấy tách rời tiểu bào tử chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố kiểu gen mẹ, giai đoạn phát triển tiểu bào tử, mật độ tiểu bào tử, xử lý sốc nhiệt, môi trường nuôi cấy, thiếu hụt môi trường yếu tố khác Trong nghiên cứu nuôi cấy tách rời tiểu bào tử dưa lưới (Cucumis melo L.) này, ảnh hưởng giai đoạn phát triển tiểu bào tử, mật độ nuôi cấy xử lý sốc nhiệt đến khả phát sinh callus đánh giá Bảy giai đoạn phát triển khác tiểu bào tử dưa lưới bao gồm giai đoạn phân bào, tetrad, đơn nhân sớm, đơn nhân giữa, đơn nhân muộn (không bào), hai nhân hạt phấn quan sát Mối tương quan giai đoạn phát triển tiểu bào tử thông số liên quan đến chiều dài chiều rộng nụ hoa, chiều dài tràng hoa xác lập Trong đó, mối tương quan mạnh chiều rộng nụ hoa với hệ số tương quan (r) 0,885, tiếp đến chiều dài nụ hoa r = 0,880 cuối chiều dài tràng hoa r = 0,876 Số lượng callus phát sinh cao (11,00±1,02) thu ni cấy nụ hoa có kích thước 7,0 – 7,9 mm chứa tiểu bào tử giai đoạn đơn nhân đơn nhân muộn môi trường MS có 130 g/L đường saccharose, khơng có chất điều hòa sinh trưởng, pH 5,7 – 5,8 với mật độ tiểu bào tử 4×104 Xử lý mẫu ni cấy nhiệt độ 40ºC 48 thích hợp cho phát sinh callus tất kích thước nụ hoa Khả sống tiểu bào tử sau ngày nuôi cấy đạt khoảng 75% Quá trình phát triển tiểu bào tử cũng phát sinh callus phôi quan sát đánh giá đặc điểm tế bào hình thái Sự hình thành callus từ tiểu bào tử cung cấp nguồn vật liệu ban đầu để tái sinh dưa lưới đơn bội kép, góp phần đẩy nhanh trình chọn tạo giống nước iv ni cấy 15×104 (tế bào/mL) nụ hoa dài 4,5 – 4,6 mm cho tỷ lệ phát sinh phôi cao 15,2±2,17 (Winarto and Teixeira, 2011) Mật độ nuôi cấy tiểu bào tử tăng lên làm giảm khả phát sinh callus Theo Winarto cs (2011), mật độ tiểu bào tử môi trường nuôi cấy cần thiết phải cao sức sống tiểu bào tử thời gian ni cấy thấp (