Khảo sát một số điều kiện đảm bảo an toàn thực phẩm trong kinh doanh thức ăn đường phố tại Tp Nha Trang

Khảo sát một số điều kiện đảm bảo an toàn thực phẩm trong kinh doanh thức ăn đường phố tại Tp Nha Trang.docxKhảo sát một số điều kiện đảm bảo an toàn thực phẩm trong kinh doanh thức ăn đường phố tại Tp Nha Trang.docxluận văn tốt nghiệp thạc sĩ

GVHD:Ths Nguyễn Anh Trinh Đồ án tốt nghiệp TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN ĐẢM BẢO AN TOÀN THỰC PHẨM TRONG KINH DOANH THỨC ĂN ĐƯỜNG PHỐ TẠI THÀNH PHỐ NHA TRANG GVHD: Ths NGUYỄN ANH TRINH Ths VÕ HỒNG VÂN SVTH: ĐÀO THỊ MINH HƯƠNG MSSV: 1091101058 Tp.HCM, tháng 10 năm 2012 SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN  Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn q thầy Khoa Cơng Nghệ Thực Phẩm Trường Đại học Kỹ Thuật – Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh tận tâm dạy, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quí báu năm em học trường Đặc biệt Th.S Nguyễn Anh Trinh hướng dẫn giúp đỡ tận tình thời gian em thực hồn thiện khóa luận Em xin chân thành cảm ơn: Ban lãnh đạo Chi Cục Vệ Sinh Thực Phẩm Thành phố Nha Trang, Th.S Võ Hồng Vân cô, chú, anh, chị công tác Viện Pasteur Nha Trang Trung tâm Y Tế Dự Phịng tỉnh Khánh Hịa tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian thực tập hồn thành khóa luận SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh Đồ án tốt nghiệp TÓM TẮT ĐỒ ÁN Đề tài: “Khảo sát số điều kiện đảm bảo an toàn thực phẩm kinh doanh thức ăn đường phố thành phố Nha Trang” Đề tài thực với nội dung chính: + Khảo sát số điều kiện bảo đảm ATTP sở kinh doanh thức ăn đường phố (TĂĐP) qua kiểm tra thực tế sở (Đánh giá qua phiếu điều tra) • Khảo sát điều kiện bảo đảm ATTP nơi bày bán TĂĐP • Khảo sát điều kiện bảo đảm ATTP nguyên liệu, dụng cụ ăn uống, chứa đựng thực phẩm người kinh doanh TĂĐP + Khảo sát nhận thức VSATTP chủ sở kinh doanh thức ăn đường phố + Tiến hành lấy mẫu xét nghiệm vi sinh bàn tay người bán hàng + Xét nghiệm hóa nhanh dụng cụ: tơ, chén, muỗng, đĩa Để xây dựng đề tài tham khảo tài liệu công tác quản lý, kiểm tra VSATTP từ Sở Y tế, báo cáo tổng kết Bộ Y tế, thông tư, nghị định, nghị quyết, định… dựa thực trạng thức ăn đường phố địa bàn Sau trình khảo sát theo quy trình, chúng tơi thống kê lại số liệu theo nội dung cần đánh giá để từ đưa giải pháp khắc phục, hướng khảo sát mới, kiến nghị cần thiết SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh Đồ án tốt nghiệp Qui trình khảo sát: Danh sách sở kinh doanh TĂĐP phường, xã (chọn ngẫu nhiên) Điều tra sở kinh doanh TĂĐP (phiếu điều tra) Điều tra nhận thức chủ sở kinh doanh TĂĐP bảo đảm VSATTP (phiếu điều tra) Thống kê số liệu Xử lý số liệu Tổng hợp Nhận xét, kết luận Đề xuất ý kiến SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang Test nhanh dụng cụ tô, chén, bát, đũa Lấy mẫu xét nghiệm vi sinh bàn tay người bán hàng, người chế biến, phục vụ bàn Phân tích mẫu GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC BẢNG BIỂU SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ATVSTP ATTP HCBVTV NĐTP PG TĂĐP TTNC VSATTP VSTP ASP BGA BGBL BS CAC DSP EMB FDA IFN KAP LDC MR NSP ONPG PSP SC SPS TSI TNF TTC VP VRBL VRBG XLD WHO SVTH: Đào Thị Minh Hương An toàn vệ sinh thực phẩm An tồn thực phẩm Hóa chất bảo vệ thực vật Ngộ độc thực phẩm Phụ gia Thức ăn đường phố Thể tích ni cấy Vệ sinh an tồn thực phẩm Vệ sinh thực phẩm Amnesic Shellfish Poisoning Brilliant Green Agar Green Bile Lactose 2% Brilliant Sulphite agar Codex Alimentarius Commission Diarrhetic Shellfish Poisoning Eozin Methyl Blue agar Food and Drug Administration Interferon Gramma K=Knowledge, A=Attitude, P=Practice Lysin Decarboxylation Methyl Red Neurotoxin Shellfish Poisoning O_ Nitrophenyl_β_D Galactopyranosidase Paralytic Shellfish Poisoning Selenite Cystine broth Sulphite Polymixin Sulphadiazin Triple Sugar Iron agar Tumor Necrosis Factor Triphenyl Tetrazoium Chlorit Voges Proskauer Oxoid violet Red Bile Lactose Oxoid violet Red Bile Glucose Xylose Lysine Desoxycholate World Health Organization Trang GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU  Tính cấp thiết đề tài Thức ăn đường phố thức ăn, đồ uống làm sẵn chế biến, nấu nướng chỗ, ăn bán hè phố, thực tế thực thơng qua hình thức bán rong, bày bán đường phố, nơi công cộng nơi tương tự Thức ăn đường phố thuận tiện, giá rẻ thích hợp cho người tiêu dùng Cùng với q trình phát triển đô thị, dịch vụ thức ăn đường phố phát triển nhanh Thức ăn đường phố loại hình kinh doanh đặc biệt đối tượng gây ngộ độc thực phẩm cao Theo Cục an toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP), thức ăn đường phố mối nguy lớn cho sức khỏe cộng đồng Thức ăn đường phố dễ bị ô nhiễm nguyên nhân ngộ độc thực phẩm bệnh truyền qua thực phẩm thiếu hạ tầng sở dịch vụ vệ sinh môi trường như: cung cấp nước sạch, xử lý rác, chất thải, cơng trình vệ sinh, trùng trung gian, thiếu tủ lạnh, trang thiết bị chế biến bảo quản Theo báo cáo Cục ATVSTP năm 2010 có 80% số mẫu dụng cụ bát, đũa, thìa bị bẩn; 85% số mẫu tay người bán hàng bị nhiễm E.coli Trong tháng hành động chất lượng vệ sinh an tồn thực phẩm 2010, đoàn kiểm tra chi cục ATVSTP tiến hành kiểm tra việc chấp hành qui định vệ sinh an toàn thực phẩm tiến hành lấy 51 mẫu vi sinh bàn tay nhân viên tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm thực phẩm có 32 mẫu (62,7%) nhiễm, cụ thể nhiễm E.coli: 11 mẫu (21,6%), nhiễm Staphylococcus aureus: 07 mẫu (13,7%), nhiễm Treptococcus faecalis: 24 mẫu (47,0%) Trong đó, khó kiểm sốt thức ăn đường phố đa dạng, động tạm thời, có tính chất mùa vụ Việc kiểm tra thức ăn đường phố cịn khó khăn thiếu lực, trang thiết bị Vì vậy, chương IV Luật An Tồn Thực Phẩm số 55/2010/QH12 có hiệu lực từ ngày tháng năm 2011 đưa mục riêng (mục 5) qui định điều kiện bảo đảm an toàn kinh doanh thức ăn đường phố Mặt khác, tỉnh Khánh Hịa tỉnh có tiềm du lịch lớn đặc biệt thành phố biển Nha Trang năm dịp hè, lễ tết thường thu hút số lượng lớn khách du lịch đến tham quan nghĩ dưỡng Vì việc đảm bảo VSATTP nói chung thức ăn đường phố SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh Đồ án tốt nghiệp nói riêng ln quan tâm cách mức, không đảm bảo sức khỏe cho người dân mà giữ thương hiệu cho du lịch Khánh Hòa Chính lý đồng ý Khoa Công Nghệ Thực Phẩm Chi cục an toàn vệ sinh thực phẩm Thành phố Nha Trang hướng dẫn Ths Nguyễn Anh Trinh Ths Võ Hồng Vân mà em tiến hành thực đề tài: “Khảo sát số điều kiện bảo đảm an toàn thực phẩm kinh doanh thức ăn đường phố thành phố Nha Trang”  Mục tiêu yêu cầu  Yêu cầu: + Khảo sát số điều kiện bảo đảm ATTP sở kinh doanh thức ăn đường phố (TĂĐP) qua kiểm tra thực tế sở (Đánh giá qua phiếu điều tra) • Khảo sát điều kiện bảo đảm ATTP nơi bày bán TĂĐP • Khảo sát điều kiện bảo đảm ATTP nguyên liệu, dụng cụ ăn uống, chứa đựng thực phẩm người kinh doanh TĂĐP + Khảo sát nhận thức VSATTP chủ sở kinh doanh thức ăn đường phố + Tiến hành lấy mẫu xét nghiệm vi sinh bàn tay người bán hàng + Xét nghiệm hóa nhanh dụng cụ: tơ, chén, muỗng, đĩa  Mục tiêu: Đánh giá kết điều tra sở chế biến kinh doanh thức ăn đường phố + Trình độ học vấn chủ sở kinh doanh thức ăn đường phố + Giới tính chủ sở kinh doanh thức ăn đường phố + Mặt hàng kinh doanh sở thức ăn đường phố + Điều kiện sở sở thức ăn đường phố + Thời gian bán hàng sở thức ăn đường phố + Hình thức chế biến sở thức ăn đường phố + Thực phẩm có nguồn gốc cố định sở + Tổ chức bếp sở thức ăn đường phố SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh Đồ án tốt nghiệp + Điều kiện vệ sinh sở sở thức ăn đường phố + Dụng cụ, thiết bị cúa sở thức ăn đường phố Đánh giá nhận thức, thái độ, thực hành VSATTP chủ sở kinh doanh thức ăn đường phố + Nhận thức nguy ô nhiễm thức ăn đường phố + Hiểu biết người chế biến nước + Hiểu biết tác dụng khu vực chế biến + Hiểu biết tác dụng đeo tạp dề, đội mũ người chế biến + Hiểu biết yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm cho người chế biến + Thực hành sử dụng nguồn nước người chế biến sở + Thực hành sử dụng dụng cụ người chế biến thực phẩm + Thái độ người chế biến với việc sử dụng phương tiện bảo hộ + Thái độ người chế biến phụ gia thực phẩm + Thực hành sử dụng bao gói thực phẩm người chế biến + Trang bị thùng rác sở thức ăn đường phố Đánh giá kết xét nghiệm (vi sinh hóa chất) giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm sở + Dụng cụ + Tay nhân viên + Thực phẩm + Hàn the SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh SVTH: Đào Thị Minh Hương Đồ án tốt nghiệp Trang 10 GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh Đồ án tốt nghiệp (Phương pháp thử theo TCVN 6846: 2007/ISO 7251:2005) - Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp MPN ba hàng ống, nuôi cấy lượng mẫu thử theo qui định môi trường BGBL 44,5ºC 24 – 48 Khuẩn lạc E.coli nhận dạng - - môi trường EMB xét nghiệm nghiệm pháp IMViC Chuẩn bị môi trường: + Canh thang BGBL (Brilliant green bile lactose 2%) + Thạch EMB (Eosin methylen blue agar) + Môi trường Clack lub + Thạch Simon Citrat + Thuốc thử Kovac’s + Dung dịch α- Naphtol + Dung dịch KOH + Dung dịch Methyl red Cách tiến hành: + Đồng pha loãng mẫu: pha loãng để thu dung dịch mẫu thử đậm độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, … giống phương pháp xác định vi khuẩn hiếu khí + Ở hàng thứ cấy vào ống 10ml dung dịch mẫu thử 10-1, hàng thứ cấy 1ml dung dịch mẫu 10-1, hàng thứ cấy 1ml dung dịch mẫu 10-2, ủ 44,5ºC 24 + Chọn ống nghiệm có phản ứng dương tính (biến màu môi trường từ xanh sang vàng vàng xanh sinh hơi) cấy sang môi trường thạch EMB, ủ 37ºC 24 Khuẩn lạc nghi ngờ E.coli có màu tím đỏ, có ánh kim, trịn, bờ đều, đường kính • khoảng 0,5mm + Thử phản ứng sinh hóa: tiến hành thử khuẩn lạc nghi ngờ E.coli Phản ứng indol: Cấy khuẩn lạc vào ống môi trường ure indol, ủ 37ºC 24 Kiểm tra khả sinh indol cách cho vào giọt thuốc thử Kovac’s Mơi trường • có vịng đỏ bề mặt: indol (+), có vịng vàng indol (-) Phản ứng Methyl Red (MR): Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào hai ống môi trường canh thang Clack lub, ủ 37ºC 24 Cho vào ống vài giọt methyl red pH trung tính hay kiềm yếu Mơi trường chuyển màu đỏ MR (+), mơi trường có màu vàng MR (-) SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang 86 GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh • Đồ án tốt nghiệp Kết phản ứng MR Phản ứng Voges-Proskauer (VP): Cho ống nghiệm Clack lub ni cấy cịn lại khoảng 0,6ml dung dịch α-Naphtol 0,2ml dung dịch Kali hydroxit, lắc để yên Môi trường chuyển sang màu đỏ eosin có vết đỏ eosin xuất hiện: VP (+), môi trường không chuyển màu đỏ VP (-) • Kết phản ứng VP Phản ứng Citrat: Cấy ria khuẩn lạc nghi ngờ mặt nghiêng thạch simon Citrat, ủ 37ºC 24 Mơi trường đổi sang màu xanh dương có khuẩn lạc mọc: Citrat - (-) Đọc kết xác định E.coli: + Môi trường BGBL đổi màu từ xanh sang vàng hay vàng xanh sinh + Có khuẩn lạc điển hình mọc mơi trường EMB + Trực khuẩn Gram (-) + Nghiệm pháp IMViC: I MR VP C + + Hoặc SVTH: Đào Thị Minh Hương - + Trang 87 - - GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh Đồ án tốt nghiệp  Xác định Staphylococcus aureus (Phương pháp thử theo TCVN 4830: 2005/ISO 6888-3:1999) - Nguyên tắc: Dựa khả sinh men Lecithinaza phân giải Lecithin Staphylococcus aureus mơi trường chọn lọc có bổ sung lịng đỏ trứng Kallitellurit, ni cấy 35-37ºC thời gian 24-48 Số lượng S aureus 1ml 1g mẫu kiểm nghiệm tính số khuẩn lạc điển hình mơi trường chọn lọc có phản ứng đơng huyết tương dương - tính Chuẩn bị môi trường: + Dung dịch đệm pepton + Môi trường Bair parker + Dung dịch Kali Tellyrit 1% + Dung dịch Sulphamezatin (Sulphadimidin, INH) 0,2% + Dung dịch Natri pyruvat 20% + Dung dịch lòng đỏ trứng + Canh thang tim óc (Brain Heart Infusion) + Huyết tương thỏ SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang 88 GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh - Đồ án tốt nghiệp Cách tiến hành: + Đồng pha loãng mẫu: Hút 50ml thực phẩm lỏng cho vào bình nón chứa sẵn 450ml dung dịch đệm pepton Lắc 2-3 phút, thu mẫu thử 10-1, tiếp tục pha loãng để thu dung dịch mẫu thử đậm độ 10-2, 10-3, 10-4,… tiến hành tiếp tục phương pháp xác định vi khuẩn hiếu khí + Cấy vào đĩa thạch Bairparker, đĩa 0.1ml mẫu thử ban đầu Lặp lại với đậm độ pha loãng khác Dùng que cấy gạt thủy tinh dàn mẫu mặt thạch (lưu ý: làm nhanh tốt để mẫu không bị khô) + Để 15 phút nhiệt độ phịng, sau lật ngược đĩa thạch để vào tủ ấm 3537±1ºC thời gian 28-48 + Thử khẳng định: Từ đĩa chọn khuẩn lạc điển hình để làm phản ứng sinh hóa, khuẩn lạc cho vào ống canh thang tăng sinh BHI, nuôi 35-37ºC thời gian 20-24 Cho 0,1ml môi trường nuôi cấy vào 0,3ml huyết tương thỏ, để 3537ºC thời gian 4-6 Phản ứng coi dương tính phần đơng huyết tương - chiếm ¾ thể tích dung dịch Đọc kết quả: + Đếm khuẩn lạc: Chỉ tính đĩa có từ 15-150 khuẩn lạc điển hình (màu đen, bóng, lồi, đường kính từ 1-1,5mm, bao quanh vùng đục sát khuẩn lạc vùng phía bên ngồi) khơng điển hình (khơng có vùng trong) + Nếu hai đĩa đậm độ liên tiếp từ 15-150 khuẩn lạc điển hình, tính gia trị trung bình hai đậm độ Nếu tỷ số giá trị trung bình cao hai đĩa đậm độ giá trị trung bình thấp đậm độ liền kề lớn lấy giá trị trung bình thấp + Nếu số khuẩn lạc thử khẳng định sinh hóa cho kết = 80% tổng số khuẩn lạc đếm tồn số khuẩn lạc coi S.aureus Trong tất trường hợp khác, số khuẩn lạc S.aureus tính sau: Ví dụ: Số khuẩn lạc trung bình đĩa 75 Số khuẩn lạc chọn để thử khẳng định 10 Số khuẩn lạc xác định Số khuẩn lạc Staphylococcus aureus = 75×0,60= 45 Chỉ để lại hai số có nghĩa kết cuối cùng: + Nếu số nhỏ 100 làm trịn bội số gần SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang 89 GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh Đồ án tốt nghiệp + Nếu số lớn 100 tận làm trịn bội số 20 gần + Nếu số lớn 100 khơng tận làm trịn bội số 10 gần Nhân giá trị với số đảo thể tích ni cấy với số đảo độ pha loãng tương ứng mẫu thử để có số lượng Staphylococcus aureus 1g 1ml Để ước tính số lượng thấp, lấy giá trị trung bình phép đếm khuẩn lạc điển hình xác định khơng điển hình làm trịn với số ngun lớn liền đem nhân với giá trị nghịch đảo độ pha loãng + Nếu đĩa thạch có 15 khuẩn lạc: 15× ne Staphylococcus - aureus/ml, ne số nghịch đảo thể tích ni cấy (ne = 1/TTNC) + Ước tính số lượng thấp: m × ne Staphylococcus aureus/ml Trong m: số lượng trung bình khuẩn lạc xác định Ví dụ minh họa: Thể tích ni cấy (TTNC): 0.1ml Độ pha lượng thử: 10-2 Số khuẩn lạc điển hình đĩa: 65 85 Số khuẩn lạc khơng điển hình: Trên đĩa 65 khuẩn lạc: Cả khuẩn lạc chọn xác định có phản ứng đơng huyết tương dương tính, - số Staphylococcus aureus 65 (100%) Trên đĩa 85 khuẩn lạc: khuẩn lạc chọn xác định có phản ứng đơng huyết tương dương - tính (60%), số khuẩn lạc coi Staphylococcus aureus = 85×60 = 51 Số đếm trung bình hai đĩa = Staphylococcus aureus Số đếm tổng cộng (khuẩn lạc điển hình khơng điển hình) = 58+0 = 58 Làm trịn 58 đến bội số gần 60 Như vậy: số lượng Staphylococcus aureus 1g 1ml là:  Xác định Streptococcus faecalist (Phương pháp thử theo TCVN 3351/2001/QĐ-BYT) SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang 90 GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh - Đồ án tốt nghiệp Nguyên tắc: Liên cầu phân Streptococcus faecalist (S.faecalist) phát triển môi trường có Natri azit 0,04% tạo thành khuẩn lạc màu đỏ nâu đỏ Chọn khuẩn lạc điển hình, xác - - định tính chất sinh vật hóa học theo thường qui Chuẩn bị môi trường: + Canh thang Natri azit (Thạch Slanetz Bartley) + Canh thang azit etyl màu tía + Nước pepton 1% Cách tiến hành: (Phương pháp cấy đếm đĩa thạch) + Đồng pha loãng mẫu: Hút 50ml thực phẩm lỏng cho vào bình nón chứa sẵn 450ml dung dịch đệm pepton Lắc 2-3 phút, thu mẫu thử 10-1, tiếp tục pha loãng để thu dung dịch mẫu thử đậm độ 10-2, 10-3, 10-4,…tiến hành tiếp tục tiến hành phương pháp xác định vi khuẩn hiếu khí + Phương pháp sử dụng mơi trường thạch TTC natri azit, tiến hành giống cấy đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, ủ ấm 37ºC 24 giờ, khuẩn lạc điển hình lồi, nhỏ, bờ đều, mặt nhẵn, màu đỏ nâu đỏ + Trích biệt khuẩn lạc điển hình, cấy chuyển canh thang azit etyl, ủ ấm 44-45ºC 24 Streptococcus faecalist phát triển làm đục môi trường chuyển màu - môi trường sang đỏ Đọc kết quả: + Số lượng Streptococcus faecalist 1g 1ml thực phẩm biểu thị trung bình cộng tổng số khuẩn lạc có đĩa thạch nồng độ pha loãng nhân - với hệ số pha lỗng Ví dụ: Độ pha lỗng 10-2 - Đĩa thạch ống nghiệm có 10 khuẩn lạc - Đĩa thạch ống nghiệm có 14 khuẩn lạc - Số khuẩn lạc có 1g 1ml thực phẩm tính: (khuẩn lạc) Như vậy: Trong 1g 1ml thực phẩm có 1,2×102 vi khuẩn S faecalist  Xác định Salmonella Nguyên tắc: Salmonella có mặt thực phẩm với số lượng ỏi thường có mặt số đáng kể vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) khác Trong thực phẩm đun nấu, ướp lạnh sấy khơ Salmonella cịn tồn Bởi phương pháp phát làm cho số lượng nhỏ Salmonella có hội phát triển mơi trường lỏng không lựa chọn 37ºC để làm giàu trước Một môi trường nhiệt độ SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang 91 GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh Đồ án tốt nghiệp cho phép vi khuẩn khác phát triển, nuôi cấy làm giàu trước môi trường lỏng chọn lọc ủ ấm 42-43ºC, lần cuối cấy lên môi trường đặc chọn lọc phân biệt sau ấm 37ºC kiểm tra có mặt khuẩn lạc có đặc điểm khả nghi Salmonella Những khuẩn sau kiểm tra đặc điểm sinh hóa huyết học - - lồi Salmonella spp Chuẩn bị mơi trường: + Thạch BS (Bismuth sulphite agar) + Thạch BG (Brilliant-green/phenol red agar) + Nước pepton đệm + Thuốc thử β-galactosidase + Môi trường indol thuốc thử + Môi trường LDC (Lysine decarboxylation) + Thạch dinh dưỡng + Dung dịch nước muối + Canh thang SC (Selenite cystine broth) + Thạch dinh dưỡng mềm + Môi trường tetrathionate + Thạch TSI (Triple sugar iron agar) + Thạch ure + Môi trường V.P (Voges-Proskauer medium) Cách tiến hành: + Đồng mẫu thực phẩm + Làm giàu vi khuẩn trước (Pre-enrichment): • Chuyển 10ml thực phẩm đồng (25g mẫu khuấy với 225ml nước • pepton) vào bình 500ml Ủ ấm 37±1ºC 16-20 + Làm giàu vi khuẩn (Enrichment): • Chuyển 10ml bình làm giàu trước vào 100ml môi trường tetrathionate 10ml khác vào 100ml mơi trường seleite làm ấm tới 42- • 43ºC Ủ ấm 42-43ºC 48 + Ria đĩa: • Sau 18-24 giờ, từ bình làm giàu ria lên cặp đĩa petri; môi trường thạch brilliant green phenol red thạch bismuth sulphite SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang 92 GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh • • • - Đồ án tốt nghiệp Ủ ấm 37±1ºC 20-24 24 sau lặp lại Kiểm tra khuẩn lạc Salmonella đĩa môi trường ria cấy 24 48 để tìm khuẩn lạc Salmonella điển hình Đọc kết quả:  Xác định sinh hóa: + Chọn khuẩn lạc điển hình nghi ngờ từ đĩa môi trường ria lên đĩa thạch dinh dưỡng Ủ ấm 37ºC 20-24 + Từ khuẩn lạc biệt lập môi trường dinh dưỡng cấy lên mơi trường sau: • Thạch TSI: ria lên mặt thạch nghiêng chọc sâu tới đáy ống, ủ ấm 37ºC • 24-48 Giải thích đổi màu sau:  Đáy: Vàng Lên men glucose Đỏ không đổi màu Glucose không lên men Đen Sinh H2S Có bóng vỡ thạch Sinh từ glucose  Mặt nghiêng: Vàng Lactose sucrose lên men Đỏ không đổi Lactose, sucrose không lên men Thạch ure: ria lên mặt thạch, ủ ấm 37ºC 24-48 Màu hồng phản • ứng dương tính Mơi trường LDC: cấy phía mặt mơi trường lỏng, ủ ấm 37ºC • 24 Màu đỏ tía sau mọc phản ứng dương tính Thuốc thử β-galactosidase: lấy quai khuẩn lạc cấy vào ống nghiệm có 0,25ml nước muối Thêm giọt toluene Để ống nghiệm chậu nước ấm 37ºC lúc, cho thêm 0,25ml thuốc thử β-galactosidase trộn Lại để • ống nước ấm 37ºC 24 Màu vàng phản ứng dương tính Mơi trường VP: lấy quai cấy khuẩn lạc vào hai ống nghiệm đựng 0,2ml môi trường Ủ ấm ống nhiệt độ phòng ống lại 37ºC 48 Cho thêm vào ống hai giọt dung dịch creatinine, giọt dung dịch ethanolic naphthol giọt KOH Lắc cho thêm thứ thuốc thử, đọc kết vòng 15 phút Màu hồng tới đỏ tươi phản ứng dương tính SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang 93 GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh • Đồ án tốt nghiệp Mơi trường indole: cấy khuẩn lạc vào môi trường indole ủ ấm 37ºC 24 Cho thêm 1ml thuốc thử indole Vịng đỏ hình thành phản ứng dương + Khuẩn lạc Salmonella điển hình • Thạch Brilliant green: khuẩn lạc không màu, màu hồng tới màu đỏ fuchsin suốt tới đục, chung quanh khuẩn lạc môi trường hồng tới đỏ Một số Salmonella xuất khuẩn lạc màu lục suốt bao quanh vi khuẩn lên men lactose glucose gây vùng màu vàng xanh xanh, 1% Salmonella khơng điển hình, chúng lên men đường lactose xuất • khuẩn lạc vàng lục lục Thạch Bismuth sulphite: khuẩn lạc nâu, đen, đôi lúc ánh kim, chung quanh nâu chuyển sang đen tăng thời gian ủ ấm Một số chủng sinh khuẩn lạc màu lục sẫm màu không mơi trường xung quanh + Phản ứng sinh hóa Salmonella • Thạch TSI:  Đáy: Vàng +(100%) Đen +(91,6%) Bóng nứt thạch +(91,9%)  Mặt nghiêng: Đỏ không đổi - (99,2%) Thạch ure không đổi màu - (100%) Lysine decarboxylase màu đỏ tía +(94,6%) Phản ứng β-galactosidase không đổi màu - (98,5%) Phản ứng VP không đổi màu - (100%) Test indole, nâu vàng - (98,9%)  Xác định phản ứng huyết thanh: Kiểm tra khuẩn lạc không tự ngưng kết khiết diện kháng nguyên O H cách ngưng kết phiến kính với huyết đơn giá đa giá Để xác định kháng nguyên H, cấy lên hộp lồng thạch dinh dưỡng mềm kiểm tra với kháng nguyên H sau ủ ấm 37ºC±1ºC 18-24  Xác định Clostridium perfringens SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang 94 GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh - Đồ án tốt nghiệp Nguyên tắc: Phương pháp dựa vào đếm Clostridium perfringens sử dụng kỹ thuật đỗ đĩa môi trường chọn lọc SPS (sulphite polymixin sulphadiazin) Clostridium perfringens khử sulphite thành sulphide, chất phản ứng với sắt mơi trường hình thành tủa sắt đen làm cho khuẩn lạc Clostrdium xuất màu đen Những khuẩn lạc làm test xác nhận Kháng sinh ức - - chế khuẩn kị khí kị khí tùy tiện Chuẩn bị mơi trường: + Mơi trường làm giàu, thịt băm + Môi trường thioglycolate lỏng + Môi trường nitrate di động + Nước peptone để pha loãng + Canh thang sinh nha bào + Thạch SPS (Sulphite polymixin sulfadiazin agar) + Thuốc nhuộm Gram Cách tiến hành: + Đồng mẫu thực phẩm + Pha loãng + Ni cấy • Lấy 1ml thực phẩm đồng pha loãng cho vào đĩa petri đánh dấu, độ pha • lỗng dùng hai đĩa Rót 15-20ml thạch SPS vào đĩa, đảo đĩa cho thạch trộn với mẫu thực • • phẩm mơi trường đơng lại Ủ ấm: lật úp đĩa đe bình kỵ khí Ủ ấm bình 35-37ºC 24 Đếm khuẩn lạc (nghi Clostridium perfringens): chọn đĩa có 30-300 khuẩn lạc, đếm số khuẩn lạc đếm số lượng gam thực phẩm - Đọc kết quả: + Chọn 10 khuẩn lạc điển hình đĩa mơi trường SPS cấy khuẩn lạc vào ống canh thang Thioglycollate vừa làm khí làm nguội + Ủ ấm 35ºC 18-24 + Xét nghiệm ống nhuộm Gram chọn canh khuẩn khiết Trực khuẩn Gram (+) mập, hai đầu tù + Nếu canh khuẩn khiết cấy vào ống môi trường nitrate di động, canh thang sinh nha bào thịt băm Ủ ấm 35ºC 24 + Môi trường nitrate di động vi khuẩn mọc dọc theo đường cấy ( Cl.perfringens không di động) khử nnitrate cách cho thêm 0,5ml dung dịch α-naphthylamine SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang 95 GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh Đồ án tốt nghiệp lượng tương tự acide sulphanilic (Cl.perfringens hoàn nguyên nitrate, nghĩa xuất màu da cam vòng 15 phút) + Xét nghiệm canh thang nha bào: Lấy cặn phết kính để khơ, hơ lửa để cố định Nhuộm malachite green 10 phút Rửa nước, nhuộm safranin 15 giây, rửa, thấm, để khơ soi kính Nha bào nhuộm màu xanh cây, tế bào sinh dưỡng bắt màu đỏ + Tính số Cl.perfringens mẫu dựa vào tỷ lệ phần trăm khuẩn lạc làm test, xác nhận Cl.perfringens Ví dụ: Số khuẩn lạc đếm 10-4 độ pha loãng = 85g 10 khuẩn lạc xác nhận Cl.perfringens Số Cl.perfringens gam thực phẩm = 85×0,8×10.000 = 680.000 = 6,8×105 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH • Hình ảnh thực tế địa bàn khảo sát Tại phường Phương Sơn: • Tại phường Phương Sài: SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang 96 GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh • Tại phường Vĩnh Hiệp • Tại phường Ngọc Hiệp SVTH: Đào Thị Minh Hương Đồ án tốt nghiệp Trang 97 GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh Đồ án tốt nghiệp Hình ảnh số kí sinh trùng vài loài nấm độc Một số loài nấm độc SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang 98 GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh Đồ án tốt nghiệp Nấm Amanita phalloidet Nấm Amanita muscaria Nấm Giromitra Một số lồi kí sinh trùng Sán phổi SVTH: Đào Thị Minh Hương Sán gan Trang 99 GVHD: Ths Nguyễn Anh Trinh Đồ án tốt nghiệp Sán dây lợn hay bò SVTH: Đào Thị Minh Hương Trang 100 ... thực phẩm bao gói sẵn kinh doanh thực phẩm ăn ngay” Biểu mẫu điều tra thức ăn đường phố cục An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm năm 2010 1.2 Các điều kiện đảm bảo an toàn thực phẩm kinh doanh thức ăn đường. .. biến kinh doanh thức ăn đường phố + Trình độ học vấn chủ sở kinh doanh thức ăn đường phố + Giới tính chủ sở kinh doanh thức ăn đường phố + Mặt hàng kinh doanh sở thức ăn đường phố + Điều kiện. .. toàn thực phẩm, mỹ quan đường phố 1.2.2 Điều kiện bảo đảm an toàn thực phẩm nguyên liệu, dụng cụ ăn uống, chứa đựng thực phẩm người kinh doanh thức ăn đường phố Nguyên liệu để chế biến thức ăn đường