NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA HỢP CHẤT KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG HỌ THẠCH TÙNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN NGỌC CHƯƠNG NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA HỢP CHẤT KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG HỌ THẠCH TÙNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP HỒ CHÍ MINH, năm 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN NGỌC CHƯƠNG NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA HỢP CHẤT KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG HỌ THẠCH TÙNG Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 62720410 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS TRẦN CÔNG LUẬN TS TRẦN MẠNH HÙNG TP HỒ CHÍ MINH, năm 2020 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa công bố nơi Tác giả luận án i MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC SƠ ĐỒ viii DANH MỤC BIỂU ĐỒ viii MỞ ĐẦU .1 Chương TỔNG QUAN .3 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.3 CÁC PHƯƠNG CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ PHÁP PHÂN TÍCH HUPERZIN A .18 1.4 THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU 20 1.5 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE 22 1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM VỀ TRÍ NHỚ 23 1.7 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HỌ THẠCH TÙNG 25 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 2.1 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 27 2.2 QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU 27 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .28 2.3 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .29 2.4 CỠ MẪU 29 2.5 XÁC ĐỊNH CÁC BIẾN SỐ 30 2.6 DUNG MƠI - HĨA CHẤT - TRANG THIẾT BỊ 30 2.7 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 51 3.1 KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC .51 3.2 TÁC DỤNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA CÁC LOÀI THẠCH TÙNG 58 3.3 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 61 3.4 THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU 82 ii 3.5 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HUPERZIN A TRONG DƯỢC LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP CZE VÀ HPLC 88 3.6 NGHIÊN CỨU IN VIVO TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ CỦA THẠCH TÙNG NGHIÊN 104 Chương BÀN LUẬN .106 4.1 VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC 106 4.2 VỀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA CÁC LOÀI THẠCH TÙNG 110 4.3 VỀ MẶT HÓA HỌC 112 4.4 VỀ MẶT THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU 119 4.5 VỀ MẶT XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HUPERZIN A TRONG DƯỢC LIỆU .121 4.6 VỀ MẶT THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC 125 KẾT LUẬN .129 KIẾN NGHỊ 132 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AChE Acetylcholinesterase AD Alzheimer's Disease BuChE Butylcholinesterase CC Column Chromatography COSY Correlation Spectroscopy DCM Dicloromethan Bệnh Alzheimer's Sắc ký cột DĐVN Dược điển Việt Nam DEPT Distortionless Enhancement Polarization Transfer DTNB 5,5ʹ-dithio-bis-nitro benzoic EtOAc Ethyl acetat FDA by Cơ quan quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ Food and Drug Administration HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPLC High Pressure Liquid Chromatography Sắc ký lỏng cao áp HRMS High Resolution Mass Spectrometry Khối phổ phân giải cao HSQC Heteronuclear Correlation IC Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế IR Infrared Hồng ngoại MS Mass Spectrometry Khối phổ NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân Multiple Quantum Sắc ký lớp mỏng SKLM UV PCRS Ultraviolet Tử ngoại Primary Chemical Reference Standard Chất đối chiếu hóa học sơ cấp SCRS Secondary Chemical Reference Standard Chất đối chiếu hóa học thứ cấp LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 29 Bảng 2.2 Thành phần mẫu thử nghiệm theo phương pháp Ellman 32 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khác chi họ Thạch tùng 55 Bảng 3.2 Kết xác định độ ẩm cao chiết MeOH hiệu suất chiết dược liệu 58 Bảng 3.3 Kết tác động ức chế AChE mẫu thử nghiệm .59 Bảng 3.4 Kết phân tích sơ thành phần hoá thực vật .61 Bảng 3.5 Kết so sánh quy trình phân lập alcaloid 62 Bảng 3.6 Các phân đoạn cột Diaion HP-20 .64 Bảng 3.7 Các phân đoạn cột sắc ký MeOH 100 % 65 Bảng 3.8 Dữ liệu phổ 1H, 113C DEPT hợp chất 66 Bảng 3.9 Dữ liệu phổ 1H, 113C DEPT hợp chất 68 Bảng 3.10 Dữ liệu phổ 1H, 113C DEPT hợp chất 70 Bảng 3.11 Dữ liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất 72 Bảng 3.12 So sánh kết PP1, PP2, PP3 73 Bảng 3.13 Dữ liệu phổ NMR hợp chất 77 Bảng 3.14 Dữ liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất 78 Bảng 3.15 Kết tác động ức chế AChE hợp chất phân lập 80 Bảng 3.16 Các phân đoạn cột R-1 .81 Bảng 3.17 Các phân đoạn cột R-2 .81 Bảng 3.18 Kết khảo sát hàm ẩm nhiệt độ nóng chảy, độ tinh khiết 82 Bảng 3.19 Bảng tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết sắc ký huperzin A 83 Bảng 3.20 Kết xác định độ tinh khiết sắc ký (%) nguyên liệu thiết lập CĐC 84 Bảng 3.21 Kết phân tích phương sai yếu tố theo ANOVA 87 Bảng 3.22 Kiểm tra tính phù hợp hệ thống kết xác định hàm lượng huperzin A phịng thí nghiệm (n = 6) .87 Bảng 3.23 Xác định giá trị công bố 87 Bảng 3.24 Kết kiểm tra tính phù hợp hệ thống mẫu chuẩn .92 Bảng 3.25 Kết kiểm tra tính phù hợp hệ thống mẫu thử 92 v Bảng 3.26 Kết độ lặp lại phương pháp định lượng huperzin A Thạch tùng 93 Bảng 3.27 Tương quan nồng độ tỉ lệ diện tích đỉnh chuẩn hóa huperzin A 94 Bảng 3.28 Kết khảo sát độ phương pháp định lượng huperzin A .95 Bảng 3.29 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu chuẩn huperzin A 97 Bảng 3.30 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp định lượng huperzin A Râu rồng 98 Bảng 3.31 Kết tính toán hàm lượng huperzin A Râu rồng .99 Bảng 3.32 Tương quan nồng độ diện tích đỉnh huperzin A 99 Bảng 3.33 Kết khảo sát độ phương pháp định lượng 100 Bảng 3.34 Kết xác định hàm lượng huperzin A 10 loài họ Thạch tùng 103 Bảng 4.1 Các hệ thống phân loại họ Thạch tùng 107 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc bốn nhóm Lycopodium alcaloid .8 Hình 1.2 Cấu trúc số hợp chất alcaloid khung lycodin Hình 1.3 Cấu trúc số hợp chất alcaloid khung lycopodin Hình 1.4 Cấu trúc số hợp chất alcaloid khung fawcettimin Hình 1.5 Cấu trúc số Lycopodium alcaloid Thạch tùng .10 Hình 1.6 Cấu trúc số acid phenolic phân lập từ loài Lycopodium clavatum 11 Hình 1.7 Cấu trúc số terpenoid phân lập từ loài Lycopodium japonicum 11 Hình 1.8 Cấu trúc số flavonoid chi Lycopodium 12 Hình 1.9 Cấu trúc số alcaloid Thạch tùng nghiên 14 Hình 1.10 Cấu trúc huperzin A 15 Hình 3.1 Các lồi Thạch tùng nghiên cứu .54 Hình 3.2 So sánh đặc điểm vi phẫu rễ loài thuộc chi họ Thạch tùng 56 Hình 3.3 So sánh đặc điểm vi phẫu thân loài thuộc chi họ Thạch tùng 57 Hình 3.4 So sánh đặc điểm vi phẫu loài thuộc chi họ Thạch tùng 58 Hình 3.5 Sắc ký đồ dịch chiết alcaloid từ quy trình quy trình 62 Hình 3.6 Sắc ký đồ phân đoạn MeOH 100 % 64 Hình 3.7 Cơng thức cấu tạo huperzin A 67 Hình 3.8 Cơng thức cấu tạo số hợp chất khung cấu trúc Phlegmariurin B 68 Hình 3.9 Cơng thức cấu tạo hợp chất (Lycosquarosin A) 69 Hình 3.10 Các tương tác xa hợp chất (lycosquarosin A) .69 Hình 3.11 Cơng thức cấu tạo acetylaposerratinin .71 Hình 3.12 Cơng thức cấu tạo huperzinin 72 Hình 3.13 Sắc ký đồ phân đoạn alcaloid 75 Hình 3.14 Sắc ký đồ phân đoạn cột Diaion .75 Hình 3.15 Cơng thức cấu tạo lycocernuin 76 Hình 3.16 Khung cấu trúc dihydrobenzofuran neolignan glycosid 79 Hình 3.17 Cấu trúc hóa học tương tác lycocernuasid A .80 Hình 3.18 Sắc ký đồ phân đoạn cột R-1 81 vii Hình 3.19 Sắc ký đồ HPLC chất chuẩn huperzin A 83 Hình 3.20 Điện di đồ mẫu thử khảo sát dung dịch đệm 88 Hình 3.21 Điện di đồ mẫu thử khảo sát nồng độ dung dịch đệm 88 Hình 3.22 Khảo sát nồng độ đệm đến (a) độ phân giải, (b) thời gian dịch chuyển, (c) thời gian xuất hiện pic chuẩn nội 89 Hình 3.23 Điện di đồ mẫu thử khảo sát ảnh hưởng pH 89 Hình 3.24 Khảo sát pH theo độ phân giải (a) theo cường độ dịng (b) .90 Hình 3.25 Điện di đồ mẫu thử khảo sát điện .90 Hình 3.26 Khảo sát điện theo (a) độ phân giải, (b) thời gian dịch chuyển 90 Hình 3.27 Diện di đồ mẫu thử khảo sát phương pháp chiết 91 Hình 3.28 Điện di đồ mẫu thử chiết huperzin A Thạch tùng MeOH lần thứ .91 Hình 3.29 Phổ UV huperzin A mẫu thử mẫu chuẩn 92 Hình 3.30 Điện di đồ mẫu trắng (a), chuẩn (b), thử (c), thử thêm chuẩn (d) 93 Hình 3.31 Đồ thị tương quan nồng độ tỉ lệ diện tích đỉnh chuẩn hóa huperzin A 94 Hình 3.32 Sắc ký đồ mẫu thử mẫu chuẩn khảo sát pha động MeOH - acid phosphoric 0,1 % (18:82) 96 Hình 3.33 Sắc ký đồcủa mẫu thử khảo sát dung môi chiết 96 Hình 3.34 Sắc ký đồ dịch chiết MeOH lần thứ mẫu thử 97 Hình 3.35 Sắc ký đồ mẫu thử mẫu chuẩn khảo sát tính chọn lọc 98 Hình 3.36 Đồ thị tương quan nồng độ diện tích pic huperzin A 99 Hình 3.37 Sắc ký đồ mẫu thử Huperzia phlegmaria .101 Hình 3.38 Sắc ký đồ mẫu thử Huperzia carinata 101 Hình 3.39 Sắc ký đồ mẫu thử Huperzia fordii 101 Hình 3.40 Sắc ký đồ mẫu thử Huperzia tetrasticha 102 Hình 3.41 Sắc ký đồ mẫu thử Huperzia serrata 102 Hình 3.42 Sắc ký đồ mẫu thử Lycopodium complanatum .102 Hình 3.43 Sắc ký đồ mẫu thử Lycopodium clavatum 102 Hình 3.44 Sắc ký đồ mẫu thử Lycopodium casuarinoides 103 Hình 3.45 Sắc ký đồ mẫu thử Lycopodiella cernua 103 Hình 4.1 Cơng thức cấu tạo huperzin A huperzinin 115 Hình 4.2 Cơng thức cấu tạo lycosquarosin A acetylaposerratinin .117 PL 79 Phụ lục 79 Phổ HMBC -NMR (CD OD, 500 MHz) hợp chất PL 80 Phụ lục 80 Phổ UV hợp chất M23 PL 81 80 %T 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 0.0 1250.0 Nr 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Pos (1/cm) 410.8 437.8 462.9 478.3 520.7 559.3 609.5 630.7 661.5 719.4 758 777.3 796.5 840.9 877.6 912.3 939.3 997.1 1037.6 1068.5 1082 1097.4 1122.5 1176.5 1188.1 1209.3 Inten (%T) 51 52.32 52.88 43.73 18.95 46.94 39.21 36.95 11.09 43.11 54.88 31.91 53.47 13.14 31.82 21.18 10.95 40.07 44.2 54.23 51.53 32.28 48.11 42.86 54.45 50.18 Nr 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 1000.0 Pos (1/cm) 1228.6 1242.1 1280.6 1309.6 1325 1352 1379 1406 1421.4 1456.2 1548.7 1612.4 1651 2351.1 2516.9 2823.6 2854.5 2885.3 2906.5 2964.4 3112.9 3178.5 3261.4 3340.5 3481.3 Phụ lục 81 Phổ IR hợp chất M23 750.0 500.0 Inten (%T) 46.53 31.94 58.61 42.8 43.02 28.58 36.22 21.71 16.28 4.1 11.98 1.68 0.08 66.67 53.37 17.23 15.77 9.55 8.52 14.38 28.49 20.41 20.21 11.24 10.7 PL 82 Phụ lục 82 Phổ HRMS hợp chất M23 PL 83 Phụ lục 83 Phổ 13 C – NMR hợp chất M23 PL 84 Phụ lục 84 Phổ H – NMR hợp chất M23 PL 85 Phụ lục 85 Phổ DEPT - NMR hợp chất M23 PL 86 Phụ lục 86 Phổ COSY – NMR hợp chất M23 PL 87 Phụ lục 87 Phổ HSQC hợp chất M23 PL 88 Phụ lục 88 Phổ HMBC–NMR hợp chất M23 PL 89 UV365 UV254 TT Dragendorff Phụ lục 89.1 Hình SKĐ trình phân lập hợp chất từ phân đoạn Phụ lục 89 Hình SKĐ phân đoạn trình sắc ký phân đoạn Phụ lục 89.3 Hình SKĐ phân đoạn sắc ký phân lập hợp chất từ phân đoạn 8.8 PL 90 Phụ lục 90 Bảng số liệu khảo sát độ lặp lại phương pháp HPLC chất đối chiếu PL 91 \ Phụ lục 91 Hình SKĐ khảo sát độ lặp lại phương pháp HPLC chất đối chiếu PL 92 Huperzin A 230 nm Imidazol 310 nm Phụ lục 92 Điện di đồ mẫu Thạch tùng bước sóng 230 nm 310 nm PL 93 Lycosquarosin A (Hợp chất 2) huperzin A (Hợp chất 1) 16 15 14 H 10 Acetylaposerratinin (Hợp chất 3) H N O 12 13 11 N H N O Huperzinin (Hợp chất 4) H H 16 H N 15 14 13 12 10 11 OH Lycocernuin (Hợp chất 5) Lycocernuasid A (Hợp chất 6) Phụ lục 93 Bảng tổng hợp hợp chất phân lập ... vật học luận án nghiên cứu so sánh thực vật học 10 loài thuộc chi họ Thạch tùng luận án khơng có trùng lắp với nghiên cứu khác Tình hình nghiên cứu họ Thạch tùng nước nước phong phú Mỗi nhóm nghiên. .. thu loài Thạch tùng So sánh tác dụng kháng AChE loài họ Thạch tùng Từ kết sàng lọc, chọn đối tượng dược liệu để nghiên cứu phân lập hợp chất tự nhiên Nghiên cứu hóa học: Chiết xuất phân lập hợp. .. mục tiêu sau: Nghiên cứu so sánh đặc điểm thực vật học số loài thuộc họ Thạch tùng (Lycopodiaceae) Thử nghiệm in vitro sàng lọc tác dụng kháng acetylcholinesterase cao chiết số loài Thạch tùng